閆立志，張時民(.內(nèi)蒙古包鋼醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗科，包頭0400；.北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科，北京0003)

誘餌細胞(decoy cells)是腎小管上皮細胞或尿路上皮細胞感染多瘤病毒(Plyoma viru，PV)后出現(xiàn)特征性變化的細胞。該類細胞胞核明顯增大，可見核內(nèi)包涵體，胞核呈毛玻璃樣改變，容易被誤認為是腫瘤細胞，所以稱為“誘餌細胞”[1]。 腎移植術(shù)后長期服用免疫抑制劑增加了PV感染的風(fēng)險，當(dāng)感染PV后可以引起移植腎功能損傷，導(dǎo)致PV相關(guān)性腎病(Polyomavirus-associated nephropathy,PVAN)[2-3]。在機體內(nèi)PV也可以處于潛伏狀態(tài)，當(dāng)機體免疫力低下時迅速激活和復(fù)制，導(dǎo)致移植腎功能急劇下降甚至喪失[3,4-7]。 因此，檢測PV是預(yù)防PVAN的關(guān)鍵。人PV有10余種，其中最常見的是BK 病毒(BK virus，BKV)和JC病毒(JC virus,JCV)[8]。檢測PV的方法有很多，而檢測尿液中誘餌細胞是一種有價值且無創(chuàng)的篩選PVAN的方法[9]。誘餌細胞可以通過多種染色法檢出，活體染色法就是其中一種，沙黃-結(jié)晶紫(Sternheimer-Malbin，SM)染色法與阿利新藍-派洛寧(Sternheimer，S)染色法都是活體染色法，染色原理相同，可以使細胞快速著色，染色后的細胞結(jié)構(gòu)清晰，與背景色對比鮮明[10]。本研究收集大量病例，觀察SM染色法與S染色法2種活體染色法在尿液誘餌細胞檢測方面的性能。

1 材料和方法

1.1標(biāo)本及來源 收集2019年1月至2020年4月內(nèi)蒙古包鋼醫(yī)院106例腎移植患者尿液標(biāo)本，其中男74例，女32例，年齡17～65歲，患者均服用免疫抑制劑3個月以上。用潔凈的一次性尿沉渣管收集患者2份清潔中段尿液標(biāo)本各10 mL，其中一份用于鏡檢篩查誘餌細胞，另一份標(biāo)本在鏡檢誘餌細胞陽性時用于PV核酸檢測。

1.2儀器與試劑 ABI7500 PCR擴增儀(美國ABI公司)，Olympus BX43顯微鏡(日本奧林巴斯公司)，BKV、JCV核酸檢測試劑盒(北京鑫諾美迪公司)，SM染色液、S染色液(珠海BASO公司)。

1.3標(biāo)本處理及染色 將留取的10 mL尿液標(biāo)本以1 500 r/min離心5 min，棄去上清液，留0.2 mL尿沉渣，將尿沉渣充分混勻，取20 μL標(biāo)本滴加到載玻片，蓋一張蓋玻片，用普通光學(xué)顯微鏡檢查誘餌細胞。將剩余尿沉渣分成2管，按照標(biāo)本與染色液10∶1的比例，分別加入SM染色液和S染色液，用一次性吸管在管底輕輕混勻，染色時間1 min，取20 μL染色后標(biāo)本加至清潔載玻片上，蓋一張蓋玻片，用普通光學(xué)顯微鏡檢查誘餌細胞，并用數(shù)碼照相設(shè)備拍攝圖片。

1.4BKV、JCV核酸檢測 對發(fā)現(xiàn)誘餌細胞的尿液標(biāo)本進行BKV、JCV核酸檢測。將標(biāo)本顛倒混勻，振蕩15 s，取1 mL移至1.5 mL EP管中，13 000 r/min離心10 min后棄去上清液，加入50 μL裂解液，然后用吸頭將沉淀挑起，吹吸5次，提取核酸，再進行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件：UDG酶反應(yīng)，37 ℃，2 min；預(yù)變性，95 ℃，3 min；變性，94 ℃，15 s；退火、延伸、熒光信號采集，60 ℃，35 s，循環(huán)40次；儀器冷卻，25 ℃，1 min。結(jié)果分析：反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)PCR儀說明書及熒光曲線調(diào)整基線和閾值，基線的起始點設(shè)定在5～8之間，終止點設(shè)定在12～15之間，閾值線通常設(shè)定在1 000～5 000之間，分析各標(biāo)本的Ct值和相應(yīng)的初始濃度。

2 結(jié)果

2.1SM染色法鏡檢誘餌細胞的形態(tài)學(xué)特征 誘餌細胞體積明顯增大，胞體大小不一，形狀不規(guī)則，SM染色后胞質(zhì)為藍紫色，胞核紫紅色；胞質(zhì)量多少不一，呈粗顆粒狀，胞核大，明顯偏位，核膜增厚，核質(zhì)比偏高；核染色質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞，呈粗顆?；驂K狀，胞核呈空泡樣改變，部分細胞可見核內(nèi)病毒包涵體，少量細胞胞核脫出，僅見裸核。腎小管上皮細胞感染PV形成的誘餌細胞見圖1A～D，正常的腎小管上皮細胞見圖1E，未染色誘餌細胞見圖1F。

注：A，誘餌細胞體積大小不等，胞質(zhì)呈藍紫色，胞核呈紫紅色，可見包涵體顆粒；B，箭頭所指為誘餌細胞，胞體增大，胞核呈空泡樣改變，核膜明顯增厚；C，箭頭所指為誘餌細胞，胞體不完整，胞核明顯增大，可見核內(nèi)包涵體；D，雙核誘餌細胞，胞體增大，胞核呈氣球樣；E，正常腎小管上皮細胞，胞體不規(guī)則，體積偏小，胞質(zhì)紫紅色，胞核深紅色，呈顆粒狀；F，未染色誘餌細胞。

2.2S染色法鏡檢篩查誘餌細胞的形態(tài)學(xué)特征 誘餌細胞形態(tài)學(xué)特征同尿沉渣SM染色，胞質(zhì)和胞核著色略有不同，尿沉渣S染色后胞質(zhì)為紫紅色，胞核深藍色，包涵體顆粒呈深藍色。S染色后的細胞結(jié)構(gòu)更加清晰，顏色對比明顯。腎小管上皮細胞感染PV形成的誘餌細胞見圖2A～D，尿路上皮細胞感染PV發(fā)生形態(tài)學(xué)變化，見圖2E，正常的腎小管上皮細胞見圖2F。

注：A，誘餌細胞胞質(zhì)呈紫紅色，胞核深藍色；B，誘餌細胞胞核脫出，呈空泡樣，可見核內(nèi)包涵體；C，誘餌細胞核質(zhì)比明顯偏高，核膜增厚，可見核內(nèi)包涵體；D，誘餌細胞胞體增大，核膜明顯增厚；E，尿路上皮細胞感染PV，胞核增大，胞質(zhì)呈挖空樣；F，正常腎小管上皮細胞，體積小，胞質(zhì)呈紫紅色，胞核深藍色，染色質(zhì)呈顆粒狀。

2.3誘餌細胞檢查結(jié)果 在106例長期服用免疫抑制劑腎移植患者的尿液標(biāo)本中，用未染色直接鏡檢法檢出12例誘餌細胞，陽性率11.3%，而使用SM染色法或S染色法檢出21例誘餌細胞，陽性率19.8%。對21例尿液鏡檢出誘餌細胞的標(biāo)本，檢測BKV、JCV核酸共計20例，陽性符合率95.2%，其中BKV核酸陽性6例，占28.6%；JCV核酸陽性10例，占47.6%；BKV和JCV核酸同時陽性4例，占19.0%。

3 討論

未染色直接鏡檢法篩查誘餌細胞，細胞結(jié)構(gòu)不清，核內(nèi)包涵體不易觀察，容易漏檢?；铙w染色法最大的優(yōu)勢是染色后的細胞結(jié)構(gòu)清晰，保持細胞原有形態(tài)，不會因制片等因素造成細胞形態(tài)發(fā)生變化，而且操作簡單、染色快速，不易漏檢。本研究選用SM染色法和S染色法，通過實驗發(fā)現(xiàn)2種染色法誘餌細胞檢出率相同。在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，2種染色法易受尿液pH影響，染色后的細胞胞質(zhì)與胞核顏色略有差別。在尿液誘餌細胞分類過程中，部分病例中同時伴有吞噬細胞不同程度的增多。此外，部分病例尿路上皮細胞可見典型的“挖空”現(xiàn)象，這些細胞形態(tài)的改變，可能與PV感染相關(guān)。