李巧稚，王婭菲

子宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤，全球每年約50萬新發(fā)病例，其中80%患者來自發(fā)展中國家[1]。高危型人乳頭狀瘤病毒(human papillomavirus, HPV)持續(xù)感染導致子宮頸上皮基因表達異常，促使細胞轉化為癌性表型。有研究發(fā)現(xiàn)HPV相關口咽鱗癌中病毒DNA與癌細胞基因整合，在腫瘤細胞周圍形成特殊微環(huán)境，使腫瘤細胞發(fā)生免疫逃逸，而周圍病毒基因缺失的黏膜上皮間質中細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)及細胞因子未見異常，由此認為病毒整合的腫瘤細胞是免疫抑制的主要目標[2]。共刺激分子是T(或B)細胞完全活化提供共刺激信號的細胞表面分子及其配體，是微生物的產(chǎn)物或固有免疫針對微生物的應答成分。其中較為重要的共刺激分子是B7-1和B7-2、B7-H1和B7-H2。B7-H1又稱為程序性死亡配體-1(programmed death ligand-1, PD-L1)，是上皮細胞異常表達的免疫調(diào)節(jié)分子，CTL的PD-1受體與腫瘤細胞表面B7-H1結合，促使T淋巴細胞發(fā)生凋亡，使腫瘤細胞逃避CTL的攻擊[3]。研究表明B7-H1除廣泛低表達于抗原呈遞細胞、非造血細胞和免疫豁免部位如胎盤、睪丸等正常組織細胞中[4]，在各種實體腫瘤中高表達[5-6]。研究已證實高危型HPV感染與子宮頸鱗癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關[7-8]。本文擬通過檢測HPV16 E6 mRNA在不同子宮頸細胞系中的含量和高危型HPV16在子宮頸病變患者的感染率、B7-H1蛋白在細胞系和子宮頸病變組織中的表達，分析B7-H1在子宮頸病變演進過程中的作用及與高危型HPV16感染的關系。

1 材料與方法

1.1 細胞系及臨床病理資料轉染HPV16 E6基因的正常子宮頸上皮細胞(H8細胞)系、人類永生化表皮細胞(HaCat)系、子宮頸癌細胞[SiHa(HPV16感染)、Caski(HPV16、18共同感染)和HeLa細胞(HPV18感染)]系均由李官成教授(中南大學腫瘤研究所)惠贈。收集廣東省佛山市南海區(qū)第五人民醫(yī)院病理科存檔的子宮頸病變組織149例?；颊吣挲g25～70歲，平均43.5歲，其中慢性子宮頸炎25例，低級別子宮頸上皮內(nèi)病變(cervical intraepithelia neoplasia, CIN)Ⅰ 31例，高級別CIN(CIN Ⅱ～Ⅲ、原位癌)33例，子宮頸鱗癌60例(包括30例高分化鱗癌，30例中、低分化鱗癌)。石蠟包埋標本均經(jīng)病理檢查明確診斷。

1.2 方法

1.2.1qRT-PCR法 5種細胞系的細胞培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，用含10%胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，當細胞融合80%～90%時，用胰酶消化、離心，利用TRIzol提取法提取細胞中總RNA(RPMI 1640培養(yǎng)基和新生小牛血清、胰蛋白酶、TRIzol均購自美國Invitrogen公司)，測定RNA的濃度、純度，進行cDNA的制備，其中所需逆轉錄試劑盒、Taq DNA聚合酶及dNTP購自美國Fermentas公司，DNA提取試劑盒購自德國Qiagen公司。利用Primer 5.0軟件對HPV16 E6序列進行設計，引物由上海生物工程公司合成：HPV16 E6上游引物序列：5′-CCACCCAGAAAGTTACCACA-3′，下游引物序列：5′-TGCAACAAGACATACATCGA-3′；β-actin上游引物序列；5′-CTACGAGCTGCCTG ACG-3′，下游引物序列：5′-CCTAGAAGCATTTGCG GTGG-3′。熒光定量PCR儀(美國Eppendorf公司)進行qRT-PCR擴增，具體條件：95 ℃預變性1 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸35 s，72 ℃終延伸10 min，重復35個循環(huán)。采用2-△△Ct法進行目的基因，即HPV16 E6 mRNA的定量分析。

1.2.25種細胞系中B7-H1蛋白含量的檢測 按“1.2.1”方法培養(yǎng)細胞，當細胞融合達80%～90%時，提取細胞蛋白，用BCA法測定蛋白濃度。采用Western blot法檢測5種細胞系中B7-H1蛋白表達量，一抗B7-H1單克隆抗體(美國Abcam公司，稀釋比1 ∶500)，二抗(美國Cell Signaling公司，稀釋比1 ∶2 000)。反應結束后采用超敏型ECL化學發(fā)光底物試劑盒(上海炎熙生物公司)曝光、全自動化學發(fā)光免疫分析儀(美國Beckman公司)顯影，以β-actin為內(nèi)參，采用Image J軟件對蛋白條帶進行半定量分析，比較5種細胞系中B7-H1的蛋白含量。

1.2.3雜交捕獲-化學發(fā)光法 HPV16 DNA標本高溫水浴1 h變性后，取75 μL轉移至相應的雜交微孔板，震蕩孵育1 h，將雜交微孔板的液體轉移至捕獲微孔板對應的孔中，室溫條件下震蕩1 h；將捕獲微孔板加入檢測試劑孵育45 min，移除捕獲微孔板中的檢查試劑，洗滌6次后拍干；在捕獲微孔板中加入底物試劑，在避光條件下孵育15 min，在化學發(fā)光免疫分析儀上讀數(shù)，檢測HPV16型核酸，檢測Cut off值為1 pg/mL。檢測結果以樣本測量值/參考值的比值表示，比值≥1.0，結果為“陽性”；比值<1.0，結果為“陰性”。

1.2.4免疫組化 免疫組化SP試劑盒及DAB顯色劑購自福州邁新公司，采用免疫組化SP法檢測子宮頸各組織中B7-H1的表達，B7-H1一抗?jié)舛葹? ∶500，生物素標記二抗工作液37 ℃恒溫箱孵育1 h，DAB顯色、蘇木精復染，脫水、透明封固。由兩位病理醫(yī)師采用雙盲法獨立閱片。

1.3 結果判斷按陽性細胞所占比例進行評分[9]：陽性細胞數(shù)≤10%為0分、11%～25%為1分、26%～50%為2分、51%～75%為3分、>75%為4分；按細胞染色強度進行評分：淺黃色為1分、黃色為2分、深黃或棕褐色為3分；將兩項得分結果相乘：≤6分為低表達，>6分為高表達。

2 結果

2.1 HPV16 E6 mRNA在5種子宮頸細胞系中的表達qRT-PCR檢測結果顯示，HPV16 E6 mRNA在5種細胞系中的表達差異有統(tǒng)計學意義(F=144.334，P<0.001)；組間比較顯示，HPV16 E6 mRNA在轉染HPV16 E6基因而永生化的正常子宮頸上皮細胞系H8細胞中表達最高(P<0.05)；在Caski、SiHa細胞系中表達也增高，與正常子宮頸細胞HaCat比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而HPV18型感染的Hella細胞不表達HPV16 E6 mRNA(圖1)。

圖1 HPV16 E6 mRNA的相對表達量：與HaCat比較，*P<0.05

2.2 Western blot法檢測細胞中B7-H1蛋白的表達Western blot法檢測結果顯示，B7-H1蛋白在Hella細胞中表達最強，在Caski、SiHa和H8中均有表達，且高于HaCat細胞(P<0.01，圖2)。

圖2 B7-H1蛋白在子宮頸細胞系中的表達：A.B7-H1蛋白的相對表達；B.Western bolt法檢測B7-H1的表達；與HaCat比較，*P<0.01；1.Hella細胞；2.Caski細胞；3.SiHa細胞；4.H8細胞；5.HaCat細胞；β-actin.樣本內(nèi)參

2.3 子宮頸病變組織中B7-H1的表達及HPV16的感染率免疫組化結果顯示，B7-H1陽性定位于上皮胞質和胞膜，部分淋巴細胞陽性(圖3)。B7-H1在慢性子宮頸炎組織、CIN和子宮頸鱗癌上皮組織中的陽性率呈遞增趨勢，分別為28.0%、59.4%和80.0%，各組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。高危型HPV16感染率在慢性子宮頸炎、CIN和子宮頸鱗癌組織中的陽性率逐漸增高，分別為20.0%、48.4%和85.0%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，表1)。

表1 各子宮頸病變組織中B7-H1的表達和HPV16的感染情況[n(%)]

圖3 B7-H1在子宮頸病變組織中的表達：A.HPV陰性慢性子宮頸炎組織呈陰性；B.HPV陽性慢性子宮頸炎組織中呈陽性；C.CINⅢ組織中呈陽性，定位于細胞質；D.子宮頸鱗癌組織中陽性，定位于細胞質和間質淋巴細胞，SP法

2.4 B7-H1的表達和HPV16的感染與子宮頸鱗癌臨床病理特征的關系本組結果顯示：B7-H1與子宮頸分化程度密切相關，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；但與臨床分期和淋巴結轉移無相關性。HPV16感染與子宮頸鱗癌的分化程度和臨床分期有相關性(P<0.05，表2)。

表2 子宮頸鱗癌中B7-H1的表達和HPV16的感染與臨床病理特征的關系[n(%)]

2.5 CIN和子宮頸鱗癌中B7-H1表達與HPV16感染的關系64例CIN組織中B7-H1表達與HPV16感染共陽性者30例，共陰性者13例；B7-H1表達與HPV16感染有相關性(r=0.726，P<0.01)；60例子宮頸鱗癌組織中B7-H1表達與HPV16共陽性者42例，共陰性者10例(r=0.773，P<0.01)。B7-H1表達與HPV16感染有相關性(表3)。

表3 CIN和子宮頸鱗癌中B7-H1表達與HPV16感染的關系[n(%)]

3 討論

子宮頸癌是病因較為明確的女性惡性腫瘤，其致癌環(huán)節(jié)為高危型HPV E6/E7原癌基因整合至宿主細胞DNA中，E6蛋白作用于p53基因，E7蛋白與Rb基因相結合，p53和Rb基因功能喪失使細胞凋亡受抑制，細胞發(fā)生異常增生，同時引發(fā)多途徑生物信號通路及相關蛋白表達異常[10]。本組qRT-PCR結果顯示，HPV16 E6 mRNA在轉染HPV16 E6基因而永生化的正常子宮頸上皮細胞系H8細胞中表達最高，在Caski及SiHa細胞系中表達明顯增高，在HPV18型感染的Hella細胞中不表達HPV E6 mRNA，證實H8、Caski及SiHa細胞系中，確實存在HPV16 E6的表達。

B7-H1是PD-1的配體，研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞高表達B7-H1分子，通過PD-1途徑誘導免疫細胞凋亡，使免疫細胞失去對腫瘤的殺傷作用，因此B7-H1/PD-L1信號途徑在腫瘤免疫逃逸及維持外周組織免疫耐受中起關鍵作用[11-12]。本實驗Western blot法檢測結果顯示，B7-H1在HPV18型感染的Hella細胞中表達最強，在SiHa、Caski和H8均有表達，在HaCat中表達缺失，B7-H1蛋白在腫瘤細胞系的表達，與正常細胞HaCat比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；提示B7-H1表達水平的差異與細胞整合HPV16、18狀態(tài)有關。在機體子宮頸病變過程中，HPV16 E6、E7作為癌基因與p53、Rb等多種異常蛋白協(xié)同引發(fā)致癌效應，當細胞脫離活體組織致瘤微環(huán)境時，高危型HPV相關癌蛋白可作為刺激因子引起B(yǎng)7-H1表達；在SiHa(HPV16感染)和Caski(HPV16、18共感染)子宮頸癌細胞系中，B7-H1表達量明顯增高，提示高危型HPV感染及其異常蛋白的協(xié)同可能是B7-H1高表達的原因之一。H8是轉染HPV16 E6基因的正常子宮頸鱗狀上皮細胞系，B7-H1在H8中高表達，提示細胞在感染并整合高危型HPV E6或E7基因初期就能引起B(yǎng)7-H1的高表達，以此逃避機體免疫監(jiān)視，為HPV的持續(xù)感染創(chuàng)造條件。

另外，本組對B7-H1在子宮頸慢性炎、CIN和子宮頸鱗癌組織進行免疫組化檢測，結果發(fā)現(xiàn)B7-H1在高危型HPV16陽性慢性子宮頸炎上皮組織、CIN和子宮頸鱗癌組織中表達，且與子宮頸鱗癌分化程度有關(P<0.01)，與臨床分期和淋巴結轉移無關(P>0.05)。此外，B7-H1在子宮頸鱗癌間質內(nèi)也有散在細胞表達。B7-H1在無HPV16感染的慢性子宮頸炎上皮組織中不表達，但在感染高危型HPV的慢性子宮頸炎上皮組織中表達明顯增高。同時B7-H1在慢性子宮頸炎、CIN和子宮頸鱗癌組織中與高危型HPV16感染密切相關(P<0.01)。B7-H1/PD-1信號通路激活使CTL凋亡或功能失調(diào)，失去對病變細胞的殺傷作用[13]。人抗腫瘤免疫機制中，CTL介導的細胞免疫發(fā)揮非常重要的作用，被激活的CTL通過T細胞受體(T cell receptor, TCR)與腫瘤特異性抗原識別釋放各種因子(顆粒酶、穿孔素等)以殺傷腫瘤細胞[14]。以上結果提示，B7-H1是子宮頸鱗癌發(fā)生的早期事件，在高危型HPV陽性病變組織中，持續(xù)的病毒刺激促使B7-H1不斷表達，而B7-H1在HPV感染初期表達有利于病變細胞發(fā)生免疫逃逸，并引發(fā)病毒誘導的惡性轉化。Lyford-Pike等[15]在HPV相關口咽上皮腫瘤中發(fā)現(xiàn)B7-H1在細菌病毒易感染的扁桃體內(nèi)陷隱窩深部的鱗狀上皮處高表達，在靠近腔面的上皮不表達，提示組織深部的隱窩上皮相對于表面上皮具有不同的免疫微環(huán)境，也是病毒相關腫瘤的起始部位；這與本組B7-H1在部分HPV陽性的慢性子宮頸炎組織中表達結果一致。本實驗發(fā)現(xiàn)低分化子宮頸鱗癌中B7-H1表達明顯增高，提示B7-H1在低分化腫瘤中高表達可能與抑制淋巴細胞浸潤，拮抗免疫因子的分泌，促使腫瘤細胞異質性轉化，導致病情惡化有關。

研究發(fā)現(xiàn)B7-H1在胃癌[16]、乳腺癌[17]、卵巢癌[18]、肺癌[19]等多種腫瘤細胞中高表達，同時PD-1在間質T淋巴細胞中高表達，激活B7-H1/PD-1能增強腫瘤免疫反應共抑制信號，同時抑制腫瘤患者的T細胞活性，不能有效分泌各種殺傷性細胞因子，使腫瘤細胞發(fā)生免疫逃逸，促使腫瘤的生長、侵襲和轉移[20]?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)在體外阻斷肝癌微環(huán)境中B7-H1/PD-1抑制途徑，可以恢復T細胞增殖活性，促進細胞因子分泌，使T細胞的功能逆轉[21]。本組結果顯示，B7-H1在高危型HPV陽性的子宮頸細胞系及子宮頸病變組織中高表達，提示高危型HPV及其相關蛋白可能是引起B(yǎng)7-H1蛋白表達的關鍵因素，同時B7-H1/PD-1信號通路被激活，抑制CTL對病變細胞的殺傷是HPV持續(xù)感染的因素之一。子宮頸腫瘤間質中存在大量與免疫有關的細胞，腫瘤的治療不僅要針對腫瘤細胞，還需提高腫瘤微環(huán)境中免疫細胞的功能，子宮頸鱗癌中B7-H1/PD-1介導的腫瘤免疫逃逸機制值得我們進一步分析。