李明鳳，方林娜，計 翼，胡沛然，孫 林，王悅晨，孫禮潔，尹 玉,3

前列腺癌是我國男性泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一。前列腺特異性抗原(prostate-specific antigen, PSA)是前列腺癌檢測、診斷、分級和預(yù)測預(yù)后的重要生物學(xué)標(biāo)志物，但其不具有前列腺癌的特異性且無法區(qū)分惰性疾病和侵襲性疾病[1]。因此，尋找新的特異的生物學(xué)標(biāo)志物，并探討其是否可以作為治療靶點，對明確病理診斷及患者的治療均具有重要意義。腫瘤血管內(nèi)皮標(biāo)志物8(tumor endothelial marker 8, TEM8)在多種腫瘤細(xì)胞和腫瘤相關(guān)細(xì)胞(如腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞和癌成纖維細(xì)胞)中表達上調(diào)，在腫瘤細(xì)胞的遷移、黏附和腫瘤血管生成等生理過程中發(fā)揮重要作用[2]。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)作為血管生成的主要調(diào)節(jié)因子，能夠特異性地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，在腫瘤細(xì)胞的快速生長和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。本實驗采用免疫組化MaxVision法檢測前列腺癌組織和前列腺增生組織中TEM8和VEGF蛋白表達，探討兩者表達的相關(guān)性及臨床意義，旨在為前列腺癌的治療尋找新靶點。

1 材料與方法

1.1 臨床資料選取2015～2017年安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院存檔的行前列腺穿刺活檢、前列腺癌電切術(shù)、前列腺癌根治術(shù)的前列腺組織標(biāo)本94例。標(biāo)本均經(jīng)病理醫(yī)師明確診斷，均有詳細(xì)的臨床病理資料，且患者術(shù)前均未行任何治療。94例標(biāo)本中前列腺癌標(biāo)本71例，患者年齡47～88歲，平均69.03歲；前列腺增生組織標(biāo)本23例，患者年齡59～81歲，平均69.43歲。采用美國癌癥聯(lián)合委員會(AJCC)分類法對前列腺癌組織進行TNM臨床分期，并采用與預(yù)后密切相關(guān)的五級法進行Gleason評分，即對同一組織不同區(qū)域腺癌結(jié)構(gòu)的變異，按照主要和次要分化程度分別評分，最終以兩項評分相加的總分劃分前列腺癌組織為中+高分化腺癌組(Gleason評分≤7)和低+未分化癌組(Gleason評分>7)。實驗中選取的23例前列腺增生標(biāo)本作為前列腺癌標(biāo)本的對照組。

1.2 試劑TEM8鼠單克隆抗體(1 ∶20，NOVUS，200C1339)、VEGF鼠單克隆抗體(1 ∶100，Abcam公司，ab1316)以及購自北京中杉金橋公司的通用型酶標(biāo)山羊抗鼠/兔聚合物、PBS緩沖液粉劑、檸檬酸鹽抗原修復(fù)液、DAB酶底物顯色試劑盒以及免疫組化試劑盒。

1.3 方法免疫組化染色采用MaxVision法。所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋后連續(xù)4～5 μm厚切片。組織標(biāo)本經(jīng)烤片、梯度乙醇脫水、抗原修復(fù)以及過氧化物酶阻斷等一系列處理后，滴加一抗，4 ℃過夜孵育。HRP辣根酶標(biāo)記的二抗室溫下孵育。實驗中以PBS代替一抗作為陰性對照，已知陽性標(biāo)本作為陽性對照。

1.4 結(jié)果判讀將免疫組化切片置于光鏡下觀察，以免疫顯色強度和陽性細(xì)胞密度作為定量評分標(biāo)準(zhǔn)進行判讀。TEM8陽性定位于前列腺癌和前列腺增生組織中腺上皮細(xì)胞的胞質(zhì)和胞膜(圖1)，VEGF陽性定位于前列腺癌和前列腺增生組織中腺上皮細(xì)胞的胞質(zhì)。觀察待檢測組織相應(yīng)部位出現(xiàn)彌漫均質(zhì)的淡黃色細(xì)顆粒、棕黃色顆粒以及褐黃色粗顆粒的程度，無細(xì)胞著色為0分，弱陽性為1分，中等陽性為2分，強陽性為3分；結(jié)合TEM8、VEGF染色陽性細(xì)胞密度進行評分，陽性細(xì)胞數(shù)≤25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分。參照文獻[3-4]，以兩項評分的乘積作為最終的判斷結(jié)果，≤7分為陰性組，>7分為陽性組。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 25.0軟件進行χ2檢驗和Spearman等級相關(guān)分析檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 前列腺癌組織和前列腺增生組織中TEM8、VEGF的表達TEM8在前列腺癌組織中的陽性率為60.6%(43/71)(圖1)，在前列腺增生組織中的陽性率為21.7%(5/23)，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=10.479，P<0.05)；VEGF在前列腺癌組織中的陽性率為59.2%(42/71)，在前列腺增生組織中的陽性率為13%(3/23)，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=13.120，P<0.05，表1，圖2)。值得注意的是，20例轉(zhuǎn)移性前列腺癌組織中TEM8的陽性率為85%(17/20)，51例非轉(zhuǎn)移性前列腺癌組織中TEM8的陽性率為51.0%(26/51)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；轉(zhuǎn)移性前列腺癌組織中VEGF的陽性率為80%(16/20)，非轉(zhuǎn)移性前列腺癌組織中VEGF的陽性率為51.0%(26/51)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表2)。

表1 前列腺增生及前列腺癌組織中TEM8和VEGF的表達

表2 非轉(zhuǎn)移性前列腺癌及轉(zhuǎn)移性前列腺癌組織中TEM8和VEGF的表達

圖1 TEM8免疫組化結(jié)果判讀：A.前列腺癌細(xì)胞無著色為0分；B.弱陽性為1分；C.中等陽性為2分；D.強陽性為3分，MaxVision法 圖2 A.TEM8在前列腺增生組織中呈陰性，MaxVision法；B.TEM8在前列腺癌組織中呈陽性，MaxVision法；C.VEGF在前列腺增生組織中呈陰性，MaxVision法；D.VEGF在前列腺癌組織中呈陽性，MaxVision法

2.2 TEM8、VEGF表達與前列腺癌臨床病理特征的關(guān)系TEM8高表達與前列腺癌組織的Gleason評分、TNM分期以及骨轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)，與患者年齡、術(shù)前PSA水平無關(guān)(P>0.05)。VEGF的高表達與前列腺癌組織的TNM分期以及骨轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)，與患者年齡、術(shù)前PSA水平和Gleason評分無關(guān)(P>0.05，表3)。

表3 TEM8、VEGF表達與前列腺癌臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.3 前列腺癌組織中TEM8與VEGF表達的相關(guān)性前列腺癌組織中TEM8和VEGF同時陽性33例，同時陰性19例；兩者之間呈顯著正相關(guān)(rs=0.443，P<0.001，表4)。

表4 前列腺癌組織中TEM8與VEGF表達的相關(guān)性

3 討論

前列腺惡性腫瘤的治療方法通常有內(nèi)分泌治療、手術(shù)治療、放化療。手術(shù)切除和內(nèi)分泌治療可使早期前列腺癌患者出現(xiàn)短期癥狀的緩解，不幸的是，疾病在一段時間后可能進展為惡性程度更高的難治性前列腺癌，放、化療對腫瘤細(xì)胞選擇性差且具有難以避免的副作用，這些均使前列腺癌的治療受阻。Folkman[5]提出腫瘤血管新生理論，認(rèn)為腫瘤生長到一定程度時，腫瘤的持續(xù)生長取決于其是否有充足的血液供應(yīng)，抗腫瘤血管新生理論的提出為癌癥診療提供新方向。腫瘤脈管系統(tǒng)為腫瘤的快速增殖和轉(zhuǎn)移提供了充足的血液供應(yīng)，同時也為腫瘤細(xì)胞逃逸提供了轉(zhuǎn)移的路徑，TEM8和VEGF作為抗腫瘤血管生成的候選分子，已被發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤細(xì)胞中存在過表達趨勢[6]。

TEM8是整合素樣細(xì)胞表面跨膜蛋白，最初因其在結(jié)直腸腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞中高表達而被鑒定出來，隨后TEM8被發(fā)現(xiàn)是炭疽毒素的受體，介導(dǎo)炭疽毒素進入細(xì)胞[7]。TEM8特異性地表達于腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞和癌細(xì)胞中，提示TEM8作為腫瘤治療靶點具有潛在的優(yōu)勢。TEM8基因敲除小鼠實驗證明，敲除TEM8基因后，小鼠正常的生長發(fā)育及傷口的愈合均未受到影響，但其體內(nèi)出現(xiàn)大量細(xì)胞外基質(zhì)沉積，提示TEM8在維持細(xì)胞外基質(zhì)穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮作用[2]。在裸鼠移植瘤模型中，靶向TEM8的特異性抗體能夠同時靶向三陰型乳腺癌干細(xì)胞和腫瘤相關(guān)血管系統(tǒng)，誘導(dǎo)瘤體消退[8]。研究表明，在嬰幼兒血管瘤中TEM8與血管內(nèi)皮生長因子受體2(VEGFR2)在功能上相互作用并參與對下游VEGF信號通路的調(diào)控[9]。TEM8的高表達已被發(fā)現(xiàn)與乳腺癌、結(jié)腸癌和骨肉瘤等疾病的不良預(yù)后水平相關(guān)[7,10]。盡管如此，TEM8的生理功能尚不十分清楚，有待進一步研究證實。

VEGF又稱血管通透因子，定位于人類染色體6p21，由2個相同多肽鏈通過二聚體聚合而成，具有促進內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂和抗凋亡的作用。VEGF可誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞、白血病細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲[11]。除此之外，VEGF通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)誘導(dǎo)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，在嬰幼兒血管瘤的發(fā)展中起重要作用。靶向VEGF/VEGFR2軸的治療藥物已在臨床上用于多種癌癥的治療(如結(jié)腸癌、肺癌、腦癌、腎癌等)[12]。文獻報道[13-14]，從健康對照組、局限性前列腺癌組到轉(zhuǎn)移性前列腺癌組，血漿VEGF水平逐漸升高且VEGF的表達與前列腺癌患者生存期密切相關(guān)。因此，抗VEGF治療已成為前列腺癌多項臨床試驗的目標(biāo)。VEGF是腫瘤血管新生所必需的因子，其在正常血管生成過程中亦可發(fā)揮作用，在腫瘤微環(huán)境中的VEGF表達受多種因素的調(diào)節(jié)(如低氧環(huán)境、雄激素水平等)。TEM8的高表達亦可誘導(dǎo)腫瘤組織的血管新生，但相比于VEGF，TEM8基因敲除的動物模型表明其并非正常生理狀態(tài)所必需的因子，這種特異性表達于腫瘤細(xì)胞和腫瘤脈管系統(tǒng)的能力使得TEM8更具治療的潛力。TEM8、VEGF促進前列腺癌進展的分子機制及兩者是否存在相關(guān)信號通路仍有待研究和證實。

本實驗通過檢測TEM8、VEGF在不同分期和分級的前列腺癌組織中的差異性表達，試圖探討兩者在前列腺癌中的臨床病理學(xué)意義。結(jié)果顯示，TEM8、VEGF的表達與前列腺癌組織的TNM分期以及骨轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，由此推斷TEM8、VEGF可能在前列腺癌的發(fā)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用。TEM8和VEGF的表達有明顯的相關(guān)性，提示兩者可能在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮協(xié)同作用。因此，TEM8、VEGF有望成為前列腺癌靶向治療的新靶點。