高麗麗，章宜芬，錢金林，蘇紅丹，李林秋，李 青

免疫組化染色技術(shù)是一種多步驟、多因素決定的實(shí)驗(yàn)方法，染色過程中存在很多干擾因素[1]。組織如何保存是形態(tài)學(xué)研究的主要問題。生物樣本若冷凍或低溫儲存，可保存多年。用固定液浸泡標(biāo)本是病理實(shí)驗(yàn)室最常用的組織保存方法，組織固定后，石蠟包埋也可保存多年。包埋后的石蠟組織通常在行免疫組化染色前1～2天切片。實(shí)際工作中有時(shí)因組織太小不易再次切片；或者病理、科研工作中用的組織對照片會提前切片，存放太久的切片對組織抗原的影響尚未可知。有學(xué)者建議不要使用存放太久的切片進(jìn)行染色，但是“太久”的定義并不明確。最近研究發(fā)現(xiàn)[2]，室溫下保存組織切片，ER和PR表達(dá)強(qiáng)度均明顯降低。本實(shí)驗(yàn)用4種抗體在室溫、4 ℃、-20 ℃條件下對保存2～6個(gè)月的未染色切片進(jìn)行免疫組化檢測，比較組織切片保存溫度及時(shí)間對免疫組化染色結(jié)果的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 一般材料羊膜卷組織(包含乳腺癌和闌尾組織)連續(xù)切片180張，羊膜卷組織的制作參考文獻(xiàn)[3]。

1.2 方法對180張組織切片進(jìn)行編號(常溫1～60號，4 ℃ 1～60號，-20 ℃ 1～60號)，分為三組，并按不同溫度保存，每2個(gè)月分別抽取三組切片進(jìn)行Ki-67、CKpan、GATA-3、desmin免疫組化染色。免疫組化染色均在Dako Link48全自動免疫組化儀上操作。

1.3 結(jié)果判定所有切片均經(jīng)資深病理醫(yī)師進(jìn)行閱片，每張切片在高倍鏡(40×)下觀察10個(gè)不同視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞。Ki-67、GATA-3定位于細(xì)胞核，CKpan、desmin定位于細(xì)胞質(zhì)。Ki-67陽性判定標(biāo)準(zhǔn)參照2018年《美國臨床腫瘤學(xué)會/美國病理學(xué)家協(xié)會乳腺癌激素受體免疫組織化學(xué)檢測指南》。Ki-67以≤20%為低表達(dá)，>20%為高表達(dá)[4]。GATA-3、CKpan和desmin染色計(jì)分：(1)按陽性細(xì)胞數(shù)所占百分比計(jì)分：陽性細(xì)胞數(shù)0～10%為0分、11%～25%為1分、26%～50%為2分、51%～75%為3分、76%～100%為4分。(2)按染色強(qiáng)度計(jì)分：無著色為0分、淺棕黃色為1分、棕黃色為2分、深棕黃色為3分。將兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘：0～4分為低表達(dá)，6～12分為高表達(dá)[5]。

2 結(jié)果

2.1 切片的免疫組化染色把提前切取的組織片按組別分別在新鮮組織和保存2、4和6個(gè)月后組織進(jìn)行4種抗體的免疫組化染色(圖1)。染色結(jié)果顯示：Ki-67、GATA-3和desmin在室溫和4 ℃保存均在6個(gè)月后出現(xiàn)染色強(qiáng)度降低的現(xiàn)象，-20 ℃保存條件下染色強(qiáng)度一致；CKpan在4 ℃保存6個(gè)月后出現(xiàn)染色強(qiáng)度降低的現(xiàn)象，在室溫和-20 ℃保存條件下染色均一致。

圖1 乳腺癌組織中Ki-67的免疫組化染色，EnVision法：A.室溫保存6個(gè)月后的切片染色；B.-4 ℃保存6個(gè)月后的切片染色；C.-20 ℃保存6個(gè)月后的切片染色；D.新鮮切片染色

2.2 Ki-67、CKpan、GATA-3、desmin抗體的染色分類Ki-67：常溫和4 ℃保存6個(gè)月后的切片表達(dá)強(qiáng)度均由之前的8分降為4分。GATA-3：常溫和4 ℃保存6個(gè)月后的切片表達(dá)強(qiáng)度均由之前的12分降為6分。desmin：常溫和4 ℃保存6個(gè)月后的切片表達(dá)強(qiáng)度由之前的9分降為6分，而-20 ℃保存6個(gè)月后的切片表達(dá)強(qiáng)度與之前一致。CKpan：4 ℃保存6個(gè)月后的切片表達(dá)強(qiáng)度由之前的12分降為8分，常溫和-20 ℃保存6個(gè)月后的切片表達(dá)強(qiáng)度與之前一致(表1)。

表1 Ki-67、CKpan、GATA-3、desmin抗體的表達(dá)強(qiáng)度比較

3 討論

有研究[6]發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織切片保存12周后其中p53免疫反應(yīng)活性明顯下降，認(rèn)為抗原和組織的保存條件可能是免疫染色結(jié)果改變的潛在原因。林興滔等[2]也比較過ER、PR和HER-2在切片保存2年后組織抗原反應(yīng)活性的變化。本組實(shí)驗(yàn)增加了時(shí)間梯度，切片保存2、4、6個(gè)月后對病理科常用的4種抗體進(jìn)行檢測，因?yàn)樵谂R床病理工作中這4種抗體在判斷腫瘤來源和細(xì)胞增殖活性方面使用頻率較高。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，切片保存的時(shí)間和溫度會導(dǎo)致組織抗原丟失，影響免疫組化染色結(jié)果，導(dǎo)致假陰性現(xiàn)象。對于核表達(dá)(如Ki-67和GATA-3)的抗體更易發(fā)生抗原丟失，4 ℃和常溫保存6個(gè)月后的切片出現(xiàn)明顯的染色強(qiáng)度降低。胞質(zhì)表達(dá)的抗體(desmin)也較易受時(shí)間和溫度的影響。但是CKpan 4 ℃保存比常溫保存更易發(fā)生抗原丟失，推測可能與CKpan蛋白表達(dá)模式或者組織內(nèi)源性/外源性水分相關(guān)。Xie等[7]研究發(fā)現(xiàn)環(huán)境中濕度也會影響抗原的保存，室溫下的干燥貯藏條件優(yōu)于冷藏條件下的潮濕貯藏條件。因此，本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為低溫干燥的環(huán)境有利于切片抗原的保存。

抗原反應(yīng)活性降低常發(fā)生在石蠟切片上，并未發(fā)生(或在一個(gè)非常低的水平)在組織蠟塊中。提示切片暴露于空氣中可能與抗原改變有關(guān)。唐錦玲等[8]報(bào)道石蠟組織塊保存時(shí)間對細(xì)胞質(zhì)表達(dá)定位抗原的影響輕微。

用于病理診斷的免疫組化染色通常在保存1～2天的新鮮切片上進(jìn)行。然而，對于會診病例或科研工作，抗原改變可能是一個(gè)真正的問題。通常情況下，病理科會診切片一般是外借組織切片，尤其國外會診，切片郵寄時(shí)間過久，如p53，僅保存幾周就可能引起抗原的改變[6]。因此我們應(yīng)重視切片保存對免疫組化染色的影響。

當(dāng)無法避免使用長期保存的切片時(shí)，作者建議實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)首先證明抗原反應(yīng)活性是否有效，即長期保存的切片與最近切片染色結(jié)果是否一致。其次，探究組織切片抗原最佳保存條件。

由于本實(shí)驗(yàn)樣本量少，僅檢測了保存6個(gè)月內(nèi)的切片，后續(xù)需增加樣本量，繼續(xù)觀察；抗原反應(yīng)活性還可能取決于組織類型或者抗原的氧化，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中可增加組織類型或者密閉保存減少切片在空氣中的暴露，進(jìn)一步分析原因；另外應(yīng)考慮水分對抗原活性的影響。總之，要提高免疫組化染色技術(shù)，不但要注意標(biāo)本的固定、切片、染色等環(huán)節(jié)的規(guī)范操作，而且還要在實(shí)際工作中不斷摸索，完善免疫組化技術(shù)，只有這樣才能更好地解決實(shí)際工作中的問題，為病理診斷提供有力的技術(shù)保障。