陳傳君 金 鷺 林 華 胡 濱,* 韓國(guó)全 陳世界 張 婧 安 微

(1 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625000；2 成都海關(guān)，四川 成都 610000)

肉及肉制品是人類飲食中重要的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)來源。羊肉因具有肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美，富含人體所必需氨基酸、維生素和微量元素而備受消費(fèi)者青睞，歷來被當(dāng)做秋冬御寒和進(jìn)補(bǔ)的重要食品之一[1-2]。同時(shí)，羊肉產(chǎn)品沒有文化和宗教的禁忌，更易被廣大消費(fèi)者所接受[3]。也正因羊肉的這些優(yōu)點(diǎn)及其所具有的商業(yè)價(jià)值，利用鴨肉、豬肉、貂肉、老鼠肉制造假羊肉的現(xiàn)象屢見，假羊肉的泛濫不僅干擾了市場(chǎng)秩序，還嚴(yán)重?fù)p害了養(yǎng)殖戶和消費(fèi)者的利益[4-5]。因此，對(duì)羊肉中其他肉類的快速檢測(cè)研究具有重要的意義。目前，針對(duì)肉種鑒定的方法主要有電子鼻法[6]、紅外光譜法[7]、酶聯(lián)免疫吸附法[8-10]、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)法等，其中實(shí)時(shí)熒光定量PCR法的應(yīng)用最廣泛[11]。DNA的提取效果對(duì)于采用PCR檢測(cè)顯得尤為重要。目前動(dòng)物源性DNA提取方法主要有酚抽提法、異丙醇沉淀法、Tris-EDTA法、改良十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB)法、chelex-100法、鹽析法、異硫氰酸胍(GuSCN)法等[12-13]。但大多數(shù)PCR法是基于不同物種鮮肉樣品的摻假研究，針對(duì)熱加工后肉樣定量摻假研究的報(bào)道較少。而多數(shù)摻假羊肉制品往往已經(jīng)加工為成品，經(jīng)歷了烹調(diào)過程，導(dǎo)致DNA斷裂并遭到破壞，在一定程度上影響了提取基因組DNA的純度和濃度[14-15]。PCR法檢測(cè)的關(guān)鍵在于快速、簡(jiǎn)潔地提取DNA，而篩選出合適的干制羊肉基因組DNA的提取方法才能夠保證羊肉真?zhèn)舞b別的準(zhǔn)確性和靈敏度。因此，本試驗(yàn)將新鮮羊肉進(jìn)行高溫干制處理后，采用傳統(tǒng)酚-氯仿法、動(dòng)物組織基因組磁珠法提取試劑盒(磁珠法)、DNeasy? mericon Food Kit 試劑盒(改良CTAB法)以及DNeasy? Blood & Tissue Kit 試劑盒(離心柱)提取干制羊肉基因組DNA，通過比較分析4種方法提取的羊肉基因組DNA濃度、純度、完整性以及提取所需時(shí)間、PCR擴(kuò)增效果等，探求一種適合于干制羊肉基因組DNA的提取方法，旨在獲得穩(wěn)定、高質(zhì)量的DNA，使產(chǎn)品的進(jìn)一步分析檢測(cè)更加便捷。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 試驗(yàn)材料 羊肉由成都海關(guān)檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心提供，-70℃保存；動(dòng)物組織基因組磁珠法提取試劑盒，由食品安全檢測(cè)四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自制[組織裂解液；磁珠懸浮液：磁珠濃度100 μg·mL-1，液態(tài)介質(zhì)為異丙醇；洗滌液(pH值7.0)：800 mmol·L-1氯化鋰，50 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution, PBS)緩沖液，100 mmol·L-1氯化鈉，70%乙醇；漂洗液：70%乙醇；制備時(shí)間：2017年10月]；DNeasy?mericon?Food Kit試劑盒、Neasy? Blood & Tissue Kit 試劑盒，德國(guó)QIAGEN公司；Tris-飽和酚，索萊寶(北京)生物科技有限公司；蛋白酶K(20 mg·mL-1)， 鄭州拓樣生物有限公司；Premix Ex Taq(Probe qPCR)預(yù)混液，北京TaKaRa公司；組織裂解液[1 mol·L-1三(羥甲基)氨基甲烷-鹽酸、0.5 mol·L-1乙二胺四乙酸、10%十二烷基硫酸鈉、2 mol·L-1氯化鈉]、氯仿-異戊醇(24∶1，v/v)、0.1 mol·L-1醋酸鈉溶液均為自配試劑。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備 ND-1000 Nano Drop核酸蛋白測(cè)定儀、CFX96 Real-time PCR 儀、小型水平電泳槽、ChemiDoc MP多功能凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad公司；MagMax Express自動(dòng)化核酸提取儀、高速冷凍離心機(jī)X3R，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；Eppendorf Thermomixer F恒溫金屬浴，德國(guó)Eppendorf公司；FastPrep-245G勻漿儀，美國(guó)MP Biomedicals生物醫(yī)學(xué)公司。

1.2 樣品的制備

取新鮮羊肉樣品的肌肉組織，用絞肉機(jī)絞碎后于烘箱中烘干至恒重，烘干溫度100℃，每2 h取出放入干燥皿冷卻，0.5 h后稱重并記錄一次，直到前后2次稱重差值不超過2 mg即達(dá)到恒重。將烘干樣品研磨至粉末狀，室溫條件下保存于干燥皿中用于DNA的提取。

1.3 干制羊肉基因組DNA提取

1.3.1 傳統(tǒng)酚-氯仿法 參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)[16]的方法，采用蛋白酶K和苯酚從哺乳動(dòng)物細(xì)胞中提取DNA，將提取的DNA于-20℃保存。

1.3.2 磁珠法

1.3.2.1 自制磁珠法提取DNA 準(zhǔn)確稱取100 mg干制羊肉粉末于2 mL EP管中，加入500 μL PBS緩沖液，勻漿。然后吸取200 μL(相當(dāng)于25 mg樣品)勻漿于2 mL EP管中，再加入200 μL組織裂解液和20 μL蛋白酶K于56℃條件下恒溫孵育1 h，消化完全后取出，期間每隔10 min震蕩一次。后續(xù)操作嚴(yán)格按照動(dòng)物組織基因組磁珠法提取試劑盒操作手冊(cè)進(jìn)行，具體操作步驟如下：將經(jīng)過恒溫孵育的樣品加入300 μL異丙醇渦旋混勻，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照(未添加肉粉末組)；室溫孵育10 min(期間每隔3 min振蕩混勻一次)后加入20 μL磁珠懸浮液，將離心管放置于磁力架上靜置30 s，小心去除液體；將離心管從磁力架上取下，加入500 μL洗滌液，并震蕩混勻；將離心管放置于磁力架上靜置30 s，小心去除液體；將離心管從磁力架上取下，加入500 μL漂洗液，并震蕩混勻；將離心管放置于磁力架上靜置30 s，小心去除液體；重復(fù)上述洗滌步驟一次，盡量將液體去除干凈；將離心管放置于磁力架上室溫晾干10 min后，將離心管從磁力架上取下，加入100 μL ddH2O，渦旋混勻，室溫孵育10 min；將離心管放置于磁力架上靜置30 s，小心將核酸液轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL EP管中，-20℃保存或者立即使用。

1.3.2.2 自制磁珠法提取試劑盒的性能評(píng)價(jià) 1)重復(fù)性。取同一批干制羊肉粉末，由同一試驗(yàn)人員按照自制磁珠法提取試劑盒操作說明提取羊肉基因組DNA，重復(fù)6次，每次3個(gè)平行。用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定并計(jì)算每份樣品DNA的濃度及純度值。按照相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差(relative standard deviation，RSD)不大于5.0%，判定檢測(cè)方法的重復(fù)性。

2)穩(wěn)定性。將試劑盒從2～8℃條件下取出置于25℃復(fù)溫后，提取同一批干制羊肉的基因組DNA，使試劑盒反復(fù)復(fù)溫10次、20次，將每一次提取的DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，計(jì)算RSD值。

3)有效期。將試劑盒于2～8℃條件下保存1年, 期間每隔一個(gè)月用試劑盒提取同一批干制羊肉的基因組DNA，測(cè)定提取DNA的純度及濃度。

1.3.3 改良CTAB法 準(zhǔn)確稱取100 mg干制羊肉粉末于2 mL EP管中，加入800 μL PBS緩沖液，充分勻漿。然后吸取200 μL勻漿，嚴(yán)格按照DNeasy? mericon? Food Kit試劑盒操作手冊(cè)提取DNA，將提取的DNA置于-20℃保存。

1.3.4 離心柱法 準(zhǔn)確稱取100 mg干制羊肉粉末于2 mL EP管中，加入800 μL PBS緩沖液，充分勻漿。然后吸取200 μL勻漿，嚴(yán)格按照DNeasy? Blood & Tissue Kit說明書提取DNA，將提取的DNA置于-20℃保存。

1.4 DNA指標(biāo)測(cè)定

每份DNA樣品取3 μL，用相應(yīng)緩沖液作為空白對(duì)照，采用核酸蛋白儀測(cè)定基因組DNA的濃度(ng·μL-1) 及純度A260/A280值，用于評(píng)價(jià)基因組DNA的質(zhì)量。每份樣品重復(fù)測(cè)定3次，每次3個(gè)平行。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增效果檢測(cè)

1.5.1 引物探針的設(shè)計(jì) 參考任君安[17]的方法，選定羊的生長(zhǎng)激素因子GH(序列號(hào)為NC-000077)作為目的基因，根據(jù)NCBI中公布的不同物種間各基因序列，進(jìn)行序列比對(duì)，選取羊特異性較好的區(qū)域運(yùn)用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Express 3.0設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物及一條Taqman探針，設(shè)計(jì)時(shí)充分考慮引物設(shè)計(jì)的要求。

1.5.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件 為驗(yàn)證不同方法提取的DNA在qPCR中的實(shí)際擴(kuò)增情況，分別將4種方法提取的基因組DNA稀釋至50 ng·μL-1作為擴(kuò)增模板，使用CFX96 Real-time PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)參照優(yōu)化后體系及程序進(jìn)行擴(kuò)增。具體反應(yīng)程序見表1，反應(yīng)體系見表2。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序Table 1 Real-time fluorescence quantitative PCR reaction procedure

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系Table 2 Real-time fluorescence quantitative PCR reaction system

1.6 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

取不同方法提取的DNA樣品各5 μL，采用1%瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳，采用TAE緩沖液，100 V恒壓電泳30 min, 在ChemiDoc MP多功能凝膠成像系統(tǒng)中成像，觀察并記錄結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 核酸蛋白儀測(cè)定4種方法提取的DNA比較

由表3可知，傳統(tǒng)酚-氯仿法、磁珠法和離心柱法提取的羊肉基因組DNA的A260/A280平均值均大于1.80, 說明提取的DNA純度均較好。傳統(tǒng)酚-氯仿法的A260/A280值>1.90，可能有少許RNA污染。改良CTAB法所得DNA濃度平均值最低，且該方法的A260/A280值遠(yuǎn)低于1.80，表明該方法提量最低，且提取的DNA存在較多的雜質(zhì)。

表3 不同提取方法基因組DNA的質(zhì)量參數(shù)Table 3 The quality parameters of different extraction methods about genomic DNA

2.2 引物探針的設(shè)計(jì)

通過NCBI中公布的不同物種間基因序列的比對(duì)，選取了羊特異性較好的區(qū)域，運(yùn)用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Express 3.0設(shè)計(jì)了一對(duì)羊特異性引物和一條探針(表4)。

表4 羊的特異性引物探針Table 4 Specific primers/probes for sheep

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增效果比較

由圖1可知，4種方法提取的羊基因組DNA均有PCR擴(kuò)增曲線，但擴(kuò)增效果有明顯差異。僅從Ct值大小可知，4種方法提取羊基因組DNA的PCR擴(kuò)增效率為磁珠法>傳統(tǒng)酚-氯仿法>離心柱法>改良CTAB法，從核酸蛋白儀測(cè)定的結(jié)果來看，磁珠法與傳統(tǒng)酚-氯仿法所得DNA濃度相差不大，但磁珠法的擴(kuò)增效率更好，說明傳統(tǒng)酚-氯仿提取的DNA中存在抑制PCR擴(kuò)增的物質(zhì)。而離心柱法和改良CTAB法因DNA質(zhì)量濃度相對(duì)較低，導(dǎo)致其擴(kuò)增效率較其他2種方法更低。

圖1 4種方法提取DNA樣品的實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增圖Fig.1 Real-time fluorescence quantitative PCR amplification of DNA samples extracted by four extraction methods

注：M：2 000 bp marker；1：改良CTAB法；2：離心柱法；3：傳統(tǒng)酚-氯仿法；4：磁珠法。Note: M: 2 000 bp marker. 1: Modified CTAB method2: Centrifugal column method. 3: Conventional phenol-chloroform extraction method. 4: Magnetic beads method.圖2 4種方法提取的DNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of DNA extracted by four methods

2.4 羊基因組DNA凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果

由圖2可知，4種方法提取的羊基因組DNA電泳條帶的大小一致，說明4種方法提取的DNA都是完整的、全面且無降解的。泳道3、4的條帶較1、2條帶更加明亮、清晰，泳道1(改良CTAB柱法)的條帶最弱，說明傳統(tǒng)酚-氯仿法和磁珠法提取的基因組DNA濃度比離心柱法和改良CTAB法高。而泳道3有輕微拖尾現(xiàn)象，這是由于傳統(tǒng)酚-氯仿法提取DNA過程中未加入RNA酶，還有少許RNA未去除完全，造成了輕微拖尾的現(xiàn)象。

2.5 自制磁珠法提取試劑盒的性能評(píng)價(jià)

2.5.1 重復(fù)性驗(yàn)證結(jié)果 由表5可知，重復(fù)性驗(yàn)證結(jié)果中A260/A280值的RSD為0.50%，DNA濃度的RSD為3.34%，表明試劑盒的重復(fù)性較好，符合提取試劑盒標(biāo)準(zhǔn)。

表5 自制磁珠法提取試劑盒重復(fù)性驗(yàn)證Table 5 Repeatability verification of self-made magnetic bead extraction kit

2.5.2 穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果 由表6可知，試劑盒經(jīng)反復(fù)復(fù)溫10、20次后仍能提取動(dòng)物基因組DNA，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR定量，試驗(yàn)結(jié)果顯示多次提取樣本的Ct值基本一致，表明試劑盒具有良好的穩(wěn)定性。

表6 自制磁珠法DNA提取試劑盒穩(wěn)定性驗(yàn)證Table 6 Stability verification of self-made magnetic bead DNA extraction kit

2.5.3 有效性檢測(cè)結(jié)果 由表7可知，12個(gè)月中12次提取結(jié)果的RSD均較小，A260/A280值和DNA濃度檢測(cè)結(jié)果的RSD分別為0.74%和4.99%，說明該試劑盒在2～8℃保存條件下，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，至少可保存1年。

表7 自制磁珠法DNA提取試劑盒有效性驗(yàn)證Table 7 Validation of self-made magnetic bead DNA extraction kit

3 討論

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，應(yīng)用PCR技術(shù)在DNA水平上對(duì)肉類及肉制品進(jìn)行摻假檢驗(yàn)備受關(guān)注。DNA的提取是利用PCR技術(shù)鑒定肉類及肉制品是否摻假的第一步，DNA模板的純度和完整性與后續(xù)試驗(yàn)成功與否密切相關(guān)[18]。對(duì)于肉制品來說，加工過程易造成基因組DNA的降解，影響提取基因組DNA的質(zhì)量，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定[19]。Pascoal等[20]證實(shí)經(jīng)加熱和超壓處理后，牛肉的DNA發(fā)生了一定程度的降解。Aslan等[21]通過提取生牛排和煮熟牛排的DNA發(fā)現(xiàn)，將牛肉高溫烹調(diào)會(huì)導(dǎo)致肉質(zhì)量下降，DNA的碎片小于800 bp。因此，篩選適宜的DNA提取方法極為重要。

由于不同的DNA提取方法對(duì)肉制品的提取效果有所不同，本研究通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增效果和凝膠電泳對(duì)4種不同方法提取干制羊肉基因組DNA效果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)不同提取方法得到的DNA濃度、純度均存在較明顯的差異。改良CTAB法和離心柱法提取的DNA濃度和純度較其他2種方法更低，傳統(tǒng)酚-氯仿法和磁珠法提取DNA的效果更好。楊成等[22]采用改良NaCl法、十二烷基苯磺酸鈉法、CTAB法和Tiangen試劑盒法提取豬肉、牛肉、羊肉的DNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CTAB法提取的DNA濃度與純度均低于其他3種方法，這可能與CTAB法提取時(shí)樣品受到小分子物質(zhì)污染有關(guān)，這與本研究結(jié)果較為一致。Chapela等[23]采用CTAB法從同一金槍魚品種的4種不同品牌罐頭中提取DNA，結(jié)果表明CTAB法提取的DNA濃度與純度均相對(duì)較低。曾國(guó)權(quán)等[24]采用離心柱法提取牛肉干中?；蚪MDNA時(shí)證實(shí)，該方法操作簡(jiǎn)單快速，提取的DNA質(zhì)量較高，易進(jìn)行PCR擴(kuò)增，但離心柱法提取得到的DNA質(zhì)量相對(duì)較低，這與本研究結(jié)果也較相似。

傳統(tǒng)酚-氯仿法作為經(jīng)典的DNA提取方法，提取的DNA質(zhì)量能夠滿足分子生物學(xué)試驗(yàn)的基本要求，但耗時(shí)較長(zhǎng)。而且酚和氯仿均有一定的揮發(fā)毒性，長(zhǎng)期使用會(huì)對(duì)使用者和環(huán)境造成危害[25]。Arslan等[26]將牛肉經(jīng)過高溫烹調(diào)處理后，采用酚-氯仿法提取DNA，用PCR擴(kuò)增出271 bp的DNA片段，但試驗(yàn)時(shí)間達(dá)到10 h以上。何建文等[27]在提取牦牛肉產(chǎn)品中基因組DNA時(shí)發(fā)現(xiàn)，酚-氯仿抽提法所提DNA的純度和含量適中，蛋白含量較低，但缺點(diǎn)是試驗(yàn)時(shí)間較長(zhǎng)。磁珠法通過把DNA分離技術(shù)和富集技術(shù)有機(jī)結(jié)合在一起，經(jīng)過簡(jiǎn)單洗脫即可得到純度較高的靶物質(zhì)DNA，其操作步驟少、自動(dòng)化程度高、耗時(shí)短，目前已被廣泛應(yīng)用于DNA的提取[28]。曾國(guó)權(quán)等[24]采用磁珠法提取牛肉干中?；蚪MDNA時(shí)證實(shí)，磁珠法提取不需要加入苯酚等有毒試劑，無乙醇沉淀等步驟，且不需要離心操作，整個(gè)過程僅需1.5 h，操作簡(jiǎn)單快捷，這與本研究結(jié)果較一致。石盼盼等[29]采用OMEGA磁珠組織DNA提取試劑盒提取熟制牛肉干的DNA，發(fā)現(xiàn)提取DNA的純度較高，耗時(shí)較短。沈麗等[30]比較了磁珠核酸提取法與商品化核酸提取試劑盒提取肉制品DNA，證明磁珠核酸提取法具有快速方便、靈敏、安全及可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)。本試驗(yàn)中，自制磁珠法提取試劑盒對(duì)儀器和人員操作要求低，而且配制試劑盒所用試劑均為常規(guī)試劑，較易取得，相較于另外2種商品試劑盒成本較低。目前,QIAGEN的DNeasy? mericon? Food Kit試劑盒提取成本約32元/次，DNeasy? Blood & Tissue Kit 試劑盒提取成本約29.6元/次，而實(shí)驗(yàn)室自制試劑盒僅需要約7.8元/次，市面上國(guó)產(chǎn)的商品化磁珠法DNA提取試劑盒提取成本普遍大于10元/次，進(jìn)口試劑盒更昂貴。因此，本試驗(yàn)自制磁珠法提取試劑盒具有一定的應(yīng)用前景。

4 結(jié)論

從提取DNA的純度、濃度、擴(kuò)增效果以及試驗(yàn)所消耗時(shí)間、成本等方面綜合考慮，本研究認(rèn)為，磁珠法具有較好的穩(wěn)定性和重復(fù)性，更適宜于加工羊肉基因組DNA的大規(guī)模提取與檢測(cè)。