劉浩然 汪俏梅

(浙江大學(xué)園藝系/農(nóng)業(yè)部園藝植物生長發(fā)育與品質(zhì)控制重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310029)

番茄(SolanumlycopersicumL.)不僅是世界范圍內(nèi)重要的蔬菜作物，也是研究果實(shí)發(fā)育和品質(zhì)形成的模式體系。隨著人們消費(fèi)意識(shí)的提高，現(xiàn)在市場對(duì)番茄的要求已從對(duì)產(chǎn)量的單一追求逐漸轉(zhuǎn)變成對(duì)果實(shí)品質(zhì)的高要求。番茄果實(shí)品質(zhì)包括外觀品質(zhì)和營養(yǎng)品質(zhì)等[1-2]。番茄的外觀品質(zhì)包括果型指數(shù)、果色和果實(shí)硬度等；而果實(shí)營養(yǎng)品質(zhì)包括還原糖含量和類胡蘿卜素含量等。其中，番茄果實(shí)還原糖含量直接決定著果實(shí)甜度，研究表明消費(fèi)者更愿意購買具有適當(dāng)甜酸度的番茄果實(shí)[1]。類胡蘿卜素是一類來源于丙酮酸的四十碳的四萜化合物及其氧化衍生物，對(duì)人類健康有重要作用，其組分和含量是番茄果實(shí)營養(yǎng)品質(zhì)的重要構(gòu)成因素[3]。番茄果實(shí)中的類胡蘿卜素包括番茄紅素、β-胡蘿卜素和葉黃素等，其中番茄紅素是成熟番茄果實(shí)中含量最高的類胡蘿卜素[3-7]。在番茄中，類胡蘿卜素不僅是重要的光合色素，也是香氣物質(zhì)和脫落酸(abscisic acid，ABA)合成的前體物質(zhì)[3,8]，類胡蘿卜素代謝物9-順式-新黃質(zhì)通過9-順式環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase，NCED)、短鏈脫氫還原酶(short-chain dehydrogenase/reductase，SDR)、醛氧化酶(abscisic aldehyde oxidase，AAO)和鉬輔因子硫酸酶(molybdenum-cofactor sulfurase，MoCoS)依次生成黃氧素、脫落酸醛等物質(zhì)并最終合成ABA[9-11]。

ABA是一種以異戊二烯為基本結(jié)構(gòu)單位的倍半萜類植物激素[12]，廣泛調(diào)控植物的生長發(fā)育進(jìn)程，如種子萌發(fā)、誘導(dǎo)氣孔開閉和開花等，并在植物的逆境適應(yīng)性中發(fā)揮作用[13-17]。前人通過正向遺傳學(xué)方法篩選到2種番茄ABA生物合成的缺失突變體notabilis(簡稱not)和flacca(簡稱flc)[18]，并通過基因圖譜的方法確定這2個(gè)突變體分別是9-順式環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶(NCED)基因移碼突變的無效突變體[18]和鉬輔因子硫酸化酶(MoCoS)基因6對(duì)堿基缺失的突變體[19]。這2種突變體果實(shí)內(nèi)源ABA含量與野生型相比顯著下降，是研究ABA調(diào)控果實(shí)發(fā)育和品質(zhì)形成的良好材料[20]。由于ABA含量在番茄果實(shí)成熟過程中是動(dòng)態(tài)變化的，而突變體not和flc果實(shí)中ABA含量在果實(shí)成熟過程中一直保持低水平，利用這些突變體可以排除番茄果實(shí)中ABA動(dòng)態(tài)變化的干擾，便于研究ABA對(duì)果實(shí)發(fā)育和品質(zhì)形成等的影響。本研究以這2種ABA缺失突變體及其野生型為材料，結(jié)合ABA外源處理研究ABA對(duì)番茄果實(shí)營養(yǎng)品質(zhì)和外觀品質(zhì)的影響，旨在為ABA在番茄品質(zhì)改良中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試番茄品種為ABA生物合成缺失突變體flc及其野生型RR(Rheinlands Ruhm)、ABA生物合成缺失突變體not及其野生型AC(Ailsa Craig)，均由美國加州大學(xué)DAVIS分校番茄種質(zhì)資源中心提供后留種所得。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2018年1—9月于浙江大學(xué)園藝作物生長發(fā)育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，所有試驗(yàn)所用4個(gè)番茄品種均于2018年1月播種，并于2018年3月定植于浙江大學(xué)華家池校區(qū)?；ㄆ跇?biāo)記，共標(biāo)記3～4穗花，每穗花限制在5朵以下。果實(shí)成熟標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[8]，花后35 d左右全果綠色為綠熟期果實(shí)，花后40 d左右外觀微紅且顯色少于10%為破色期果實(shí)，花后43 d左右呈淡紅色且顯色約70%為轉(zhuǎn)色期果實(shí)，花后50 d左右呈深紅色且顯色為100%為紅熟期。對(duì)破色期、轉(zhuǎn)色期和紅熟期的果實(shí)進(jìn)行單果重、果型指數(shù)、硬度以及可溶性固形物、還原糖和類胡蘿卜素含量的測定。

摘取24個(gè)大小形狀相似綠熟期的AC果實(shí)，均分為對(duì)照組和ABA處理組，每組12個(gè)果實(shí)。對(duì)照組涂抹未加入任何植物激素的羊毛脂，ABA處理組的果實(shí)涂抹終濃度為100 μmol·L-1ABA的羊毛脂。羊毛脂均勻涂抹在果實(shí)表面，處理后放入溫度為23℃，光周期為16 h光照/8 h黑暗的溫室中，并在處理后的第1、第4、第7和第15天取樣進(jìn)行番茄果實(shí)類胡蘿卜素含量的測定。以上樣品的測定指標(biāo)均為完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)為3個(gè)果實(shí)的混合樣品。

1.3 測定項(xiàng)目與方法

1.3.1 單果重、果型指數(shù)和硬度測定 單果重的測定：根據(jù)1.2的標(biāo)準(zhǔn)采摘各成熟期的flc及其野生型RR和not及其野生型AC的番茄果實(shí)，隨機(jī)取3個(gè)，用天平分別測定其單果重。

果形指數(shù)的測定：采用游標(biāo)卡尺分別測量各成熟期的flc及其野生型RR和not及其野生型AC果實(shí)的橫徑和縱徑，果形指數(shù)=縱徑/橫徑，果形指數(shù)>1.00為高圓形果；介于0.85～1.00之間為圓形果；介于0.71～0.85之間為扁圓形果；≤0.70為扁形果。

果實(shí)硬度的測定：于破色期、轉(zhuǎn)色期和紅熟期選取大小均一、無機(jī)械傷的flc及其野生型RR和not及其野生型AC番茄果實(shí)在室溫下使用具有直徑7.5 mm左右塑膠探頭的TA-XT2i質(zhì)構(gòu)儀(Stable Micro Systems Ltd., 英國)在每個(gè)果實(shí)赤道部分均勻測定4個(gè)點(diǎn)，每次試驗(yàn)測定6～9個(gè)果實(shí)，測定深度為10 mm，測定速度為1 mm·s-1。

1.3.2 可溶性固形物和還原糖含量測定 可溶性固形物含量采用WYA-1S/2S阿貝折射儀(上海光學(xué)儀器廠)測定，分別隨機(jī)取破色期、轉(zhuǎn)色期和紅熟期的flc及其野生型RR和not及其野生型AC的果實(shí)各3個(gè)，直接讀取果實(shí)可溶性固形物含量，用百分比表示。還原糖的含量采用二硝基水楊酸法[21]測定。

1.3.3 類胡蘿卜素含量測定 將果實(shí)切成1 cm3的小塊，液氮速凍后用研缽在低溫下磨成果實(shí)粉末。取0.5 g上述果實(shí)粉末于50 mL錫箔紙包裹的離心管中，立即加入30 mL提取液(乙烷∶丙酮∶乙醇=1∶1∶1，體積比)，然后150 r·min-1搖動(dòng)30 min。再向混合物中加入15 mL雙蒸水，4℃、1 500×g離心10 min。上清液過0.22 μm有機(jī)相濾膜，再氮吹濃縮至近乎無液體。加入0.5 mL溶解液(四氫呋喃∶乙腈∶甲醇=3∶10∶11，體積比)3次，所得即為待測樣品。

取20 μL樣品，使用高效液相系統(tǒng)(日本島津)進(jìn)行測定，色譜柱采用C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)。流動(dòng)相為(甲醇∶乙腈=9∶1體積比，同時(shí)加入0.05%三乙胺)，流速為1.2 mL·min-1。檢測波長為475 nm。采用番茄紅素、β-胡蘿卜素和葉黃素的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果以μg·g-1FW為單位表示。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 10.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3次生物學(xué)重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。顯著性分析采用One-way ANOVE進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 ABA生物合成缺失突變體果實(shí)的外觀品質(zhì)性狀

由表1可知，ABA生物合成缺失突變體not和flc在紅熟期的單果重顯著低于各自的野生型，分別減少至野生型單果重的39.72%和55.62%。這說明ABA在果實(shí)增重上起正向作用。在番茄果實(shí)果型上，ABA生物合成缺失突變體not在番茄各發(fā)育時(shí)期的果型指數(shù)均顯著高于其野生型，not為圓形果而其野生型AC為扁圓形果。同時(shí)，flc及其野生型RR雖均為圓形果，但紅熟期flc的果型指數(shù)顯著高于其野生型RR。這表明內(nèi)源ABA缺失會(huì)促進(jìn)番茄果實(shí)縱向生長，并且NCED缺失比MoCoS缺失更能促進(jìn)番茄果實(shí)縱向生長。在果實(shí)硬度方面，ABA生物合成缺失突變體not和flc的果實(shí)硬度在番茄各發(fā)育時(shí)期與野生型相比均無明顯差異。說明內(nèi)源ABA并未影響番茄果實(shí)的軟化進(jìn)程。

表1 不同時(shí)期番茄中ABA缺失突變體及其野生型植株果實(shí)發(fā)育的外觀品質(zhì)性狀Table 1 The fruits visual quality characters of ABA deficient mutants and wild types at different ripening stages

2.2 ABA生物合成缺失突變體果實(shí)的可溶性固形物和還原糖含量

如圖1-A所示，ABA生物合成缺失突變體flc在破色期果實(shí)中可溶性固形物含量顯著高于其野生型AC，增加0.53個(gè)百分點(diǎn)；ABA生物合成缺失突變體not在紅熟期果實(shí)中可溶性固形物含量顯著低于其野生型RR，降低1.01個(gè)百分點(diǎn)。這說明ABA在破色期和紅熟期分別負(fù)調(diào)控和正調(diào)控可溶性固形物的含量。如圖1-B所示，ABA生物合成缺失突變體flc果實(shí)中還原糖含量在破色期和轉(zhuǎn)色期均顯著低于其野生型RR。說明內(nèi)源ABA可促進(jìn)破色期和轉(zhuǎn)色期番茄果實(shí)中還原糖的積累。

注：不同字母表示品種間存在顯著性差異(P<0.05)。下同。Note：Different lowercase letters indicate significant difference among varieties at 0.05 level. The same as following.圖1 ABA生物合成缺失突變體及其野生型不同成熟期果實(shí)的可溶性固形物和還原糖含量Fig.1 The total soluble solids and reduced sugars contents of tomato fruits in ABA deficient mutants and wild types at different ripening stages

2.3 ABA生物合成缺失突變體果實(shí)的類胡蘿卜素含量

如圖2-A所示，在破色期，ABA生物合成缺失突變體not果實(shí)中番茄紅素含量顯著高于其野生型AC，升高了31.23%。并且在紅熟期，突變體not和flc果實(shí)中番茄紅素含量均顯著高于各自的野生型，分別增加了23.62%和43.07%。上述結(jié)果表明內(nèi)源ABA缺失能明顯促進(jìn)果實(shí)番茄紅素積累。如圖2-B所示，ABA生物合成缺失突變體not果實(shí)中β-胡蘿卜素含量在破色期和紅熟期顯著高于其野生型AC，分別增加31.81%和28.37%；但在轉(zhuǎn)色期兩品種差異不顯著。同時(shí)，突變體flc果實(shí)中β-胡蘿卜素含量在轉(zhuǎn)色期和紅熟期均顯著高于其野生型RR，分別增加6.82%和23.07%。表明內(nèi)源ABA缺失能明顯促進(jìn)番茄果實(shí)中β-胡蘿卜素積累。如圖2-C所示，ABA生物合成缺失突變體not果實(shí)中葉黃素含量在轉(zhuǎn)色期和紅熟期顯著高于其野生型AC，分別增加25.01%和14.28%；突變體flc果實(shí)中葉黃素含量在各果實(shí)成熟時(shí)期均顯著高于其野生型RR，在破色期、轉(zhuǎn)色期和紅熟期分別增加了55.55%、110.52%和182.53%。說明內(nèi)源ABA能夠抑制葉黃素的積累。如圖2-D所示，ABA生物合成缺失突變體not和flc果實(shí)中總類胡蘿卜素含量在轉(zhuǎn)色期和紅熟期均顯著高于各自的野生型，說明內(nèi)源ABA顯著抑制了番茄果實(shí)總類胡蘿卜素的積累。綜上可知，內(nèi)源ABA可抑制成熟過程中番茄果實(shí)的番茄紅素、β-胡蘿卜素、葉黃素和總類胡蘿卜素的積累。

圖2 ABA生物合成缺失突變體及其野生型不同成熟期果實(shí)的類胡蘿卜素含量Fig.2 The contents of carotenoids in tomato fruits of abscisic acid biosynthetic deficient mutant and their wild types at different ripening stages

注：不同字母表示處理間存在顯著性差異(P<0.05)。Note：Different lowercase letters indicate significant difference among treatments at 0.05 level.圖3 ABA處理對(duì)番茄果實(shí)中的類胡蘿卜素含量的影響Fig.3 Effects of abscisic acid treatment on the contents of carotenoids in tomato fruits

2.4 ABA處理對(duì)番茄果實(shí)類胡蘿卜素積累的影響

由圖3可知，在番茄果實(shí)采后處理過程中，隨著處理后時(shí)間的延長，番茄紅素、β-胡蘿卜素和總類胡蘿卜素含量呈增加趨勢，而葉黃素含量呈下降趨勢。如圖3-A所示，與對(duì)照組相比，番茄果實(shí)中番茄紅素含量在ABA處理后第7和第15天顯著降低，分別下降了40.13%和32.85%。表明外源ABA能抑制番茄果實(shí)中番茄紅素的合成，這與圖2-A中內(nèi)源ABA缺失促進(jìn)番茄紅素積累的結(jié)果一致。如圖3-B所示，β-胡蘿卜素含量在ABA處理后第4和第7天較對(duì)照組顯著降低，分別下降了61.26%和33.33%，這與圖2-B中內(nèi)源ABA缺失能提高破色期和轉(zhuǎn)色期果實(shí)β-胡蘿卜素含量的現(xiàn)象相吻合；但在處理后第15天，ABA處理組顯著促進(jìn)了β-胡蘿卜素的積累，β-胡蘿卜素含量較對(duì)照組提高了27.51%。表明，外源ABA抑制番茄果實(shí)成熟前期β-胡蘿卜素的積累，但促進(jìn)后期積累。如圖3-C所示，與對(duì)照組相比，葉黃素含量在ABA處理后第1和第15天顯著增加，處理后第7天顯著降低。如圖3-D所示，與對(duì)照組相比，總類胡蘿卜素含量在ABA處理后第4、第7和第15天顯著降低，分別降低33.19%、27.88%和2.69%，圖2-D也表明內(nèi)源ABA抑制番茄果實(shí)總類胡蘿卜素積累。綜上，ABA處理抑制了番茄果實(shí)中番茄紅素、β-胡蘿卜素和總類胡蘿卜素的積累。

3 討論

在外觀品質(zhì)方面，本研究結(jié)果表明內(nèi)源ABA能抑制番茄果實(shí)縱向伸長，這與草莓[22]中的研究結(jié)果一致，說明ABA抑制果實(shí)縱向生長的功能在不同物種之間是保守的。另外，本研究結(jié)果表明內(nèi)源ABA促進(jìn)番茄果實(shí)增重，這與前人關(guān)于ABA不影響桃子單果重的結(jié)論相反[23]。這可能是因?yàn)榍叭瞬捎肁BA直接噴施桃子的葉片而非果實(shí)的方式，說明激活A(yù)BA處理果實(shí)增重效應(yīng)的方式存在組織特異性。此外，前人研究表明鱷梨中ABA含量和果實(shí)硬度呈負(fù)相關(guān)[24]，此效應(yīng)并未在番茄中體現(xiàn)，一方面可能是因?yàn)轺{梨上的研究并未使用ABA相關(guān)突變體，所以這種負(fù)相關(guān)可能不是ABA對(duì)果實(shí)硬度的直接效應(yīng)；另一方面也可能是因?yàn)轺{梨是仁果，番茄是漿果，兩種果實(shí)在組織結(jié)構(gòu)上存在的差異導(dǎo)致硬度對(duì)ABA的響應(yīng)存在較大差異。

在營養(yǎng)品質(zhì)方面，內(nèi)源ABA可促進(jìn)番茄果實(shí)中還原性糖的積累，這與外源ABA促進(jìn)葡萄和桃子果實(shí)中還原糖含量增加的結(jié)果相一致[23,25]，且促進(jìn)桃和葡萄中還原糖積累的ABA處理濃度分別是150 mg·L-1和100 mg·L-1， 即約567.49 μmol·L-1和378.33 μmol·L-1，與本試驗(yàn)采用的100 μmol·L-1濃度屬同一數(shù)量級(jí)，這可能是因?yàn)锳BA促進(jìn)還原糖作用在不同物種的保守性使得處理濃度數(shù)量級(jí)也一致。另外，本研究中ABA處理抑制了番茄類胡蘿卜素積累，這與前人在臍橙中的研究結(jié)果相同[26]，說明ABA抑制果實(shí)類胡蘿卜素積累的作用在不同園藝物種間具有保守性。此外，本研究結(jié)果表明NCED基因缺失能顯著促進(jìn)番茄果實(shí)類胡蘿卜素積累，這與之前的研究結(jié)果相吻合[27]。且研究表明，MoCoS基因缺失也會(huì)顯著促進(jìn)番茄類胡蘿卜素積累，提高番茄果實(shí)影響品質(zhì)。這表明抑制ABA合成代謝途徑關(guān)鍵酶NCED和MoCoS的基因表達(dá)均能提高番茄果實(shí)品質(zhì)特別是類胡蘿卜素含量，暗示利用基因編輯技術(shù)定向缺失基因NCED和MoCoS提高番茄果實(shí)品質(zhì)的巨大潛力。

4 結(jié)論

本研究利用ABA生物合成突變體結(jié)合外源激素處理的方法發(fā)現(xiàn)，植物激素ABA對(duì)番茄果實(shí)典型發(fā)育時(shí)期的外觀品質(zhì)和營養(yǎng)品質(zhì)均有顯著影響。在外觀品質(zhì)方面，ABA可促進(jìn)番茄果實(shí)增重并抑制果實(shí)的縱向生長，但對(duì)番茄果實(shí)硬度無顯著影響。在營養(yǎng)品質(zhì)方面，ABA影響了番茄果實(shí)可溶性固形物含量，并促進(jìn)了還原糖積累，同時(shí)ABA還抑制了番茄果實(shí)中番茄紅素、β-胡蘿卜素和總類胡蘿卜素的積累。綜上可知，ABA在調(diào)控番茄果實(shí)外觀品質(zhì)方面，可促進(jìn)番茄果實(shí)增重并抑制番茄果實(shí)縱向生長；在調(diào)控番茄果實(shí)營養(yǎng)品質(zhì)方面，可促進(jìn)還原糖積累并抑制類胡蘿卜素積累。本研究為利用番茄ABA相關(guān)突變體和ABA處理改善番茄品質(zhì)提供了理論基礎(chǔ)。