薛 靜 崔益瑋 沈 清 鄭振霄 戴志遠,*

(1浙江工商大學海洋食品研究院，浙江 杭州 310012；2浙江省水產(chǎn)品加工技術研究聯(lián)合重點實驗室，浙江 杭州 310012)

磷脂是細胞膜的重要組成部分，承擔了重要的生理功能[1]，在食品、化妝品及醫(yī)藥領域具有廣泛的應用。以二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid, EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid, DHA)為代表的Omega-3長鏈多不飽和脂肪酸已被證實具有促進視覺系統(tǒng)發(fā)育，提高機體免疫力，改善心臟健康和降低心血管疾病發(fā)病率等功能，甘油酯型和磷脂型是其主要的天然構型[2-4]。研究表明，磷脂型DHA和EPA相此于甘油酯型和乙酯型具有諸多優(yōu)勢，如磷脂在體內(nèi)的吸收率遠高于被動吸收方式的甘油酯和乙酯，且磷脂型DHA和EPA沒有腥味，具有更好的穩(wěn)定性等[5-7]。隨著磷脂型Omega-3脂肪酸受到越來越多的關注，富含EPA/DHA磷脂的制備方法也逐漸成為國內(nèi)外學者研究的熱點。

目前，富含Omega-3脂肪酸的磷脂制備方法主要包括天然提取法[8-9]、微生物發(fā)酵法[10]、酶促轉(zhuǎn)化法[11]和化學合成法[12]等。含有EPA和DHA的天然磷脂主要存在于海產(chǎn)動物的卵和肌肉組織中[13-14]，其產(chǎn)量和純度難以滿足市場的需求。相比于化學合成法，酶促轉(zhuǎn)化法具有選擇性高、條件溫和等特點[15]，更適合用于制備EPA/DHA型結構磷脂。國內(nèi)外學者對此展開了大量的研究[16-19]，如Li等[17]在無溶劑體系中，采用磷脂酶A1催化大豆磷脂與富含EPA、DHA的乙酯型魚油發(fā)生酯交換反應，最大轉(zhuǎn)化率為30.7%；Li等[18]研究了水分添加量、真空處理等不同因素對酶促合成DHA/EPA型磷脂酰膽堿的影響，結果表明水分添加量高于0.5%時，磷脂酶A1的催化活力明顯增強；Marsaoui等[19]研究了不同溶劑體系和添加物對米黑根毛霉(Rhizomucormiehei) 脂肪酶催化大豆卵磷脂與乙酯型EPA和DHA酯交換反應的影響，結果表明隨著反應時間的延長，Mg2+和尿素的添加顯著提高了EPA和DHA的結合率。然而，多數(shù)研究仍以不含EPA和DHA的植物大豆磷脂為合成原料，受限于磷脂酶的專一催化特性，產(chǎn)物磷脂中的DHA/EPA含量仍難以達到較高水平。且大多數(shù)研究僅采用薄層色譜(thin-layer chromatography, TLC)和氣相色譜(gas chromatography，GC)等對產(chǎn)物磷脂進行總脂肪酸含量的測定，難以準確表征磷脂分子結構在酶反應前后發(fā)生的變化。傳統(tǒng)的TLC和正相液相色譜(normal-phase high performance liquid chromatography, NP-HPLC)無法與質(zhì)譜聯(lián)用，親水作用色譜(hydrophilic interaction liquid chromatography, HILIC)是專門分離強極性和親水性化合物的一種方法，具有較好的質(zhì)譜兼容性，親水作用色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(hydrophilic interaction liquid chromatography-mass spectrometry, HILIC-MS)技術亦成為研究磷脂分子結構的有效方法[20]。

本研究以南極磷蝦磷脂為原料，以EPA和DHA總結合率為指標，通過響應面法優(yōu)化富含EPA/DHA型結構磷脂的酶法合成反應參數(shù)，進一步提高結構磷脂中EPA和DHA的含量，并采用GC和HILIC-MS技術對其結構進行表征，以期為探索和豐富酶促合成EPA/DHA型結構磷脂的機理和實踐提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南極磷蝦油，購自遼漁南極磷蝦科技發(fā)展有限公司；磷脂酰膽堿(phosphatidylcholines, PC)，溶血磷脂酰膽堿(lysophosphatidylcholine, LPC)標準品，購自美國Avanti Polar-Lipids；固定化磷脂酶A1，實驗室自制(水分含量1.7%，酶活795 U·g-1)；37種脂肪酸標準品，購自上海安譜實驗科技股份有限公司；乙酯型魚油，購自浙江海力生集團有限公司；磷脂酶A1(Lecitase Ultra)，購自丹麥諾維信公司；乙腈(色譜純)，購自德國Merck公司；乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、乙醚、乙酸、丙酮、三氯甲烷、甲醇、石油醚、無水硫酸鈉等均為分析純，購自國藥集團。

1.2 儀器與設備

4000Q-TRAP三重四級桿質(zhì)譜儀(ESI離子源)，美國Applied Biosystems公司；HPLC高效液相色譜系統(tǒng)，美國Waters公司；7890B氣相色譜儀，美國Agilent公司；Fresco-21G臺式離心機，美國Thermo Fisher公司；Millipore超純水系統(tǒng)，美國Millipore公司；BSD-YX2200恒溫搖床，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 游離脂肪酸的制備 參考張蒙娜等[21]的方法對乙酯型魚油中的EPA和DHA進行富集，并采用Garcia等[22]的方法制備游離脂肪酸，充氮密封，低溫保存待用。經(jīng)測定，游離脂肪酸中EPA相對含量為60.63%，DHA相對含量為24.57%。

1.3.2 南極磷蝦磷脂的提取 采用Folch等[8]的方法提取南極磷蝦總脂，加入一定體積冷丙酮(0℃)，5 000 r·min-1離心10 min，棄上清液，收集沉淀并用大量冷丙酮多次洗滌，取上清液滴于潔凈玻片上，迅速揮干無油跡后，氮吹干，充氮，低溫保存待用。

1.3.3 固定化酶催化合成結構磷脂 稱取1 g南極磷蝦磷脂于50 mL具塞三角燒瓶中，按試驗設計比例加入游離脂肪酸、正己烷和水，充分混勻后加入一定質(zhì)量的固定化磷脂酶A1，充氮密封，置于恒溫空氣搖床，200 r·min-1反應24 h后，過濾去除固定化磷脂酶A1，收集反應液。用正己烷多次淋洗固定化磷脂酶A1，收集淋洗液。將淋洗液與反應液混合，并旋蒸脫溶。

1.3.4 響應面試驗設計

1.3.4.1 單因素試驗 固定正己烷添加量為3 mL，反應時間為24 h，分別研究底物質(zhì)量比(游離脂肪酸:磷脂，m/m)，酶添加量(以反應底物的總質(zhì)量計)，反應溫度以及水分添加量(以反應底物的總質(zhì)量計)4個單因素對磷脂酸解反應的影響。具體操作如下：(1)固定底物質(zhì)量比為4，酶添加量為15%，反應溫度為50℃，研究水分添加量(0.25%、0.50%、0.75%、1.00%、1.25%、1.50%)對磷脂酸解反應的影響。(2)固定底物質(zhì)量比為4，水分添加量為1.00%，反應溫度為50℃，研究酶添加量(5%、10%、15%、20%、25%、30%)對磷脂酸解反應的影響。(3)固定水分添加量為1.00%，酶添加量為20%，反應溫度為50℃，研究底物質(zhì)量比A(2、3、4、5、6、7)對磷脂酸解反應的影響。(4)固定底物質(zhì)量比為5，水分添加量為1.00%，酶添加量為20%，研究反應溫度(40、45、50、55、60℃)對磷脂酸解反應的影響。

1.3.4.2 響應面試驗 在單因素試驗的基礎上，依據(jù)Design Expert 8.0軟件中的Box-Behnken設計中心組合試驗，選取底物質(zhì)量比A(游離脂肪酸∶磷脂，m/m)、反應溫度B和水分添加量C(以反應底物總質(zhì)量計)3個因素為自變量，以DHA和EPA的總結合率為響應值，進行三因素三水平的中心組合試驗，以確定富含EPA/DHA型結構磷脂最佳酶反應參數(shù)。響應面因素及水平見表1。

表1 響應面因素與水平表Table 1 Levels and factors of response surface methodology (RSM)

1.3.5 反應產(chǎn)物的TLC檢測 參考Zhao等[23]的方法對反應產(chǎn)物進行TLC檢測，并做適當修改。取100 mg脫溶后的反應產(chǎn)物溶解于1 mL三氯甲烷中，毛細管點樣于TLC硅膠板上，以三氯甲烷∶甲醇∶乙酸∶水(75∶40∶8∶3，v/v/v/v)為展開液，碘蒸氣顯色。

1.3.6 GC測定脂肪酸組成 將TLC硅膠板上對應的結構磷脂條帶刮下，并加入5 mL 0.5 mol·L-1氫氧化鉀-甲醇溶液，于65℃水浴30 min，冷卻后加入2 mL 14%三氟化硼-甲醇溶液，于65℃水浴5 min，超聲提取10 min后加入2 mL正己烷，振搖后用2 mL飽和氯化鈉淋洗上層，取上層用無水硫酸鈉脫水，過濾待測。

GC條件：HP-88毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm，0.20 μm)；升溫程序：初溫70℃保持1 min，以4℃·min-1升至180℃，保持5 min；再以3℃·min-1升至230℃，保持5 min，進樣口溫度250℃，分流比30∶1，進樣量1 μL，載氣流速1 mL·min-1。采用峰面積歸一化法分析各脂肪酸組分的相對含量。每組樣品重復測試3次。

1.3.7 HILIC-MS測定磷脂結構 最優(yōu)條件下反應結束后，取一定量脫溶后的反應混合物，采用氯仿-甲醇溶液(2∶1，v/v)進行稀釋，以0.2 μm有機濾膜過濾后靜置用于質(zhì)譜分析。

液相條件：色譜柱：Cosmosil HILIC色譜柱(4.6 mm×250 mm，2.5 μm)；流動相A：超純水(20 mmol·L-1甲酸銨，18 mmol·L-1甲酸)；流動相B：乙腈(18 mmol·L-1甲酸)。梯度洗脫程序[24]：0 min(95% B)，3 min(95% B)，18 min(70% B)，23 min(50% B)，28 min(50% B)，29 min(95% B)，32 min(95% B)。流量0.6 mL·min-1；進樣量2 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源ESI負離子模式；離子源電壓(IS)4.5 kV；毛細管溫度500℃；氣簾氣(CUR)25 psi；霧化氣(GS1)24 psi；輔助氣(GS2)30 psi；掃描范圍400～1 000 m/z[25]。采用峰面積歸一化法分析各磷脂分子種組分的相對含量。每組樣品重復測試3次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Analyst Software v1.6.3軟件進行數(shù)據(jù)采集，采用Lipid View 1.2進行磷脂分子種鑒定，采用Excel 2010和Origin 8.0軟件進行數(shù)據(jù)分析和圖表制作。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果與分析

2.1.1 水分添加量對磷脂酸解反應的影響 由圖1可知，水分添加量為0.25%～1.00%時，EPA/DHA結合率隨著水分添加量的增加而增加，但隨著水分含量的繼續(xù)增加，EPA/DHA結合率逐漸下降。分析原因可能是在較低水分活度下，磷脂酶的構象過于“剛性”而無法發(fā)揮催化活力，而磷脂酶由于兼具水解和酯化的雙重催化活性，當體系中的水分過高時，加速了水解副反應的發(fā)生，從而導致EPA/DHA結合率下降。因此，選定水分添加量為1.00%進行下一步的優(yōu)化。

圖1 水分添加量對磷脂酸解反應的影響Fig.1 Effect of water addition on the acidolysis reaction

圖2 酶添加量對磷脂酸解反應的影響Fig.2 Effect of enzyme loading on the acidolysis reaction

2.1.2 固定化酶添加量對磷脂酸解反應的影響 由圖2可知，隨著酶添加量的增加，EPA/DHA結合率整體呈上升趨勢，當酶添加量超過20%時，EPA/DHA結合率的增幅減緩，這與Zhao等[23]的研究結果基本一致。分析原因，可能是由于酶促反應的速度取決于酶和底物生成的中間復合物的濃度，隨著磷脂酶含量的逐漸增加，其活性基團不斷增多，中間物濃度不斷增加，酶促反應加速；而由于受底物濃度限制，中間復合物達到飽和后，酶促反應趨于平衡，繼續(xù)增加酶添加量，反應速率變化不大。從酶的利用角度出發(fā)，選擇固定酶添加量為20%進行后續(xù)優(yōu)化。

2.1.3 底物質(zhì)量比對磷脂酸解反應的影響 由圖3可知，隨著底物質(zhì)量比中游離脂肪酸含量的增加，DHA/EPA結合率呈先上升后緩慢下降的趨勢。這可能是由于隨著酶促反應的進行，原料磷脂sn-1位上的非目標脂肪酸鏈被替換下來，導致底物中的EPA和DHA被逐漸稀釋，目標脂肪酸鏈與磷脂的接觸率降低，不利于反應的進行，因此適當增大游離脂肪酸的比例有助于提高目標脂肪酸鏈與磷脂的接觸率。但隨著游離脂肪酸含量的繼續(xù)增加，底物濃度已趨于飽和，一方面，底物黏度的增大阻礙了酶與底物之間的充分接觸，另一方面，游離脂肪酸中殘存的水分增加了體系中的水分含量，從而致使結合率不增反減。因此，選擇底物質(zhì)量比為5進行后續(xù)優(yōu)化試驗。

圖3 底物質(zhì)量比對磷脂酸解反應的影響Fig.3 Effect of substrate mass ratio on the acidolysis reaction

2.1.4 反應溫度對磷脂酸解反應的影響 由圖4可知，隨著反應溫度的升高，EPA/DHA結合率呈先增加后減小的趨勢。分析原因可能是，在較低溫度下，磷脂酶A1的水解活性高于酯化活性，催化反應更趨向于朝著水解的方向進行；隨著反應溫度的升高，酶催化酯化的活性增強，反應體系黏度降低，底物與酶的接觸更加充分，從而促進了EPA/DHA和磷脂的結合。當反應溫度超過酶的最適溫度時，酶的活性將受到抑制，甚至喪失活性，從而表現(xiàn)為DHA/EPA結合率降低。Garcia等[22]研究認為固定化磷脂酶A1在50～60℃之間可催化獲得最高轉(zhuǎn)化率，這與本研究結果一致。因此，選定55℃為酶催化磷脂酸解反應的最佳反應溫度。

2.2 響應面試驗結果分析

2.2.1 響應面試驗結果 響應面試驗設計及結果見表2。

2.2.2 響應面回歸模型的方差分析 對表2所得結果進行回歸建模分析，并對所得回歸模型做方差分析及顯著性檢驗，結果如表3所示。最終得到回歸方程為：

圖4 反應溫度對磷脂酸解反應的影響Fig.4 Effect of temperature on the acidolysis reaction

表2 響應面試驗設計與結果Table 2 The Box-Behnken design and results

EPA/DHA結合率=63.64+0.79A+0.59B-1.57C-0.30AB-0.53AC+0.025BC-3.15A2-6.05B2-2.57C2。

模型F值為107.28，P值<0.000 1，差異極顯著；模型失擬項F值為2.49，P值為0.199 5>0.05，不顯著；從擬合方程的相關系數(shù)可見，多元二次方程擬合相關系數(shù)高于0.90，擬合的回歸模型可用來預測響應值與反應參數(shù)之間的關系。由表3可知，A、B、C、A2、B2和C2的P值均小于0.05，說明A(底物質(zhì)量比)、B(反應溫度)、C(水分添加量)的主效應顯著，對試驗結果具有顯著影響，其中水分添加量(C)是影響EPA/DHA結合率的最主要因素。

表3 二項式回歸模型方差分析結果Table 3 Model-fitting results and analysis of variance

Note：*indicates significant difference at 0.05 level. **indicates extremely significant difference at 0.01 level.

圖5 底物質(zhì)量比與反應溫度對EPA/DHA結合率影響的響應面圖與等高線圖Fig.5 Response surface and its contour plots for the interactive effect of substrate mass ratio and temperature on the level of incorporation of EPA and DHA

2.2.3 響應面交互作用分析結果 根據(jù)回歸方程繪制響應值EPA/DHA結合率與3個因素的等高線及響應面圖。由圖5可知，當反應溫度和底物質(zhì)量比處于較低水平時，EPA/DHA結合率隨著二者的增加而明顯提高，當繼續(xù)增加至較高水平時，EPA/DHA結合率隨之緩慢下降。結合表3數(shù)據(jù)，A(底物質(zhì)量比)和B(反應溫度)對EPA/DHA結合率具有顯著影響，兩者相比，A(底物質(zhì)量比)對EPA/DHA結合率的影響較大，而兩者的交互作用不顯著。同理，結合圖6～7和表3可知，A(底物質(zhì)量比)和C(水分添加量)之間的交互作用，以及B(反應溫度)和C(水分添加量)之間的交互作用均不顯著。

圖6 反應溫度與水分添加量對EPA/DHA結合率影響的響應面圖與等高線圖Fig.6 Response surface and its contour plots for the interactive effect of temperature and water addition on the level of incorporation of EPA and DHA

圖7 底物質(zhì)量比與水分添加量對EPA/DHA結合率影響的響應面圖與等高線圖Fig.7 Response surface and its contour plots for the interactive effect of substrate mass ratio and water addition on the level of incorporation of EPA and DHA

通過對上述試驗結果的分析，確定回歸模型預測的最佳反應參數(shù)：底物質(zhì)量比5.15，反應溫度55.22℃，水分添加量0.92%，此條件下預測EPA/DHA結合率為63.97%。

2.2.4 驗證試驗結果 為了驗證模型的準確性，在上述最優(yōu)條件下進行3次平行試驗。考慮試驗的可操作性，將反應溫度調(diào)整為55.2℃，試驗結果見表4。試驗組平均值與預測值相對誤差小于1%，說明通過響應面優(yōu)化得到的工藝參數(shù)具有較高的可行性。

表4 響應面模型驗證試驗結果Table 4 The validation test results of the response surface mode /%

2.3 原料磷脂及結構磷脂的結構分析

2.3.1 脂肪酸組成分析 由圖8和表5可知，原料磷脂中含量最高的脂肪酸為EPA，其次為C16：0、DHA和C18：1；結構磷脂中含量最高的脂肪酸為EPA，其次為DHA、C16：0和C18：1。對比磷脂反應前后的脂肪酸組成發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過酸解反應，結構磷脂中的EPA和DHA等高不飽和脂肪酸含量顯著增加，而C14：0、C16：0以及C18：1等飽和脂肪酸和低不飽和脂肪酸含量顯著降低。

注：A：結構磷脂；B：原料磷脂。Note：A: Structured phospholipids. B: Raw phospholipids material.圖8 原料磷脂和結構磷脂氣相色譜圖譜Fig.8 The GC chromatography of structured phospholipids and raw phospholipids material

表5 原料磷脂和結構磷脂主要脂肪酸組成Table 5 The composition of main fatty acids in raw phospholipids material and structured phospholipids

2.3.2 磷脂分子種組成分析 原料磷脂和結構磷脂的PC和LPC質(zhì)譜圖見圖9～10。結果表明，原料磷脂PC組分的m/z多集中在796.9～852.9之間，且m/z 824.7和m/z 850.8等峰豐度較大；LPC組分的m/z多集中在540.7～612.5之間，m/z 540.7和m/z 586.6等峰豐度較大。結構磷脂的PC和LPC組分的m/z分布較原料磷脂發(fā)生明顯偏移，其中，PC組分m/z多集中在808.9～898.8之間，且m/z 870.9和m/z 896.8等峰豐度較大；LPC組分豐度較高的峰為m/z 586.7、m/z 612.7和m/z 526.8。

由LipidView軟件進行定性分析，并通過歸一化法對已鑒定的磷脂分子進行相對含量測定，結果見表6。原料磷脂和結構磷脂中共鑒定出PC分子46種，LPC分子20種。其中，PC組分的C原子總數(shù)為32～44個，雙鍵數(shù)為0～12個；LPC組分的C原子總數(shù)為14～22個，雙鍵數(shù)為0～6個。

原料磷脂的PC亞類中，36：5(16：0/20：5)、38：6 (16：0/22：6&18：1/20：5)和34：1(16：0/18：1)等分子種的相對含量較高，分別占17.57%、12.54%和6.47%；LPC亞類中，16：0(16：0/0：0)、20：5 (20：5/0：0)、18：1 (18：1/0：0)和22：6(22：6/0：0)等分子種的相對含量較高，分別占30.72%、16.68%、11.69%和10.28%。此外，還檢測到40:10(20：5/20：5)、42:11(20：5/22：6)和44:12(22：6/22：6)等接近滿飽和度的PC分子種，但相對含量較低，僅占1.87%、4.43%和1.29%。

注：A：PC組分質(zhì)譜圖；B：LPC組分質(zhì)譜圖。Note: A: Mass spectra of PC. B: Mass spectra of LPC.圖9 原料磷脂質(zhì)譜圖Fig.9 Mass spectra of raw phospholipids material

注：A：PC組分質(zhì)譜圖；B：LPC組分質(zhì)譜圖。Note: A: Mass spectra of PC. B: Mass spectra of LPC.圖10 結構磷脂質(zhì)譜圖Fig.10 Mass spectra of structured phospholipids

表6 原料磷脂和結構磷脂分子種組成分析Table 6 Analysis of molecular species composition of raw phospholipids material and structured phospholipids

表6(續(xù))

表6(續(xù))

結構磷脂的PC亞類中，36：5(16：0/20：5)、38：6 (16：0/22：6&18：1/20：5)和34：1(16：0/18：1)等分子種的相對含量較原料磷脂顯著下降，而40:10(20：5/20：5)和42:11(20：5/22：6)等分子種的相對含量較原料磷脂提高了16.59和8.35個百分點，分別占18.46%和12.78%；LPC亞類中16：0(16：0/0：0)和18：1 (18：1/0：0)等分子種的相對含量較原料磷脂顯著下降，而20：5(20：5/0：0)和22：6(22：6/0：0)分子種的相對含量較原料磷脂提高了17.72和15.71個百分點，分別占34.40%和25.99%。

以脂肪酸單鏈平均長度≥20作為磷脂分子長鏈脂肪酸相對含量的參考，以雙鍵數(shù)≥5和雙鍵數(shù)≥10作為磷脂分子中高不飽和脂肪酸相對含量的參考，對比磷脂反應前后的差異發(fā)現(xiàn)，結構磷脂的PC和LPC組分中脂肪酸單鏈平均長度≥20的分子種的相對含量分別為54.24%和72.64%，較原料磷脂分別提高了33.12和37.28個百分點；結構磷脂的PC組分中雙鍵數(shù)≥5和雙鍵數(shù)≥10的分子種相對含量分別為93.48%和37.65%，較原料磷脂分別升高了24.89和27.53個百分點；結構磷脂的LPC組分中雙鍵數(shù)≥5的分子種相對含量為64.12%，較原料磷脂提高了35.62個百分點；此外，PC/LPC顯著下降，說明經(jīng)酶催化酸解反應，磷脂的組成發(fā)生了顯著變化，磷脂中的部分PC轉(zhuǎn)變?yōu)長PC。

綜上，經(jīng)過酶催化酸解反應后，結構磷脂中脂肪酸鏈的長度和不飽和程度均發(fā)生了顯著變化，其脂肪酸鏈中具有更多的長鏈高不飽和脂肪酸EPA和DHA。

3 討論

3.1 富含EPA/DHA型磷脂酶合成反應條件優(yōu)化

為制備富含EPA/DHA型磷脂，國內(nèi)外學者展開了大量的研究。其中大多數(shù)研究采用不含EPA/DHA的大豆卵磷脂和不同?；w形式的EPA/DHA為反應原料，但由于磷脂酶專一催化的特性，產(chǎn)物磷脂中的EPA/DHA含量難以獲得進一步提升。南極磷蝦是富含天然磷脂的優(yōu)質(zhì)資源[27-28]，具有較高的深度開發(fā)和應用價值。本研究從南極磷蝦油中提取磷脂，經(jīng)測定其EPA和DHA含量分別為25.32%和15.31%，這與孫甜甜等[29]的研究結果基本一致。研究認為，Omega-3多不飽和脂肪酸易結合在磷脂的sn-2位[30]，而sn-1位脂肪酸通常為飽和脂肪酸或低不飽和脂肪酸。利用磷脂酶A1的sn-1位專一催化活性，催化南極磷蝦磷脂sn-1位脂肪酸鏈與EPA/DHA進行交換，并最大程度保留sn-2位EPA/DHA，將成為進一步提高磷脂中EPA/DHA含量的新途徑。

本研究在單因素試驗的基礎上，采用響應面法分析了水分添加量、底物質(zhì)量比和反應溫度與EPA/DHA結合率的關系。結果顯示，3個因素對EPA/DHA結合率均有顯著影響，其中水分添加量對EPA/DHA結合率的影響極顯著。李響[31]研究表明，水分添加量對產(chǎn)物中EPA/DHA結合率、PC、LPC和甘油磷脂酰膽堿(glycerophosphorylcholine, GPC)含量均具有顯著影響，其中水分添加量是影響DHA/EPA結合率和產(chǎn)物組成的最主要因素，最優(yōu)水分添加量為1.28%。Li等[18]采用響應面法優(yōu)化了固定化酶A1催化合成DHA/EPA型磷脂的最優(yōu)反應參數(shù)，得出最佳水分添加量為1.1 wt%。本研究與前人研究基本一致，但水分添加量的最優(yōu)值存在一定差異，這可能是因為大豆卵磷脂和南極磷蝦磷脂原料以及反應體系存在差別。由于南極磷蝦磷脂本身含有一定量的EPA/DHA，適當降低水分添加量可避免磷脂原料中固有的EPA/DHA發(fā)生過度水解，故本試驗確定的最優(yōu)水分添加量較前人報道偏低。水解反應是完成酶催化磷脂酸解反應過程中不可避免的副反應[32]，適當?shù)奶砑铀挚梢源偈沽字猱a(chǎn)生溶血磷脂，而溶血磷脂作為酯交換反應的中間體可以促進酯交換反應的進行[33]。因此，適宜的水分添加量是制備富含EPA/DHA型磷脂的關鍵。

3.2 原料磷脂和結構磷脂的表征

經(jīng)分析，實驗室自制南極磷蝦磷脂的主要成分為PC和LPC(總含量>90%)，還存在少量的磷酯酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine, PE)，這與胡劼等[34]的研究結果一致。因此，本試驗以PC和LPC為主要研究對象。

結合氣相色譜和液相質(zhì)譜試驗數(shù)據(jù)以及前人的研究成果[20,24-26]綜合分析可知，原料磷脂的sn-1位脂肪酸主要為C16:0、C18:1、C14:0、C18:0等，而EPA和DHA等高不飽和脂肪酸主要位于磷脂的sn-2位，由此推測含量較高的PC亞類的結構依次為36：5(16：0/20：5)、38：6(18：1/20：5&16：0/22：6)和34：1 (16：0/18：1)，LPC亞類依次為16：0(16：0/0：0)、20：5(20：5/0：0)、18：1(18：1/0：0)和22：6 (22：6/0：0)。由于磷脂酶A1專一作用于磷脂分子的sn-1位酯鍵，可首先水解PC分子的sn-1位脂肪酸生成sn-2-LPC[35]，并催化后者與高不飽和脂肪酸進行酯化反應，從而提高磷脂中高不飽和脂肪酸的含量。另一方面，sn-2-LPC可經(jīng)?；D(zhuǎn)移作用轉(zhuǎn)換為sn-1-LPC[36]，后者在磷脂酶A1的催化下可進一步水解生成GPC，從而導致磷脂得率以及EPA/DHA含量下降。由于EPA和DHA為脂肪酸鏈長度≥20，雙鍵數(shù)≥5的高不飽和脂肪酸，由此推測原料磷脂在磷脂酶A1催化作用下的理論產(chǎn)物主要為一系列雙鍵數(shù)≥5的PC和LPC分子種，其中亦包含部分雙鍵數(shù)≥10的PC分子種，如40:10(20：5/20：5)、42:11(20：5/22：6)、44:12(22：6/22：6)等。脂肪酸單鏈平均長度≥20可作為磷脂分子長鏈脂肪酸相對含量的參考，而雙鍵數(shù)≥5和雙鍵數(shù)≥10可作為磷脂分子中高不飽和脂肪酸相對含量的參考，以上參數(shù)是判斷酯交換反應效果的有力指標。表6數(shù)據(jù)也說明，在磷脂酶A1的催化作用下，磷脂分子中的中長鏈飽和脂肪酸和低不飽和脂肪酸與反應底物中的長鏈高不飽和脂肪酸發(fā)生了高效的交換。

此外，以PC/LPC作為水解程度的參考，對比磷脂反應前后的差異發(fā)現(xiàn)，結構磷脂的PC/LPC較原料磷脂顯著降低，進一步證實了磷脂水解反應的發(fā)生。這一現(xiàn)象與Kim等[37]和李響[31]的研究結果基本一致。Kim等[37]研究表明，隨著Omega-3多不飽和脂肪酸結合率的提高，PC含量明顯降低。李響[31]采用核磁共振波譜儀對最終產(chǎn)物磷脂的組成進行了分析，結果發(fā)現(xiàn)隨著反應的進行，PC逐漸轉(zhuǎn)化為LPC(57.7%)和GPC(25.8%)。研究表明，LPC的乳化性、滲透性、表面活性等性能均優(yōu)于普通磷脂[38]，其在食品、畜牧、醫(yī)藥等行業(yè)具有重要的開發(fā)利用價值[39-40]。

4 結論

本研究采用響應面法對富含EPA/DHA型結構磷脂的酶法合成反應參數(shù)進行了優(yōu)化，得到最佳反應條件為：底物質(zhì)量比5.15，反應溫度55.22℃，水分添加量0.92%，酶添加量20%，正己烷3 mL，反應時間24 h，所得結構磷脂中EPA/DHA結合率高達64.35%。通過對磷脂反應前后的結構變化進行表征，證實了以sn-2位富含EPA/DHA的磷脂為原料，結合具有sn-1位專一催化活性的磷脂酶A1，制備富含EPA/DHA型磷脂(包括溶血磷脂)具有一定的可行性。本研究為制備富含EPA/DHA型結構磷脂提供了新的思路，但本研究尚未對反應產(chǎn)物的貯藏特性及功能活性等進行驗證，今后將繼續(xù)開展結構磷脂的分離純化技術及功能活性等研究，以制備滿足不同需求的磷脂產(chǎn)品。