楊銳創(chuàng)，胡燕，屈蒙蒙，畢京峰，高鴻雁，柴燕濤，孫慧偉，馮帆，王志杰，邢小燕，侯俊(.解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心臨床研究管理中心，北京0009；2.錦州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧錦州2000；.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所，北京009)

用流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測外周血淋巴細(xì)胞亞群已成為臨床常見的檢查項目。淋巴細(xì)胞亞群是監(jiān)測人體免疫功能的重要指標(biāo)，對于評價機(jī)體的免疫狀態(tài)、診斷與監(jiān)測器官移植及免疫病具有重要意義[1-2]。在實驗過程中，流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果可能受多種因素影響。因此，制定規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)化的操作流程對提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性很重要。以往對流式細(xì)胞儀檢測外周血淋巴細(xì)胞亞群影響因素的研究，多在于外周血標(biāo)本前處理過程中的保存時間、溫度、溶血素、刺激劑等[3-8]，而對染色后固定劑及固定時間對檢測結(jié)果的影響研究較少。樣本數(shù)量過多時，第一管和最后一管標(biāo)本檢測時間間隔過長，可能影響檢測結(jié)果，因此需要將染色后的細(xì)胞進(jìn)行固定，以確保檢測指標(biāo)的穩(wěn)定性。此外，標(biāo)本數(shù)量過少時，頻繁開關(guān)機(jī)會造成浪費，通常選擇對標(biāo)本固定后放置一段時間后統(tǒng)一檢測[9-10]。因此，本研究針對健康人群外周血標(biāo)本，選用臨床常用的細(xì)胞固定劑多聚甲醛(paraformaldehyde，PFA)[11]，分析細(xì)胞染色后不同濃度PFA及固定不同時間對流式細(xì)胞儀檢測淋巴細(xì)胞亞群結(jié)果的影響。

1 資料與方法

1.1一般資料 14份外周血標(biāo)本均來自健康捐獻(xiàn)者，其中男、女各7例，年齡26～38歲，平均32歲。采集健康捐獻(xiàn)者外周靜脈血5 mL，置于乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝管中，顛倒混勻后立即置于樣本運送箱中送至實驗室，1 h內(nèi)染色。

1.2儀器與試劑 所有單克隆抗體及鞘液均購自美國BD公司，抗體包括抗CD45-FITC、CD3-APC、CD4-BV421、CD8-PE、CD56-PE-Cy7和CD19-PerCP-Cy5.5抗體。紅細(xì)胞裂解液為自制NH4Cl裂解液，配制方法為8.3 g NH4Cl、1.0 g KHCO3、0.37 g Na4EDTA溶于800 mL蒸餾水中，以0.2 μm濾膜過濾，調(diào)整pH至7.3，用蒸餾水定容到1 000 mL，4 ℃保存待用。FACS Canto Ⅱ流式細(xì)胞儀、EDTA-K2抗凝管購自美國BD公司。PFA購自Sigma公司，1% PFA(10 g/L)和4% PFA(40 g/L)用0.1 mol/L磷酸鈉緩沖液(PBS，pH7.4)配制，4 ℃保存。

1.3方法 實驗分為1% PFA組、4% PFA組、PBS對照組。取EDTA-K2抗凝血100 μL加入Falcon管中，加入5 μL抗CD45-FITC、CD3-APC、CD4-BV421、CD8-PE、CD56-PE-Cy7和CD19-PerCP-Cy5.5抗體，同時設(shè)置陰性對照，室溫避光20 min。加入2 mL紅細(xì)胞裂解液，振蕩混勻，室溫避光5 min，待紅細(xì)胞完全溶解后，1 500 r/min離心5 min，棄上清液，再加2 mL PBS洗滌2次，棄上清液，最后加入500 μL 1% PFA或4% PFA固定細(xì)胞，對照組加入PBS，于4 ℃避光保存于0、4、8、12、24、48和72 h后上機(jī)檢測。利用前向角散射光(FSC)與側(cè)向角散射光(SSC)設(shè)門圈出淋巴細(xì)胞，再以CD45+設(shè)門圈出CD45+淋巴細(xì)胞，再以CD3、CD19設(shè)門圈出CD19-CD3+(T細(xì)胞)、CD3-CD19+(B細(xì)胞)，以CD3、CD4設(shè)門圈出CD3+CD4+(輔助/誘導(dǎo)細(xì)胞)，以CD3、CD8設(shè)門圈出CD3+CD8+(抑制/細(xì)胞毒細(xì)胞)，以CD3、CD56設(shè)門圈出CD3-CD56+(NK細(xì)胞)。BD FACSDiva軟件獲取數(shù)據(jù)，收集10 000～20 000個細(xì)胞，F(xiàn)lowjo10.0軟件分析數(shù)據(jù)，計算不同固定時間(0、4、8、12、24、48和72 h)后CD19-CD3+T、CD3+CD4+T、CD3+CD8+T、CD3-CD19+B、CD3-CD56+NK細(xì)胞占淋巴細(xì)胞百分比，及CD45、CD3、CD4、CD8、CD19、CD56的平均熒光強度(mean fluorescence intensity，MFI)。

2 結(jié)果

2.1PFA濃度對淋巴細(xì)胞亞群百分比的影響 流式數(shù)據(jù)的圈門策略和典型圖見圖1，細(xì)胞分群清晰，數(shù)據(jù)可用于后續(xù)分析。PFA濃度對淋巴細(xì)胞亞群百分比的影響見圖2。固定8 h后，PBS組出現(xiàn)細(xì)胞大量死亡，所以固定8 h后各時間點無PBS對照組結(jié)果。與PBS對照組相比，PFA固定0、4、8 h后CD19-CD3+T、CD3+CD4+T、CD3+CD8+T、CD3-CD19+B、CD3-CD56+NK細(xì)胞占淋巴細(xì)胞百分比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)；與1% PFA組相比，4% PFA組固定不同時間后淋巴細(xì)胞亞群百分比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。

2.2PFA固定時間對淋巴細(xì)胞亞群百分比的影響 見圖3。無論1% PFA或4% PFA，在0～72 h內(nèi)，固定不同時間CD19-CD3+T、CD3+CD4+T、CD3+CD8+T、CD3-CD19+B、CD3-CD56+NK細(xì)胞占淋巴細(xì)胞百分比與PBS組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測人外周血淋巴細(xì)胞亞群的圈門策略和典型圖

注：A～G，分別固定0、4、8、12、24、48、72 h。

注：A～E，分別為T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、NK細(xì)胞、B細(xì)胞。

2.3PFA濃度對淋巴細(xì)胞亞群MFI的影響 見圖4。0 h時檢測結(jié)果顯示，4% PFA組CD3、CD8的MFI低于PBS對照組(P<0.05)，CD45、CD4的MFI低于PBS對照組(P<0.01)；4% PFA組CD3、CD4、CD19的MFI低于1% PFA組(P<0.05)，CD45、CD8、CD56的MFI低于1% PFA組(P<0.01)。

固定4 h后，1% PFA組CD4的MFI低于PBS對照組(P<0.05)，4% PFA組CD3的MFI低于PBS對照組(P<0.05)，4% PFA組CD45、CD4、CD8的MFI低于PBS對照組(P<0.01)；與1% PFA組相比，4% PFA組CD3、CD19的MFI低于1% PFA組(P<0.05)，CD45、CD4、CD8、CD56低于1% PFA組(P<0.01)。

固定8 h后，1% PFA組CD4的MFI低于PBS對照組(P<0.01)，4% PFA組CD19的MFI低于PBS對照組(P<0.05)，4% PFA組CD45、CD3、CD4、CD8的MFI低于PBS對照組(P<0.01)；與1% PFA組相比，4% PFA組CD3、CD8、CD19和CD56的MFI低于1% PFA組(P<0.05)，CD45、CD4的MFI低于1% PFA組(P<0.01)。

固定12 h和24 h后，4% PFA組CD3、CD19、CD56的MFI低于1% PFA組(P<0.05)，CD45、CD4、CD8的MFI低于1% PFA組(P<0.01)。固定48 h后，4% PFA組CD3的MFI低于1% PFA組(P<0.05)，CD45、CD4、CD8、CD56的MFI低于1% PFA組(P<0.01)。固定72 h后，4% PFA組CD3的MFI低于1% PFA組(P<0.05)，CD45、CD4、CD8的MFI低于1% PFA組(P<0.01)。

以上結(jié)果提示，PFA濃度對淋巴細(xì)胞亞群MFI有影響，PFA固定后MFI下降。固定8 h內(nèi)，PBS對MFI結(jié)果無影響，1% PFA組CD4的MFI下降，4% PFA組CD45、CD3、CD4、CD8的MFI均下降。在72 h的各個觀察時間點內(nèi)，4% PFA組各淋巴細(xì)胞亞群的MFI均低于1% PFA組。

注：A～G，分別固定0、4、8、12、24、48、72 h;*，P<0.05；**，P<0.01。

2.4PFA固定時間對淋巴細(xì)胞亞群MFI的影響 見圖5。固定24 h后的各個時間點，1% PFA組與4% PFA組CD3、CD4、CD8、CD19、CD56和CD45的MFI均下降；尤其CD4的MFI變化較大，1% PFA固定24 h后降低，而4% PFA組在固定4 h后即出現(xiàn)下降趨勢。

注：A～F，抗體分別為CD3-APC、CD4-BV421、CD8-PE、CD19-perCP-Cy5.5、CD56-PE-Cy7、CD45-FITC。

3 討論

臨床上常用流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血淋巴細(xì)胞亞群，以評估患者機(jī)體的免疫狀態(tài)。為避免染色后放置時間過長而導(dǎo)致細(xì)胞破碎和抗體熒光淬滅，實際操作中常使用細(xì)胞固定劑固定后再上機(jī)檢測。目前，細(xì)胞樣本常用的交聯(lián)劑為PFA，其固定細(xì)胞標(biāo)本不僅可以使檢測結(jié)果接近細(xì)胞表面抗原的真實分布，同時也能延長標(biāo)本的保存時間。但由于PFA穿透力強，隨著甲醛交聯(lián)蛋白的增加，蛋白質(zhì)苯環(huán)結(jié)構(gòu)上的抗原決定簇的改變有可能降低抗原的敏感性。馮霞等[12]用PFA固定處理人外周血白細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測時發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞表面的P-gp糖蛋白表達(dá)降低。孫棟棟等[13]用流式細(xì)胞術(shù)檢測HepG2細(xì)胞表面整合素αVβ3，2% PFA固定處理后MFI和陽性細(xì)胞率均降低，提示PFA固定可能影響細(xì)胞表面抗原抗體的結(jié)合。劉云等[14]以小鼠脾淋巴細(xì)胞為研究對象，分析2% PFA固定時間對流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠脾淋巴細(xì)胞CD3+及CD4+細(xì)胞亞群的百分比與MFI的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2% PFA固定24 h后，CD3+、CD4+細(xì)胞的MFI降低，但細(xì)胞百分比沒有明顯變化；提示PFA固定時間對抗原表達(dá)較強的MFI的影響比其細(xì)胞百分比的影響更大。因此，PFA固定濃度、固定時間對抗原結(jié)構(gòu)有無影響尚待進(jìn)一步研究。

本研究通過對比1%和4%濃度PFA，從0～72 h固定不同時間，F(xiàn)CM檢測外周血標(biāo)本的淋巴細(xì)胞亞群百分比及MFI，結(jié)果提示在72 h內(nèi)，PFA濃度及固定時間對外周血淋巴細(xì)胞亞群百分比結(jié)果沒有明顯影響，該發(fā)現(xiàn)與文獻(xiàn)[14]報道一致，進(jìn)一步證實了對與表達(dá)較強的抗原，PFA固定后對抗原表達(dá)陽性的細(xì)胞百分比影響不大。但PFA固定濃度對淋巴細(xì)胞亞群MFI有明顯影響，4% PFA固定后淋巴細(xì)胞亞群的MFI低于1% PFA固定的樣本，且隨著固定時間的延長進(jìn)一步降低。本研究結(jié)果提示1% PFA對外周血淋巴細(xì)胞CD3、CD4、CD8陽性細(xì)胞百分比及MFI的影響較小。

綜上所述，流式細(xì)胞術(shù)檢測人外周血淋巴細(xì)胞亞群，8 h內(nèi)檢測用PBS進(jìn)行細(xì)胞重懸檢測效果最好。細(xì)胞染色后若不能立即上機(jī)檢測，可用1% PFA固定后4 ℃避光保存，建議存放時間不超過12 h。