戎亦驪，潘永明，黃俊杰，郁 晨，朱科燕，陳民利

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心/比較醫(yī)學(xué)研究所，杭州 310053)

近幾十年來(lái)，兒童和青少年中超重和肥胖的患病率呈逐年上升趨勢(shì)。流行病學(xué)調(diào)查顯示，兒童期或青少年期肥胖增加是成年人2型糖尿病、心血管疾病、高血壓、哮喘等疾病發(fā)展的重要危險(xiǎn)因素[1]。可見(jiàn)，當(dāng)前肥胖的流行是重要的社會(huì)公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。近來(lái)發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)脂肪分布和受損的脂肪組織功能可用于預(yù)測(cè)個(gè)體出現(xiàn)胰島素抵抗(insulin resistance, IR)和相關(guān)并發(fā)癥[2]，故體內(nèi)脂肪分布可能比機(jī)體的全身肥胖更為重要。內(nèi)臟脂肪已成為代謝功能障礙的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，內(nèi)臟脂肪組織中巨噬細(xì)胞過(guò)量產(chǎn)生的促炎性細(xì)胞因子被認(rèn)為是肥胖相關(guān)的脂肪組織炎癥的關(guān)鍵，并導(dǎo)致IR的發(fā)生[3]。

沉默信息調(diào)節(jié)因子1(sirtuin1, Sirt1)是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依賴的去乙?；?，參與多種基因轉(zhuǎn)錄、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期等過(guò)程，與肝臟中的脂肪酸氧化、下丘腦的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用以及代謝綜合征的保護(hù)有關(guān)[4]。Sirt1在白色脂肪組織中表達(dá)，并通過(guò)影響過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ, PPARγ)的轉(zhuǎn)錄活性來(lái)調(diào)節(jié)脂肪形成，在Sirt1過(guò)表達(dá)或敲除的3T3-L1細(xì)胞中，脂肪形成分別減弱或增強(qiáng)[5]。最近發(fā)現(xiàn)，人體Sirt1基因在脂肪組織中高表達(dá)可以防止老化導(dǎo)致的胰島素敏感性下降。此外，脂肪Sirt1基因敲除的小鼠在高脂環(huán)境下表現(xiàn)出嚴(yán)重的葡萄糖耐受以及胰島素抵抗癥狀，提示脂肪組織Sirt1是維持機(jī)體能量平衡及胰島素敏感性的關(guān)鍵基因[6]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，西藏小型豬高脂誘導(dǎo)后產(chǎn)生明顯的肥胖、IR以及心血管代謝的紊亂[7]，這些改變是否與內(nèi)臟脂肪組織中Sirt1的調(diào)控變化有關(guān)，進(jìn)而促進(jìn)高脂誘導(dǎo)的西藏小型豬肥胖和IR的發(fā)生？為此，本文選取青年期的西藏小型豬，采用高脂飲食16周以誘導(dǎo)肥胖模型，觀察Sirt1途徑在內(nèi)臟脂肪組織中的表達(dá)調(diào)控情況，探討Sirt1與西藏小型豬肥胖和IR的聯(lián)系，為研究青少年肥胖及其并發(fā)癥的發(fā)生機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物

自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SCXK(粵)2011-0015】選購(gòu)普通級(jí)4～5月齡雄性西藏小型豬12只，體重10～14 kg左右，并飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心普通級(jí)實(shí)驗(yàn)室【SYXK(浙)2013-0184】，環(huán)境溫度控制在(22±1)℃，相對(duì)濕度控制在45%～65%。每天兩次飼喂全價(jià)營(yíng)養(yǎng)飼料并給予飲水自由，光照為12 h/12 h明暗交替。試驗(yàn)期間，所有小型豬遵照3R原則給予人道主義關(guān)懷，福利倫理審查號(hào)：ZLL-2016-128。

1.2 主要儀器和試劑

總膽固醇(total cholesterol, TC)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol, HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C)試劑盒(上海申能德賽診斷技術(shù)有限公司)；RNA提取試劑盒(RNAiso Plus)、熒光定量試劑盒(SYBR Premix Ex TaqTMII)購(gòu)自日本TaKaRa公司；總蛋白提取及含量測(cè)定試劑盒(凱基生物有限公司)；NanoDrop2000(美國(guó)Thermo公司)、DNA Engine儀(美國(guó)Bio-Rad 公司)、Steponeplus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)、CLx紅外熒光掃描成像系統(tǒng)(美國(guó)Odyssey公司)、7020全自動(dòng)生化分析儀及ASP 200S 封閉式組織自動(dòng)脫水機(jī)、RM2245 型石蠟切片機(jī)(日本日立公司)、ThermoVarioskan Flash連續(xù)光譜酶標(biāo)儀(芬蘭Thermo Fisher 公司；Nanozoomer S210全自動(dòng)病理掃描切片儀(日本濱松光子公司)。

1.3 造模方法

12只西藏小型豬適應(yīng)性飼養(yǎng)4周后，隨機(jī)分成兩組，即正常對(duì)照組(normal control group, NC)和高脂模型組(high fat/cholesterol diet group，HFC)，每組6只。高脂飼料配方為73.5%基礎(chǔ)飼料、1.5%膽固醇、10%蛋黃粉及15%油脂。造模方法參考潘永明[6]等文獻(xiàn)，造模16周后安樂(lè)死各組動(dòng)物，取樣進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 表型特征與生化指標(biāo)測(cè)定

經(jīng)過(guò)16周造模處理后，所有小型豬禁食12 h 后進(jìn)行稱重并測(cè)量體長(zhǎng)(體長(zhǎng)測(cè)量方法為兩耳中間至尾根部的長(zhǎng)度)，用以計(jì)算身體質(zhì)量指數(shù)，即體重(kg)/體長(zhǎng)(m2)；安樂(lè)死后采集內(nèi)臟脂肪組織并稱重，計(jì)算內(nèi)臟脂肪率，即內(nèi)臟脂肪重量(kg)/體重(kg)×100%；每只動(dòng)物采集抗凝血3 ml，分離血漿并測(cè)定TC、LDL-C及HDL-C含量，計(jì)算動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)AI=(TC-HDL-C)/HDL-C。

1.5 糖耐量試驗(yàn)

造模16周時(shí)對(duì)小型豬進(jìn)行糖耐量試驗(yàn)。具體方法如下，經(jīng)3 d的吊床適應(yīng)訓(xùn)練后，用2%～3%異氟烷誘導(dǎo)吸入麻醉，在右耳皮下靜脈建立靜脈通路；為減少麻醉的影響，于恢復(fù)3 h后開(kāi)始試驗(yàn)；向耳緣靜脈內(nèi)注射0.5 g/kg的葡萄糖注射液，分別在給糖前(0 min)、給糖后5 min、15 min、30 min、60 min、90 min、120 min時(shí)從靜脈通路內(nèi)取血，測(cè)量血糖變化；同時(shí)測(cè)量胰島素水平，計(jì)算血糖和胰島素曲線AUC面積。

1.6 RT-PCR法檢測(cè)內(nèi)臟脂肪組織中Sirt1及下游相關(guān)因子mRNA表達(dá)水平

取脂肪組織于液氮中磨碎，利用Trizol法提取組織中的總RNA，于Nanodrop上測(cè)定RNA濃度，利用逆轉(zhuǎn)錄法獲得cDNA，-20℃保存待用。利用RT-PCR方法檢測(cè)沉默信息調(diào)節(jié)因子1(Sirtuin1, Sirt1)、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(insulin-like growth factor 1, IGF-1)、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ, PPARγ)、過(guò)氧化物酶體增殖活化受體γ輔助活化因子1α(peroxisome proliferator-activated receptorγcoactivator-1α, PGC-1α)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(glucose transporter 4,GLUT4)、叉頭框蛋白O1(forkhead box protein O1,FoxO1)、脂肪分解相關(guān)基因激素敏感性脂肪酶(hormone-sensitive lipase, HSL)及脂肪合成相關(guān)基因脂肪酸合成酶(fatty acid synthase, FASN)的表達(dá)量。

RT-PCR反應(yīng)步驟：采用20 μl的反應(yīng)體系：SYBR 染料10 μl，F(xiàn)orward 和Reverse 引物工作液(10 mmol/L)各1 μl，ROX 染料0.4 μl，cDNA 模板1 μl，無(wú)酶水6.6 μl。每個(gè)樣品2個(gè)平行。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃ 5 s、60℃ 34 s 共40個(gè)循環(huán)；熔解曲線反應(yīng)條件：60℃升溫至95℃，60℃ 1 min、95℃ 15 s，自動(dòng)采集熒光。

Tab. 1 Primer sequences of polymerase chain reaction

1.7 HE病理組織學(xué)觀察

取脂肪組織用10%甲醛固定，然后脫水透明、浸蠟包埋、切片(厚度為5 μm)、貼片，最后HE染色封片。用Image pro plus 6.0 軟件測(cè)量脂肪細(xì)胞直徑，每張切片隨機(jī)選擇100個(gè)脂肪細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)分析脂肪直徑大小的分布率和計(jì)算平均脂肪直徑大小。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 高脂飲食對(duì)西藏小型豬表型特征及血脂水平的影響

由表2可知，高脂組與正常對(duì)照組比較，體重和BMI指數(shù)顯著升高(P<0.01)，且內(nèi)臟脂肪率顯著增加(P<0.01)；另外，高脂組的血漿TC、LDL-C、HDL-C以及AI指數(shù)均顯著高于正常對(duì)照組(P<0.01)。

Tab. 2 Phenotypic characteristics of Tibetan mini-pigs induced by high-fat/cholesterol n=6)

2.2 高脂飲食對(duì)西藏小型豬血糖及胰島素水平的影響

由表4，5可知，HFC組給糖后時(shí)間-血糖濃度反應(yīng)曲線下面積顯著高于NC組(P<0.05)，且在給葡萄糖后5 min和15 min時(shí)差異顯著(P<0.05,P< 0.01)；同時(shí)胰島素水平時(shí)間-濃度反應(yīng)曲線下面積顯著高于NC組(P<0.05)，并在給葡萄糖后5 min的時(shí)間點(diǎn)差異顯著(P<0.05)。

Tab. 3 Blood lipid levels of Tibetan mini-pigs induced by high-fat/cholesterol n=6)

Tab. 4 Glucose response to intravenous glucose tolerance test(IVGTT)in Tibetan mini-pigs induced by high-fat/cholesterol diet

Tab. 5 Insulin response to IVGTT in Tibetan mini-pigs induced by high-fat/cholesterol diet n=6)

2.3 高脂飲食對(duì)西藏小型豬脂肪組織病理學(xué)變化的影響

HE染色結(jié)果顯示，與NC組比較，高脂飲食16周后西藏小型豬內(nèi)臟脂肪明顯肥大(圖1)；定量分析顯示，高脂模型組西藏小型豬平均脂肪細(xì)胞直徑為(82.14±6.71)μm，正常對(duì)照組平均脂肪細(xì)胞直徑為(44.47±0.73)μm，差異有顯著性(P<0.01)。

Fig. 1 HE staining of fat tissues in Tibetan mini-pigs induced by high-fat/cholesterol diet

2.4 高脂飲食對(duì)西藏小型豬脂肪組織Sirt1及下游相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的影響

與正常對(duì)照組相比，高脂飲食誘導(dǎo)16周后西藏小型豬脂肪組織中Sirt1、PGC-1α、GLUT4 的mRNA水平均有不同程度的降低，其中Sirt1 mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05)，F(xiàn)OXO1和IGF-1的mRNA表達(dá)則顯著升高(P<0.05,P<0.01)；另外，脂肪組織中HSL的mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，同時(shí)PPAR-γ和FASN的mRNA表達(dá)水平則顯著升高(P<0.05,P<0.01，表6)。

3 討論

兒童或青少年時(shí)期肥胖的增加與心臟代謝危險(xiǎn)因素和疾病密切相關(guān)，是成年后早期高發(fā)病率的預(yù)測(cè)因素[8]。其中飲食因素，如過(guò)量食用飽和脂肪、膽固醇及簡(jiǎn)單的碳水化合物會(huì)影響糖尿病、心臟代謝疾病的發(fā)展[9]。相比常規(guī)飲食，高脂飲食誘導(dǎo)16周后西藏小型豬的體重、BMI指數(shù)和內(nèi)臟脂肪率顯著增加，提示高脂飲食致西藏小型豬肥胖模型成立。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)高脂誘導(dǎo)后西藏小型豬內(nèi)臟脂肪細(xì)胞直徑明顯增加；糖耐量實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高脂組靜脈注射葡萄糖后時(shí)間-血糖濃度曲線和時(shí)間-胰島素濃度曲線變化均明顯延遲且曲線下面積均顯著高于常規(guī)飲食組，說(shuō)明在西藏小型豬肥胖模型中還存在胰島素抵抗。

Tab. 6 Relative gene expressions of Sirt1,FOXO1,PGC-1α,GLUT4,IGF-1,PPAR-γ, HSL, FASN in fat tissue in Tibetan mini-pigs induced by high-fat/cholesterol diet

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，Sirt1是各種組織中的關(guān)鍵代謝傳感器，可響應(yīng)不同的環(huán)境刺激，直接將細(xì)胞代謝狀態(tài)與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)調(diào)節(jié)聯(lián)系起來(lái)，從而調(diào)節(jié)能量代謝和應(yīng)激反應(yīng)等過(guò)程[10]。Sirt1還可以通過(guò)控制肝臟中的葡萄糖和脂質(zhì)代謝，促進(jìn)脂肪動(dòng)員并刺激白色脂肪組織中白色脂肪的棕色重塑，控制胰腺中胰島素的分泌，進(jìn)而影響肥胖導(dǎo)致的疾病[11]。Sirt1可以負(fù)性調(diào)控白色脂肪細(xì)胞中的PPARγ，從而抑制脂肪酸合成并促進(jìn)脂肪動(dòng)員[5]。在本研究中，高脂誘導(dǎo)后西藏小型豬Sirt1的mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)，而PPARγ的mRNA表達(dá)水平顯著升高，提示高脂飲食導(dǎo)致脂肪組織中Sirt1失活影響內(nèi)臟脂肪的生成與分解。另外，高脂飲食后西藏小型豬脂肪組織中激素敏感脂肪酶(HSL)基因表達(dá)顯著降低而脂肪酸合成酶(FASN)表達(dá)則明顯升高。HSL是脂肪組織脂解中的限速酶，高脂飲食可導(dǎo)致大鼠脂肪組織HSL表達(dá)降低[12]；而FASN則是體內(nèi)脂肪酸從頭合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶，在高脂喂養(yǎng)致大鼠脂肪肝模型中發(fā)現(xiàn)FASN表達(dá)顯著增加[13]?？梢?jiàn)，HSL表達(dá)降低以及FASN表達(dá)增加，可能是高脂飲食促進(jìn)西藏小型豬內(nèi)臟脂肪沉積從而誘發(fā)肥胖的關(guān)鍵過(guò)程；提示Sirt1/PPARγ途徑參與肥胖西藏小型豬的內(nèi)臟脂肪沉積。

IR是肥胖的病理基礎(chǔ)，高胰島素血癥會(huì)引起食欲增加，從而過(guò)量進(jìn)食使得血糖升高，過(guò)多的能量則轉(zhuǎn)變成脂肪組織儲(chǔ)存起來(lái)，最終導(dǎo)致肥胖的出現(xiàn)[14]。胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(insulin-like growth factor-1, IGF-1)具有胰島素樣作用，其通過(guò)與IGF-1受體特異性結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育，并參與肥胖、2型糖尿病等代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[15]。其中，胰島素(INS)/IGF-1通路是參與代謝的重要調(diào)控通路；IR或繼發(fā)的高胰島素血癥可能通過(guò)IGF-1的高表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞增殖、凋亡異常。本研究結(jié)果顯示，高脂誘導(dǎo)后肥胖西藏小型豬的脂肪組織中IGF-1的mRNA表達(dá)水平明顯升高，提示內(nèi)臟脂肪細(xì)胞肥大增生可能與此有關(guān)。另外，叉頭框蛋白O1(Foxo1)是FOXO轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，近來(lái)認(rèn)為FOXO1在肥胖和IR間起著重要的橋梁作用，是INS/IGF-1通路的效應(yīng)分子[16]。Sirt1可以通過(guò)去乙酰化作用影響FOXO介導(dǎo)的下游分子，F(xiàn)OXO1異常激活可引起胰島素敏感性降低。脂肪組織中GLUT4的表達(dá)降低可導(dǎo)致明顯的IR[17]，且脂肪組織中Sirt1耗盡能抑制胰島素刺激的葡萄糖攝取和GLUT4轉(zhuǎn)運(yùn)。本研究發(fā)現(xiàn)肥胖小型豬脂肪組織中FOXO1的 mRNA表達(dá)水平較NC組顯著增加，而GLUT4 mRNA表達(dá)則相對(duì)減少，這與臨床肥胖患者網(wǎng)膜脂肪組織中的表達(dá)一致[18]。PGC-1α是一種代謝共激活因子，參與脂肪酸氧化反應(yīng)，而Sirt1能通過(guò)去乙?；饔锰岣逷GC-1α的轉(zhuǎn)錄活性[19]，本研究發(fā)現(xiàn)高脂誘導(dǎo)后西藏小型豬脂肪組織中PGC-1α表達(dá)下調(diào)，提示Sirt1可能通過(guò)下調(diào)PGC-1α表達(dá)水平影響機(jī)體的脂肪酸氧化過(guò)程。以上這些結(jié)果提示Sirt1/PGC-1α/FOXO1途徑可能參與肥胖有關(guān)的脂肪細(xì)胞功能紊亂，并影響脂肪組織中的胰島素信號(hào)傳導(dǎo)及其敏感性。

綜上所述，西藏小型豬經(jīng)高脂飲食誘導(dǎo)后能形成肥胖模型，并具有脂質(zhì)代謝紊亂和胰島素抵抗等表型特征；而Sirt1在肥胖西藏小型豬內(nèi)臟脂肪沉積和胰島素敏感性降低中起著關(guān)鍵作用，提高Sirt1的表達(dá)水平可能對(duì)緩解不良飲食習(xí)慣導(dǎo)致的肥胖和IR發(fā)生有一定的作用。