張鈺，李煒華，蔡杰，杜海林，何曉露，傅強，戴宇東，何成濤(.南京紅十字血液中心研究室，南京0000；.宿遷市中心血站質(zhì)管科，宿遷3800)

ABO血型系統(tǒng)是人類最主要的血型系統(tǒng)之一[1]，ABO血型不合的輸血會導致嚴重的輸血反應及其他并發(fā)癥。因此，ABO血型的準確分型對于安全輸血至關(guān)重要[2]。除了A、B、AB、O等正常的ABO表型外，還有一些罕見的亞型[3]。B(A)是一種較為罕見的ABO亞型，其可能是由于底物特異性的酶轉(zhuǎn)變所導致[4]。其血清學的特點主要是正定型紅細胞與抗B出現(xiàn)強凝集反應，與抗A出現(xiàn)弱凝集反應，反定型血清能夠凝集A1和A2細胞[5-6]。在血清學分型中，B(A)常與CisAB、AxB等發(fā)生混淆，分子生物學技術(shù)則可以幫助區(qū)分各種亞型。本研究使用血型血清學和分子生物學的方法檢測了1例正反定型不符的標本，最后鑒定其為B(A)04/O01，報道如下。

1 材料與方法

1.1樣本來源 2020年1月19日1例自愿無償獻血的21歲男性血液標本。

1.2試劑與儀器 單克隆抗A、抗B、抗H、抗A1、A1細胞、A2細胞、B細胞、O細胞、抗篩細胞(O1、O2、O3)試劑(上海血液生物醫(yī)藥公司)，抗AB(Rapid Labs公司)，凝聚胺試劑盒(合肥天一生物技術(shù)研究所公司)，抗人球蛋白檢測卡(長春博迅生物技術(shù)公司)，血液基因組DNA提取試劑盒(德國QIAGEN公司)，人類紅細胞ABO血型基因分型試劑盒(天津秀鵬公司)，實驗所有試劑均檢驗合格，按要求保存并在有效期內(nèi)使用。

免疫微柱孵育器、血型血清學離心機(長春博研科學儀器公司)，低速全自動離心機(日本Kubota公司)，離心機(德國SIGMA公司)，核酸蛋白定量檢測儀(德國Eppendorf公司)，基因擴增儀(美國ABI公司)，凝膠成像儀(上海復日科技公司)。

1.3方法

1.3.1血型血清學試驗 參照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》第4版及各試劑說明書用試管法進行血型血清學試驗。

1.3.2分子生物學試驗

1.3.2.1基因組DNA的提取 采用商品試劑盒并嚴格按照試劑盒說明書快速提取DNA，DNA濃度調(diào)為30～100 ng/μL，DNA純度A260 nm/A280 nm值為1.6～2.0，25 g/L瓊脂糖凝膠電泳顯示無DNA降解現(xiàn)象。

1.3.2.2PCR-SSP基因分型 嚴格按照人類紅細胞ABO血型基因分型試劑盒進行操作。按照以下循環(huán)參數(shù)進行PCR擴增：96 ℃ 2 min，1個循環(huán)；96 ℃ 20 s，68 ℃ 60 s，5個循環(huán)；96 ℃ 20 s，65 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，10個循環(huán)；96 ℃ 20 s，62 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，15個循環(huán)；72 ℃ 3 min，1個循環(huán)。凝膠電泳：PCR產(chǎn)物經(jīng)25 g/L瓊脂糖凝膠、140～150 V電泳10～15 min，凝膠成像儀拍照并觀察結(jié)果。

1.3.2.3標本ABO基因測序 采用直接測序法對標本ABO血型基因1～7外顯子進行測序，由天津秀鵬公司完成。PCR產(chǎn)物純化：在每個反應管每孔中加入3 μL ExoSAP-IT(ExonucleaseⅠ和Shrimp Alkaline Phosphatase的混合溶液)，以去除多余的PCR引物和底物dNTPs。低速離心混合溶液后，運行以下熱循環(huán)程序：37 ℃ 3 min，80 ℃ 15 min，1個循環(huán)。測序反應：純化的PCR產(chǎn)物用作測序反應DNA模板。采用20 μL反應體系，內(nèi)含：16 μL BigDye terminator v3.1 sequencing Kit提供的測序反應混合液和4 μL經(jīng)ExoSAP-IT處理的PCR產(chǎn)物。測序反應擴增條件：96 ℃ 20 s，50 ℃ 30 s，60 ℃ 2 min，25個循環(huán)。

2 結(jié)果

2.1血型血清學結(jié)果 血型血清學反應格局見表1、2。正定型中紅細胞與抗A發(fā)生較弱凝集(±)，與抗B發(fā)生強凝集(4+)，反定型血清能夠凝集A1細胞(1+)和A2細胞(1+w)；血清中無不規(guī)則抗體的存在；紅細胞與抗H的反應強度(3+)接近正常的O型紅細胞(3+s)而高于正常的B型紅細胞(2+)。

表1 血型血清學檢測

表2 抗H與P細胞、DO細胞、DB細胞反應結(jié)果

2.2PCR-SSP結(jié)果 見圖1。第7、10、11、12孔位呈陽性反應，其余孔位呈陰性反應。

注：1～14泳道分別為Cis-AB01、Cis-AB01/B(A)01、B(A)01/B(A)03、Cis-AB02、B(A)02、Cis-AB03、B(A)04、B(A)06、Cis-AB04、B1、B2、O1、O2、陰性對照。

2.3ABO基因測序結(jié)果 見圖2、3。根據(jù)NCBI網(wǎng)站血型抗原基因突變數(shù)據(jù)庫(以A101為參考序列)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)第6外顯子261處缺失G，297處出現(xiàn)A/G突變。外顯子7的突變有526C>G、640A>G、657C>T、703G>A、796C>A、803G>C、930G>A。

3 討論

B(A)血型最早是1956年由Yamamoto等[7]發(fā)現(xiàn)，是一種較為罕見的ABO亞型。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)6種B(A)等位基因，分別為B(A)01、B(A)02、B(A)03、B(A)04、B(A)05、B(A)06，其中B(A)02和B(A)04在我國最為常見[8]。B(A)血型的形成主要是由于B基因的特定突變，變異的B基因具有編碼雙功能活性酶的能力，使血清學中有正常B抗原和較弱A抗原的特征，因為關(guān)鍵位點的突變及其引起的單個氨基酸的改變，從而改變了糖基轉(zhuǎn)移酶的酶學特點和催化活性，使相同的底物被催化形成不同的產(chǎn)物[9]。

本研究分析了1例正反定型不符的獻血者標本，血型血清學結(jié)果發(fā)現(xiàn)其紅細胞可以凝集抗A和抗B(與抗B的凝集強度強于抗A)，與抗H反應的凝集強度接近O細胞而強于B細胞，反定型血清能凝集A1細胞和A2細胞。因此根據(jù)血清學的結(jié)果，我們初步判定其為B(A)型。

目前，血型血清學的檢測是血型鑒定的主要方法，但是其只能對ABO亞型進行初步定型，還需借助分子生物學的方法對ABO亞型進行基因分型。因此我們使用了PCR-SSP方法進行檢測，檢測結(jié)果與分型表相比對，發(fā)現(xiàn)該樣本為B(A)04/O1雜合。為進一步證實PCR-SSP的結(jié)果，我們對標本DNA進行測序，ABO基因由7個外顯子和6個內(nèi)含子組成，其功能區(qū)域分別位于第6外顯子和第7外顯子中，而ABO等位基因和所有的亞型基因也主要分布在這個區(qū)域[10]。本研究測序結(jié)果顯示，第6外顯子中有1個單核苷酸缺失，即261delG，這與O01等位基因相一致[11]，第7外顯子存在526C>G、640A>G、657C>T、703G>A、796C>A、803G>C、930G>A的突變，第6、7外顯子的突變導致了5個氨基酸發(fā)生變化(Arg176Gly、Met214Val、Gly235Ser、Leu266Met、Gly268Ala)，從而形成了B(A)04等位基因。

圖2 外顯子6測序結(jié)果

圖3 外顯子7測序結(jié)果

綜上所述，本研究結(jié)合血型血清學和分子生物學的結(jié)果，判定該獻血者的血型為B(A)04/O01。在臨床實踐中，當出現(xiàn)正反定型不符的情況時，除進行必要的血清學檢測外，可結(jié)合分子生物學的方法進一步檢測，正確分析血型，避免出現(xiàn)誤檢或漏檢，以確保臨床輸血的安全性。