吳雪芳，李 霜，胡建軍，楊迎春，龍艷麗，王 劍，易 韋

結直腸癌是一種常見的惡性腫瘤，其發(fā)生是一個多基因、多因素、多階段參與的過程，涉及癌基因(K-RAS等)的激活和抑癌基因(TP53、APC等)的失活。K-RAS基因突變是結直腸癌形成過程中常見的基因改變，是結直腸癌發(fā)生、發(fā)展過程中的重要啟動和促進因素[1]。TP53基因是癌癥發(fā)生、發(fā)展的關鍵基因，其在人類癌癥中突變率最高。近年有學者發(fā)現(xiàn)p53蛋白表達與TP53基因狀態(tài)有顯著相關性[2]。免疫組化檢測相對基因檢測費用低、耗時短、效果佳，因此，臨床上常用免疫組化法檢測p53蛋白表達來反應TP53基因突變狀態(tài)。K-RAS和TP53基因作為結直腸癌的兩種主要突變基因，迄今為止這些基因改變的臨床意義仍有爭議，兩者在結直腸癌發(fā)生過程中的關系尚不清楚。目前關于結直腸癌組織中K-RAS基因突變狀態(tài)與p53蛋白表達之間關系的研究尚未得到廣泛開展和報道。本實驗初步探討了結直腸癌組織中K-RAS基因突變狀態(tài)和p53蛋白表達及其與臨床病理特征的關系，以及兩者表達的相關性及與結直腸癌患者預后的關系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料選取2014年12月～2019年4月貴州省人民醫(yī)院手術切除并經(jīng)病理確診的82例結直腸癌石蠟標本，其中男性54例，女性28例，年齡32～89歲，中位年齡59歲。患者術前均未行放、化療及生物治療。所有標本均經(jīng)兩位病理醫(yī)師分別診斷并行組織學分化程度評估，其中包括高分化10例，中分化54例，低分化18例。根據(jù)AJCC第七版指南進行臨床分期：Ⅰ期2例，Ⅱ期10例，Ⅲ期33例，Ⅳ期37例。

1.2 主要試劑石蠟包埋組織核酸提取試劑盒和人類K-RAS基因突變檢測試劑盒(熒光PCR法)均購自福建廈門艾德生物公司。免疫組化所用濃縮型鼠抗人p53單克隆抗體(克隆號DO-7)、SP染色試劑盒及DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物公司。

1.3 方法

1.3.1基因檢測 將10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋的結直腸癌手術切除標本組織5 μm厚連續(xù)切片，每例組織切3～5張，保證腫瘤細胞含量>60%。根據(jù)艾德核酸提取試劑盒說明書提取石蠟切片中的DNA。采用Nanodrop 2000測定DNA濃度，OD260/OD280應介于1.8～2.0之間。根據(jù)艾德人類K-RAS基因突變檢測試劑盒(熒光PCR法)檢測K-RAS基因突變情況。

1.3.2免疫組化 免疫組化染色采用SP法，操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行，p53抗體(稀釋度1 ∶100)孵育前經(jīng)抗原高壓熱修復，用已知陽性的癌組織作為陽性對照，PBS代替一抗作為空白對照。

1.4 結果判讀所有病理切片均由兩位資深病理診斷醫(yī)師判讀。p53蛋白表達主要定位于細胞核，以胞核中出現(xiàn)棕褐色顆粒為陽性，按染色強度和陽性細胞數(shù)綜合評分：(1)染色強度：無陽性著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；(2)陽性細胞數(shù)：無陽性細胞為0分，陽性細胞數(shù)<50%為1分，≥50%為2分。將兩項得分結果相乘：0分為陰性，1～3分為弱陽性，4～6分為強陽性。K-RAS基因結果判讀參照艾德人類K-RAS基因突變檢測試劑盒說明書的判斷方法進行。

1.5 統(tǒng)計學分析采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計學分析。采用χ2檢驗分析K-RAS基因狀態(tài)、p53蛋白表達水平與臨床病理特征間的關系以及K-RAS基因狀態(tài)與p53蛋白表達的相關性。生存分析采用Kaplan-Meier生存曲線法、Log-rank檢驗及多因素Cox回歸分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 K-RAS基因突變和p53蛋白表達與結直腸癌臨床病理特征的關系82例結直腸癌組織中K-RAS基因表達包括42例野生型K-RAS(51.2%)和40例突變型K-RAS(48.8%)。分析結直腸癌組織中K-RAS基因突變狀態(tài)與各臨床病理特征的關系，結果顯示與患者年齡、性別、臨床分期、分化程度、淋巴結轉移均無關(P均>0.05)。p53蛋白表達與結直腸癌患者年齡、性別、臨床分期、分化程度均無關(P均>0.05)，與淋巴結轉移相關(χ2=6.237，P=0.044)。p53多個樣本率間的多重比較結果顯示，p53強陽性組的淋巴結轉移率(84.6%，44/52)高于弱陽性組(44.4%，4/9)(χ2=5.182，P=0.023)；p53強陽性組(84.6%，44/52)與陰性組(81.0%，17/21)的淋巴結轉移率差異無顯著性(χ2=0.001，P=0.973)；p53弱陽性組(44.4%，4/9)與陰性組(81.0%，17/21)的淋巴結轉移率差異無顯著性(χ2=2.449，P=0.118)(表1，圖1)。

ABC

表1 K-RAS基因突變和p53蛋白表達與結直腸癌臨床病理特征的關系

2.2 結直腸癌組織中K-RAS基因突變與p53蛋白表達的相關性分析在結直腸癌組織中，K-RAS基因類型與p53蛋白表達無相關性(χ2=1.186，P=0.553，表2)。

表2 結直腸癌組織中K-RAS基因類型與p53蛋白表達的關系

2.3 K-RAS基因突變狀態(tài)、p53蛋白表達與結直腸癌患者預后的關系隨訪截至2019年9月，66例有隨訪資料，隨訪率為80.5%，Kaplan-Meier生存分析顯示，隨訪6～53個月，1年生存率為84.3%，2年生存率為78.8%，3年生存率為60.8%。Kaplan-Meier生存分析結果顯示，臨床分期、組織分化程度、K-RAS基因與預后相關(P<0.05)。Ⅲ+Ⅳ期患者生存時間低于Ⅰ+Ⅱ期患者，兩者之間差異有統(tǒng)計學意義(χ2=3.897，P=0.048)；低分化組生存時間低于高+中分化組(χ2=4.046，P=0.044)；K-RAS基因突變型患者預后差于野生型患者(χ2=6.372，P=0.012)。p53蛋白表達水平與患者預后無關(P>0.05)。將患者年齡、性別、組織分化程度、臨床分期、淋巴結轉移、K-RAS基因和p53蛋白表達進行Cox回歸模型多因素生存分析，結果顯示，臨床分期、K-RAS基因是影響結直腸癌患者術后預后的獨立因素(HR=2.770，P=0.023；HR=0.276，P=0.029)(表3，圖2)。

圖2 結直腸癌患者生存率與臨床分期(A)、組織分化程度(B)和K-RAS基因狀態(tài)(C)的關系

表3 結直腸癌患者多因素Cox回歸分析

3 討論

K-RAS是一種原癌基因，在細胞生長和分化機制中發(fā)揮控制作用，某些致癌物通過點突變將其轉化為活性致癌基因。K-RAS基因突變發(fā)生于外顯子2、3和4，外顯子2是K-RAS基因突變的常見突變位點。K-RAS突變基因是結直腸癌常見的致癌基因，亞洲人突變的發(fā)生率為29%～62.9%[3]，本組K-RAS基因突變率為48.8%，在文獻報道組范圍內(nèi)。Malhotra等[4]報道K-RAS突變與患者年齡和組織學分化程度有關，丁莉等[5]報道K-RAS突變與淋巴結轉移有關，但本實驗未發(fā)現(xiàn)K-RAS突變與患者年齡、性別、臨床分期、組織分化程度及淋巴結轉移有相關性，這與部分學者的研究結果較一致[6-7]，該結果可能受多種因素的影響，如突變檢測技術的敏感性和特異性、患者樣本量或種群不同等。

野生型TP53基因編碼一種核蛋白，在正常細胞中p53蛋白維持在一個低水平，通過調(diào)節(jié)基因轉錄以應對癌基因信號激活及DNA損傷等不利因素。當TP53基因突變后，其編碼的p53蛋白半衰期長，穩(wěn)定性強，可在核內(nèi)不斷積累，從而失去對細胞的監(jiān)視作用，反之在細胞惡變中起癌基因的作用。在結直腸癌患者發(fā)生TP53突變后，50%～75%的病例呈陽性[8]，因此大部分學者研究p53蛋白表達時多采用兩層分組模式(陰性組、陽性組)。Oh等[2]為探討結直腸癌患者p53蛋白表達與TP53基因狀態(tài)的關系，將p53免疫組化結果和靶向外顯子測序數(shù)據(jù)進行了對比，發(fā)現(xiàn)p53陰性患者中有53%發(fā)生了錯義突變或無義突變，p53高表達(≥50%腫瘤細胞陽性)患者約80%發(fā)生錯義突變，而p53低表達(<50%腫瘤細胞陽性)患者70%以上未發(fā)生TP53基因突變，提示p53低表達者更有可能為野生型TP53，同時提示采用兩層分組模式有一定的缺陷性。因此，本實驗將p53表達分為陰性組、弱陽性組、強陽性組，雖然按p53蛋白表達程度來反映TP53基因狀態(tài)具有一定的異質(zhì)性及局限性，但參考Oh等[2]報道的p53蛋白表達與TP53突變狀態(tài)間存在顯著相關性，Ines等[6]報道免疫組化法檢測p53基因突變的準確性為71%，敏感性為33.8%，特異性為91%，提示本實驗的分組模式具有較好的可行性，本實驗最初也采用了兩層分組模式(陰性組、陽性組)，未發(fā)現(xiàn)p53表達與結直腸癌病理臨床特征的關系，而采用三層分組模式(陰性組、弱陽性組、強陽性組)時，發(fā)現(xiàn)p53強陽性組相比弱陽性組更易發(fā)生淋巴結轉移，提示其侵襲轉移能力增強。綜合分析p53蛋白判讀采用三層分組模式優(yōu)于兩層分組模式，可較好的實踐于臨床病理診斷指標的判讀中，對評估患者預后有一定的幫助。

K-RAS基因和TP53基因同時突變者很少見，很少發(fā)生在同一腫瘤。文獻報道僅4%結直腸癌患者同時發(fā)生兩種基因突變[6]。本實驗對結直腸癌組織中K-RAS基因突變狀態(tài)與p53蛋白表達進行相關性分析，未發(fā)現(xiàn)K-RAS基因與p53蛋白表達有相關性。Malhotra等[4]證實了在結直腸癌中K-RAS和p53突變的共存極為罕見，提示可能在結直腸癌中K-RAS和TP53突變發(fā)生在不同通路，且不屬于一個共同途徑積累的遺傳改變。Rachmawati等[9]對623例印度尼西亞結直腸癌患者K-RAS與p53蛋白免疫組化結果的相關性分析發(fā)現(xiàn)，兩者之間存在輕度正相關，與本實驗結果不一致。該結果可能受樣本量、種群不同等多因素作用，在后續(xù)的實驗中可增加樣本量等優(yōu)化設計以進一步探究。

本實驗對66例結直腸癌患者進行了生存分析，發(fā)現(xiàn)Ⅲ+Ⅳ期患者的生存率低于Ⅰ+Ⅱ期患者，腫瘤低分化組患者的生存率低于高+中分化組，K-RAS突變型組的生存率低于野生型組，提示臨床分期晚、組織分化程度低、K-RAS基因突變是影響結直腸癌患者生存時間的風險因素[6,10]。文獻報道TP53突變是結直腸癌的預后不良標志[11]，但Ines等[6]研究報道TP53基因突變和p53蛋白過表達對患者生存均無影響，本實驗亦未發(fā)現(xiàn)p53蛋白與患者不良預后有關。推測可能是因TP53基因是一個關鍵基因，調(diào)控多種基因的轉錄表達、作用及機制較為多樣復雜所致。進一步多因素分析顯示，臨床分期和K-RAS基因是影響結直腸癌患者預后的獨立因素，提示兩者的檢測對結直腸癌患者的預后評估有一定的意義。

綜上所述，K-RAS、p53可能參與結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展進程，K-RAS、p53可能是兩個獨立的因素，p53蛋白表達與淋巴結轉移有關，兩者的檢測對評估結直腸癌的生物學行為、預后有一定的意義。