高洪彬，梁 十，郭揚(yáng)清，吳玉娥，賈歡歡，劉 嬋，王希龍，陳梅麗

免疫熒光檢測(cè)技術(shù)具有專一性強(qiáng)、靈敏度高、實(shí)用性好等優(yōu)點(diǎn)[1]，為病理檢測(cè)中一項(xiàng)重要的輔助技術(shù)。HE染色是常規(guī)的病理學(xué)檢測(cè)方法，有時(shí)HE染色下病變的確診或進(jìn)一步研究需要進(jìn)行免疫熒光染色輔助，此時(shí)往往會(huì)選擇重切蠟塊，但重切的切片與HE觀察不是同一張組織片、需要觀察的位置或多或少的發(fā)生了改變，不利于與原HE切片進(jìn)行精準(zhǔn)的比較分析，更甚者有些組織塊小、重切片未能切出組織切片進(jìn)行免疫熒光染色。因此，探討一種HE切片褪色后進(jìn)行免疫熒光染色的方法具有重要的應(yīng)用價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)實(shí)踐，摸索了一些簡(jiǎn)便有效的HE切片染色褪色后進(jìn)行免疫熒光染色的方法并進(jìn)行比較分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)環(huán)境(普通級(jí))食物蟹猴3只，由廣東春盛生物公司提供[SCXK(粵)2014-0027]，所有涉及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)動(dòng)物關(guān)懷與使用倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。動(dòng)物飼養(yǎng)場(chǎng)所按照國(guó)際實(shí)驗(yàn)動(dòng)物評(píng)估和認(rèn)證管理委員會(huì)的規(guī)定和要求，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行日常的飼養(yǎng)關(guān)懷和管理。

1.2 儀器與試劑采用的儀器包括Leica TP1020自動(dòng)脫水機(jī)，Leica EG1150H+C石蠟包埋機(jī)，Leica RM2255全自動(dòng)輪轉(zhuǎn)切片機(jī)、Leica ST5020+SV5030全自動(dòng)染色封片一體機(jī)，Leica DM3000正置熒光顯微鏡。

采用的試劑有1%鹽酸乙醇分化液(褪色劑)、胰島素抗原(Gene Tex公司)、PBS緩沖液(博士德生物公司)、胰蛋白酶(南京建成生物工程研究所)、免疫染色封閉液(碧云天生物公司)、熒光二抗(Invitrogen Life Technologies公司)、二甲苯(天津市百世化工公司)、無(wú)水乙醇(廣州中南化學(xué)有限公司)、95%乙醇(廣州凱秀貿(mào)易有限公司)、1%醇溶性伊紅(廣州凱秀貿(mào)易有限公司)、Harris蘇木精(廣州凱秀貿(mào)易有限公司)、TO透明劑(廣州市中南化工儀器有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1分組 選取3只血糖正常的食蟹猴胰腺常規(guī)脫水包埋后的蠟塊標(biāo)本，連續(xù)切片后用多聚賴氨酸防脫玻片撈片，分為4組，每組3張，即：空白切片高壓修復(fù)免疫熒光組(A組)，空白切片胰蛋白酶修復(fù)免疫熒光組(B組)，HE切片褪色后高壓修復(fù)免疫熒光組(C組)，HE切片褪色后胰蛋白酶修復(fù)免疫熒光組(D組)。

1.3.2HE染色 使用未進(jìn)行染色的空白切片烤片，然后在二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中分別浸泡20 min進(jìn)行脫蠟，梯度乙醇脫水至純水，每個(gè)步驟7 min。Harris蘇木精染色10 min，蘇木精染色結(jié)束后再置于自來(lái)水中浸洗1 min，然后進(jìn)行1%鹽酸乙醇分化5 s，再轉(zhuǎn)移到自來(lái)水中返藍(lán)15 min。 待返藍(lán)結(jié)束后轉(zhuǎn)移到90%乙醇浸泡7 min，然后進(jìn)行1%醇溶性伊紅染色30 s，在伊紅染色后轉(zhuǎn)移到95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ以及95%乙醇Ⅲ中分別浸泡10 s，然后分別轉(zhuǎn)移到無(wú)水乙醇Ⅰ、無(wú)水乙醇Ⅱ中脫水各5 min，最后在TO透明劑Ⅰ、TO透明劑Ⅱ中分別浸泡7 min，封片。

1.3.3免疫熒光染色 A組：使用未進(jìn)行染色的空白切片烤片，脫蠟，梯度乙醇水化后PBS沖洗3次、每次5 min，高壓修復(fù)(高壓鍋噴氣后5 min停止加熱，待自然冷卻至室溫)，PBS沖洗3次、每次5 min，熒光封閉液封閉1 h，一抗孵育(4 ℃冰箱過(guò)夜)，復(fù)溫(37 ℃ 60 min)，PBS沖洗3次、每次5 min，二抗孵育(37 ℃ 60 min)，PBS沖洗3次、每次5 min，晾干，封固。B組：與A組比較，抗原使用1.25%胰蛋白酶修復(fù)(37 ℃ 30 min)，不使用高壓修復(fù)，其余與A組方法步驟相同。C組：使用進(jìn)行過(guò)HE染色的切片二甲苯浸泡，去除蓋玻片和中性樹(shù)膠，梯度乙醇水化褪色，放入用75%乙醇配制的1%鹽酸乙醇分化液中浸泡1 min，待晾干后，再放入1%的鹽酸乙醇分化液中1 min，反復(fù)數(shù)次直至顏色完全褪去，然后用自來(lái)水緩慢沖洗。接著使用PBS沖洗3次、每次5 min，進(jìn)行高壓修復(fù)等與A組相同的步驟和方法進(jìn)行免疫熒光染色。D組：與C組比較，抗原使用1.25%胰蛋白酶修復(fù)(37 ℃ 30 min)，不使用高壓修復(fù)，其余步驟與C組方法相同。

1.3.4病理組織學(xué)觀察 使用顯微鏡進(jìn)行組織學(xué)觀察。C、D組在HE褪色前進(jìn)行鏡下觀察和拍照，不同組不同動(dòng)物的免疫熒光染色切片使用同一熒光強(qiáng)度和倍數(shù)觀察、拍照。

2 結(jié)果

HE染色鏡下觀察，見(jiàn)胰島大小不一、散在分布，胰島細(xì)胞呈團(tuán)索狀分布，胞質(zhì)淡染。各組胰島中均可見(jiàn)INS陽(yáng)性熒光表達(dá)的胰島β細(xì)胞。A、C組切片可見(jiàn)部分組織破碎、脫落，B、D組切片未見(jiàn)破碎、脫落。各組各區(qū)域綜合比較，陽(yáng)性細(xì)胞明亮、清晰，各組間抗原表達(dá)強(qiáng)度、染色效果未見(jiàn)明顯差異(圖1～4)。

圖1 HE切片褪色后高壓修復(fù)免疫熒光組：可見(jiàn)胰島中β細(xì)胞呈強(qiáng)陽(yáng)性，細(xì)胞明亮、清晰 圖2 HE切片褪色后胰蛋白酶修復(fù)免疫熒光組：可見(jiàn)胰島中β細(xì)胞呈強(qiáng)陽(yáng)性，細(xì)胞明亮、清晰 圖3 空白切片高壓修復(fù)免疫熒光組：可見(jiàn)胰島中β細(xì)胞呈強(qiáng)陽(yáng)性，細(xì)胞明亮、清晰 圖4 空白切片胰蛋白酶修復(fù)免疫熒光組：可見(jiàn)胰島中β細(xì)胞呈強(qiáng)陽(yáng)性，細(xì)胞明亮、清晰

3 討論

HE染色是組織病理學(xué)檢查的常規(guī)檢查方法[2]，石蠟切片在行HE常規(guī)染色步驟包括有機(jī)溶劑脫蠟、梯度乙醇水化、蘇木精染色、1%鹽酸乙醇分化、伊紅染色、梯度乙醇脫水、有機(jī)溶劑透明、封固等[3]，操作過(guò)程在常溫下進(jìn)行，整個(gè)HE染色過(guò)程未接觸破壞抗原的溶劑及實(shí)驗(yàn)條件，抗原得到較好的保存。常用的樹(shù)脂等封片劑由于溶于有機(jī)溶劑二甲苯[4]，經(jīng)二甲苯充分的浸泡可除去蓋玻片并去除組織上附著的封片劑。1%鹽酸乙醇分化液的浸泡可對(duì)蘇木精染色的組織細(xì)胞進(jìn)行褪色[5]，有研究報(bào)道HE切片經(jīng)過(guò)數(shù)次浸泡可進(jìn)行褪色[6]，提示其對(duì)伊紅也有褪色作用，本實(shí)驗(yàn)使用1%鹽酸乙醇分化液對(duì)HE染色的切片有較好的褪色效果，鏡下未見(jiàn)組織細(xì)胞的蘇木精或伊紅著色。

本實(shí)驗(yàn)觀察到完成褪色的標(biāo)本，按常規(guī)方法和程序進(jìn)行免疫熒光染色即可得到較理想效果。同一抗原修復(fù)方法下的比較顯示，HE褪色后進(jìn)行染色的切片與空白片直接染色的切片比較，抗原表達(dá)強(qiáng)度相當(dāng)，提示HE染色及褪色后INS抗原保存得較好。有研究表明酶消化能較好的修復(fù)抗原[7-8]，本實(shí)驗(yàn)顯示，對(duì)于INS抗原，使用高壓和胰蛋白酶修復(fù)均取得較佳染色效果，但胰蛋白酶消化的切片組織塊不易發(fā)生破碎、脫落，較好的保留了待觀察組織的完整性。