張藝馨，黃幼生,2，解 娜,2，周曉明,2，王敏健，吳文婷，鄭藝菲

胃癌是常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率及病死率位居我國惡性腫瘤的第2位，絕大多數(shù)患者的死亡與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移、復發(fā)相關(guān)[1]。大部分胃癌分化程度低，具有高度異質(zhì)性，復發(fā)、轉(zhuǎn)移率高，可能與胃癌頻繁的遺傳改變有較大關(guān)系。

Ras相關(guān)的C3肉毒素底物1(ras-related C3 botulinum toxin substrate 1, Rac1)是Rho家族的一個重要成員，屬于小GTP結(jié)合蛋白的Ras超家族，調(diào)節(jié)著各種各樣的細胞事件，包括控制細胞生長、細胞骨架重組和蛋白激酶的激活。Rac1在人類大部分侵襲性腫瘤中有過度活化、高表達現(xiàn)象，如結(jié)直腸癌[2]、胃癌[3]、肺癌[4]、乳腺癌[5]等。過表達的Rac1蛋白具有活化MAPK、Wnt、JNK/SAPK、PI3K、NF-κB等信號傳導途徑，參與腫瘤血管形成、抑制腫瘤細胞凋亡、促進其增殖；調(diào)節(jié)細胞黏附、骨架蛋白的合成與降解、層形足板的形成提升癌細胞的移動能力；誘導癌細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)，促進腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移[2-6]等功能。然而，Rac1在胃癌中的作用機制尚未闡明，因此，本實驗通過TCGA數(shù)據(jù)分析Rac1在胃癌組織中的表達情況，qPCR進一步驗證；隨即應(yīng)用慢病毒包裝Rac1干擾質(zhì)粒沉默胃癌細胞Rac1的表達，觀察細胞的增殖、細胞克隆表達變化等情況，并進一步探討其作用機制，以期為闡明胃癌的發(fā)病機制，及胃癌分子治療靶標提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病例收集從TCGA數(shù)據(jù)庫(https://portal.gdc.cancer.gov/)中下載胃癌RNA-seq表達的相關(guān)數(shù)據(jù)，應(yīng)用Python和R數(shù)據(jù)包對數(shù)據(jù)進行整合、基因注釋，篩選出胃癌及配對正常胃黏膜Rac1基因表達的相關(guān)數(shù)據(jù)。收集海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院2017年1月～2018年12月確診為胃癌，且未經(jīng)放、化療的手術(shù)標本及配對癌旁組織90例。其中男性53例，女性37例；平均年齡56.7歲。所有樣本的采集均經(jīng)患者或其家屬知情同意，同時經(jīng)海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院倫理委員會討論通過。所有入選病例的病理類型、分期、分級均經(jīng)兩名高級職稱病理醫(yī)師復核。

1.2 主要試劑RPMI 1640液體培養(yǎng)基購自杭州博士德生物公司；標準胎牛血清購自杭州四季青生物公司；靶向Rac1基因序列(5′-TTCTTAACAT CACTGTCTT-3′)設(shè)計的shRNA序列(正向：5′-CCT TCTTAACATCACTGTCTT-3′，反向：5′-AAGACAGT GATGTTAAGAAGG-3′)，GV248載體連接及慢病毒包裝由上海吉凱基因公司合成、擴增；BCA試劑盒、CCK-8試劑盒均購自碧云天生物研究所；Rac1、β-actin、N-cadherin、Snail、MMP-9、ERK1/2一抗及二抗均購自美國Abcam公司；E-cadherin、vimentin購自杭州博士德生物公司(用于Western blot)及福州邁新生物公司(用于免疫組化)。

1.3 RNA提取采用天根生物公司RNAprep Pure FFPE Kit提取胃癌及癌旁正常胃黏膜組織總RNA，按試劑盒說明進行提?。呵腥「魇灅颖? μm厚8張放置在1.5 mL EP管中，經(jīng)二甲苯脫蠟、乙醇清洗后，移除上清、完全揮發(fā)乙醇；加入裂解液RF以及Proteinase K于沉淀中，55 ℃孵育15 min，后80 ℃孵育15 min到組織完全溶解至透明；再加入緩沖液RB及無水乙醇后，將液體轉(zhuǎn)移至核酸吸附柱，離心棄除廢液；隨后去除DNA、蛋白后清洗2遍，室溫晾干后，用ddH2O洗脫RNA收集備用。采用天根生物RNAprep Pure Cell Kit提取培養(yǎng)細胞總RNA，按試劑說明書進行操作，取出呈對數(shù)生長的培養(yǎng)細胞，清洗后在培養(yǎng)瓶中直接加入裂解液RL，常溫裂解5 min后轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中，其余步驟同石蠟組織提取RNA。

1.4 細胞培養(yǎng)人胃癌MGC-803細胞購自上海中國典型生物保藏中心。細胞孵育在含有100 mL/L胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素雙抗混合液的RPMI 1640細胞培養(yǎng)液中，于37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞生長融合度達80%滿度時，取對數(shù)生長期的細胞用于實驗研究。

1.5 細胞感染將人胃癌MGC-803細胞分為空白對照組(未感染Rac1-shRNA干擾質(zhì)粒及GFP-shRNA陰性對照質(zhì)粒)、陰性對照組(感染GFP-shRNA陰性對照質(zhì)粒)和Rac1干擾組(感染Rac1-shRNA干擾質(zhì)粒)。轉(zhuǎn)染前1天將MGC-803細胞按1×105個/孔接種于6孔板，24 h在細胞對數(shù)生長期內(nèi)進行感染，具體轉(zhuǎn)染步驟按吉凱基因慢病毒感染說明書進行。在1 mL無血清及抗生素的培養(yǎng)基中加入4×106TU目標病毒、40 μL HiTran GP感染增強液(25×)，分別轉(zhuǎn)染入Rac1干擾組及陰性對照組細胞，2～3天后在倒置熒光顯微鏡下觀察細胞感染效率。在感染效率超過90%，細胞生長80%滿度，且細胞處于對數(shù)生長期時，收集細胞待用。

1.6 qPCR檢測應(yīng)用Primerprimer 7.0軟件設(shè)計Rac1及GAPDH基因mRNA引物，Rac1上游引物序列5′-ATGTCCGTGCAAAGTGGTATC-3′，下游引物序列5′-CTCGGATCGCTTCGTCAAACA-3′；GAPDH上游引物序列5′-GCCAAAAGGGTCATCATCTC-3′，下游引物序列5′-GTAGAGGCAGGGATGATGTTC-3′。qPCR檢測按文獻[8]進行：收集各組細胞，提取總RNA，qPCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序按天根生物公司Taq PCR MasterMix試劑盒說明書設(shè)定，在ViiA system qPCR檢測儀中進行。qPCR結(jié)果按2-ΔΔCt方法計算。相對于GAPDH表達值，≥配對黏膜組織1.5倍的病例歸為高表達組，<1.5倍為低表達組。

1.7 細胞增殖檢測取對數(shù)生長期的MGC-803細胞，以2 000個/孔接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每組設(shè)置3個復孔，按照上文1.5的方法進行慢病毒感染，8 h換去轉(zhuǎn)染液，再繼續(xù)培養(yǎng)12、48、72 h，每孔細胞中加入CCK-8試劑10 μL，于37 ℃、5%CO2條件下繼續(xù)孵育2 h，酶標儀測定490 nm的吸光度，計算細胞增殖率。

1.8 細胞克隆實驗將感染后胃癌細胞按每組800個種植于6孔板中，每組3復孔，置于37 ℃ 5% CO2恒溫箱中培養(yǎng)，每隔3天換液1次；培養(yǎng)至控制組大多數(shù)克隆細胞數(shù)>50時終止，PBS洗滌2次、多聚甲醛固定、GIEMSA染色、拍照、計數(shù)克隆數(shù)及平均克隆大小。

1.9 Western blot法收集并裂解各組細胞，BSA法定量。加入上樣緩沖液變性后以每孔30 μg上樣，電泳分離，轉(zhuǎn)膜，固定蛋白于PVDF膜上，漂洗，5%脫脂奶粉常溫封閉2 h，加入Rac1(1 ∶1 000)、ERK1/2(1 ∶500)、p-ERK1/2(1 ∶500)、E-cadherin(1 ∶500)、vimentin(1 ∶500)、N-cadherin(1 ∶500)、Snail(1 ∶500)、MMP-9(1 ∶500)、β-actin(1 ∶1 000)一抗4 ℃孵育過夜，洗滌3遍，加入二抗(1 ∶4 000)常溫孵育1.5 h，TBST緩沖液洗滌3遍，ECL底物顯色，分析其光密度、計算各目標蛋白相對表達量(β-actin為內(nèi)參)。

1.10 統(tǒng)計學分析采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用studentT檢驗，計數(shù)資料用百分比或率表示，采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織中Rac1基因的表達從TCGA數(shù)據(jù)庫中共提取373例胃癌組織相關(guān)數(shù)據(jù)，刪除信息不全、罕見類型胃癌病例后計入統(tǒng)計分析。分析顯示Rac1在胃癌組織中的表達明顯高于配對正常胃黏膜組織，差異有顯著性(P<0.001，圖1)。90例胃癌及其配對正常胃黏膜石蠟組織提取總RNA后進行qPCR檢測，結(jié)果顯示，胃癌組織中Rac1表達明顯高于配對正常胃黏膜組織，胃癌組織表達強度是正常胃黏膜組織的1.53倍，其中癌組織陽性率為76.0%，顯著高于正常胃黏膜組織(12.2%)，差異有顯著性(P=0.03)。Rac1表達增強與胃癌轉(zhuǎn)移、分期、浸潤深度顯著相關(guān)(P<0.01)，與患者年齡、性別、腫瘤部位、分化程度等無明顯相關(guān)性(P>0.05，表1)。

表1 胃癌中Rac1的表達與臨床病理特征的關(guān)系

圖1 TCGA數(shù)據(jù)分析Rac1 mRNA在胃癌及其配對正常胃黏膜組織中的表達

2.2 RNAi沉默Rac1基因表達的效率慢病毒包裝Rac1-shRNA干擾質(zhì)粒及GFP陰性對照質(zhì)粒感染胃癌MGC-803細胞3天后，倒置熒光顯微鏡下觀察，陰性對照組及Rac1干擾組細胞出現(xiàn)綠色熒光表達，10個高倍視野下觀察僅個別細胞未表達，感染效率在90%以上，空白對照組無熒光表達(圖2)。qPCR檢測結(jié)果顯示，相比陰性對照組，Rac1干擾組細胞的Rac1基因表達明顯下調(diào)，干擾效率達72.2%，差異有顯著性(P<0.01，圖3)。

圖2 Rac1慢病毒感染MGC-803細胞白光及熒光圖：CON.空白對照組；NC.陰性對照組；KD.Rac1干擾組

圖3 Rac1慢病毒感染MGC-803細胞干擾效率檢測：A. qPCR檢測Rac1、GAPDH mRNA擴增曲線圖；B.Rac1基因相對表達柱狀圖；CON.空白對照組；NC.陰性對照組；KD.Rac1干擾組；KD與NC相比，**P<0.01

2.3 MGC-803細胞的增殖能力應(yīng)用CCK-8實驗檢測Rac1基因沉默前、后MGC-803細胞生長變化，結(jié)果顯示Rac1干擾組細胞生長速度明顯低于陰性對照組，24 h抑制效率為49.9%(P=0.028，圖4)。細胞克隆形成實驗同樣顯示(圖5)，Rac1表達抑制后，細胞克隆形成率明顯降低，克隆體積顯著縮小，Rac1干擾組是陰性對照組克隆形成率的50.9%(P=0.001)，平均體積是陰性對照組的67.3%(P=0.033)。表明沉默Rac1表達能降低胃癌細胞的生長速度及腫瘤克隆形成。

圖4 CCK-8實驗檢測Rac1基因沉默前后MGC-803細胞生長情況：CON.空白對照組；NC.陰性對照組；KD.Rac1干擾組；KD與NC相比，*P<0.05

圖5 Rac1基因沉默前后MGC-803細胞克隆形成情況：A.細胞克隆平板Giemsa染色及顯微鏡白光圖；B.細胞克隆計數(shù)柱狀圖；CON.空白對照組；NC.陰性對照組；KD.Rac1干擾組；KD與NC相比，**P<0.01

2.4 Rac1基因沉默后胃癌細胞EMT標志物的表達沉默胃癌細胞MGC-803 Rac1基因表達后，本實驗繼而檢測Rac1基因?qū)ξ赴┘毎鸈MT的影響。Western blot(圖6)及免疫組化(圖7)結(jié)果表明：相對于空白對照組及陰性對照組，Rac1干擾組細胞E-cadherin表達上調(diào)，vimentin、N-cadherin表達下調(diào)，表明沉默Rac1基因能夠抑制胃癌細胞EMT。

圖6 Western blot法檢測Rac1基因沉默后胃癌細胞EMT標志物的表達變化：A.Western blot條帶圖；B.Western blot條帶灰度掃描相對值；CON.空白對照組；NC.陰性對照組；KD.Rac1干擾組；KD與NC相比，*P<0.05

圖7 免疫組化法檢測Rac1基因沉默后胃癌細胞EMT標志物的表達變化：CON.空白對照組；NC.陰性對照組；KD.Rac1干擾組，EnVision兩步法

2.5 Rac1基因沉默后胃癌細胞ERK1/2信號通路蛋白表達變化已有研究表明Rac1蛋白表達變化能夠引起細胞中ERK1/2蛋白發(fā)生磷酸化，本實驗利用shRNA沉默胃癌MGC-803細胞Rac1基因表達后，應(yīng)用Western blot法檢測細胞ERK1/2磷酸化及其下游蛋白表達水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與陰性對照組相比，Rac1干擾組細胞總ERK1/2蛋白表達水平無明顯變化，但ERK1/2蛋白磷酸化水平明顯降低(P=0.041，圖8)；與陰性對照組相比，ERK信號通路蛋白Snail、MMP-9蛋白表達水平降低(P<0.05)。

圖8 Western blot法檢測Rac1基因沉默后胃癌細胞ERK1/2通路蛋白表達變化：A.Western blot條帶圖；B.Western blot條帶灰度掃描相對值；CON.空白對照組；NC.陰性對照組；KD.Rac1干擾組；KD與NC相比，*P<0.05

3 討論

Rac亞家族包括Rac1、Rac2、Rac3和Rac1的剪切突變體Rac1b。Rac1基因全長29 kb，包含7個外顯子，位于人染色體7p22。Rac1基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物有1.2 kb和2.5 kb兩種。Rac1是細胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導分子，是腫瘤細胞遷移侵襲的重要調(diào)控分子。Rac1蛋白在人類大部分侵襲性腫瘤中沒有發(fā)現(xiàn)突變體，但發(fā)現(xiàn)有過度活化、高表達現(xiàn)象。在胃癌、肺癌、乳腺癌、睪丸腫瘤、胰腺癌、頭頸部腫瘤等均報道有Rac1表達的異常增高[2-6]。有研究證實Rac1在正常胃組織中低表達或不表達，而在胃癌組織中高表達，其表達程度與胃癌的浸潤、遠處轉(zhuǎn)移有密切聯(lián)系[3,6]。

本實驗應(yīng)用TCGA數(shù)據(jù)分析及qPCR的方法檢測胃癌石蠟組織中Rac1的表達情況，同樣顯示在胃癌組織中Rac1存在高表達，其表達與胃癌組織淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度、分期有密切關(guān)系；實驗進一步通過RNA干擾的方法抑制胃癌細胞株MGC-803細胞Rac1表達后，胃癌細胞增殖明顯下降，細胞克隆率顯著降低，這些實驗結(jié)果表明Rac1表達增高促進了胃癌的進展，而沉默Rac1表達能抑制胃癌的增殖。

研究認為胃癌的轉(zhuǎn)移可能與癌細胞EMT有關(guān)。EMT是指具有極性的上皮細胞轉(zhuǎn)換成為具有活動能力的間質(zhì)細胞并獲得侵襲和遷移能力的過程。當前認為90%以上的上皮細胞惡性腫瘤在發(fā)生侵襲與轉(zhuǎn)移過程中發(fā)生了EMT，如結(jié)腸癌[2]、胃癌[3，7]、肝癌[8]等。EMT以上皮細胞表型的喪失及間質(zhì)特性的獲得為重要特征，具體包括上皮細胞黏附分子(如E-cadherin等)表達減少、間質(zhì)細胞黏附分子(N-cadherin)表達增加、角蛋白(如Cytokeratin18等)為主的細胞骨架轉(zhuǎn)變?yōu)椴ㄐ蔚鞍诪橹?如vimentin等)的細胞骨架，從而引起細胞形態(tài)的改變。這種表型的轉(zhuǎn)換允許腫瘤細胞擺脫細胞-細胞間連接，而表現(xiàn)得更具侵襲性，因此與腫瘤細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[7，9-10]。本實驗也證實在低分化胃癌細胞株MGC-803細胞E-cadherin表達丟失，而間葉標記vimentin、N-cadherin表達增高，證實MGC-803細胞發(fā)生了EMT。

研究表明過表達的Rac1能夠刺激新的肌動蛋白聚合，通過活化靶蛋白Scar/Wave激活Arp2/3復合體，該復合體是一種肌動蛋白相關(guān)蛋白，能刺激肌動蛋白單體的成核作用，從而導致新的肌動蛋白絲形成，加快細胞移動[2-6,11]?；罨腞ac1能激活NF-κB，調(diào)節(jié)uPA和MMP-9，活化核轉(zhuǎn)錄因子Snail，Snail能結(jié)合E-cadherin啟動子，抑制E-cadherin蛋白表達，從而誘導細胞EMT，促腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移[2-6,12]。有研究顯示，應(yīng)用Rac1抑制劑NSC23766處理胃癌細胞后，能阻滯癌細胞EMT，從而降低癌細胞轉(zhuǎn)移率[2-3]。本實驗也證實在應(yīng)用慢病毒介導Rac1-shRNA抑制胃癌細胞Rac1表達后，胃癌細胞間質(zhì)表型vimentin、N-cadherin及MMP-9表達下調(diào)，而上皮標記E-cadherin表達上調(diào)，表明Rac1表達與胃癌EMT相關(guān)，沉默Rac1表達能夠部分逆轉(zhuǎn)胃癌細胞EMT，進而抑制腫瘤細胞生長、轉(zhuǎn)移。

研究顯示Rac1高表達誘導細胞EMT與增強p38α、AKT、ERK和GSK3β的磷酸化有關(guān)[2-6,11]。多種EMT誘導因子能通過激活ERK信號通路調(diào)控細胞EMT，證明ERK信號通路是EMT的關(guān)鍵協(xié)調(diào)因子[13]。積累的研究表明，活化的Rac1能激活MAPK信號通路，促進ERK1/2的磷酸化，磷酸化的ERK1/2(p-ERK1/2)能誘導Snail及MMP-9表達增加，從而降低E-cadhern表達，向N-cadherin、vimentin等間質(zhì)表型轉(zhuǎn)換，最終誘導EMT的發(fā)生[11,14]。有研究顯示沉默Rac1表達或抑制Rac1活性能降低ERK的磷酸化程度，進而減少Snail，上調(diào)E-cadherin等的表達，逆轉(zhuǎn)癌細胞EMT[3,15]。本實驗顯示，應(yīng)用慢病毒介導Rac1-shRNA沉默Rac1表達后，ERK1/2的磷酸化程度顯著降低，Snail及MMP-9表達降低，進而阻斷胃癌細胞EMT。這些實驗結(jié)果表明沉默Rac1表達抑制胃癌細胞EMT可能與降低ERK1/2磷酸化有關(guān)。

綜上所述，Rac1在胃癌組織中高表達，與胃癌轉(zhuǎn)移和浸潤相關(guān)；沉默Rac1的表達，能抑制胃癌細胞EMT，從而降低胃癌細胞增殖，可能與降低ERK1/2磷酸化程度有關(guān)。Rac1過表達在胃癌的發(fā)展中可能起到關(guān)鍵作用，或能成為胃癌靶向治療的另一靶標。