劉紅艷, 魯啟洪, 黃楚鷹
(1.湖北省恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院 腫瘤放療中心, 恩施 445000;2.湖北省恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科, 恩施 445000;3.湖北省恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院腫瘤一科, 恩施 445000)
宮頸癌的發(fā)病率和死亡率在女性生殖道惡性腫瘤中排名第二[1]。每年全世界有近500,000例新病例,其中一半死于宮頸癌[2]。宮頸癌主要由持續(xù)感染高危人乳頭瘤病毒(human papillomavirus, HPV)引起。在大多數(shù)情況下,HPV感染是自限性的,并且可以通過體液和細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答來根除。這表明免疫調(diào)節(jié)可能在宮頸癌發(fā)生中起重要作用。炎癥是腫瘤進展的關(guān)鍵組成部分,因為癌癥是從感染和炎癥部位,尤其是慢性炎癥部位生長的。已有研究表明宮頸癌細胞能夠分泌細胞因子,并促進腫瘤的生存、遷移和增殖等過程[3]。因此,探討宮頸癌細胞分泌細胞因子的分子機制對治療腫瘤有積極意義。核因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)是一種核轉(zhuǎn)錄因子,調(diào)節(jié)各種基因的表達,包括細胞因子,它們在細胞凋亡,腫瘤發(fā)生,各種自身免疫疾病和炎癥中起關(guān)鍵作用[4]。miR-520a-3p能夠調(diào)控多種癌細胞的增殖,凋亡和轉(zhuǎn)移[5, 6]。此外,Zhu H等人[7]通過高通量測序發(fā)現(xiàn)miR-520a-3p在宮頸癌中表達量較低。然而,其在宮頸癌中的作用尚不明確。目前,從診斷到預(yù)后,可能在治療和預(yù)防宮頸癌中發(fā)揮作用,所有抗癌方法都在評估細胞因子的作用[8-10]?;诖?,本研究以宮頸癌HELA細胞為研究對象,旨在探討miR-520a-3p調(diào)控宮頸癌細胞分泌粒細胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor, GCSF), 粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF), 白介素2(interleukin-2, IL-2), 白介素3(interleukin-3, IL-3), 白介素4(interleukin-4, IL-4), 白介素5(interleukin-5, IL-5), 白介素6(interleukin-6, IL-6), 白介素9(interleukin-9, IL-9), 白介素10(interleukin-10, IL-10), 白介素12 p40(interleukin-12 p40, IL-12 p40),白介素12 p70(interleukin-12 p70, IL-12 p70), 白介素13(interleukin-13, IL-13), 白介素17(interleukin-17, IL-17), 干擾素γ(interferon-γ, IFN-γ), 單核細胞趨化因子-1(monocyte chemotactic protein-1, MCP-1), 調(diào)控T細胞表達和分泌因子(regulated on activation normal T cell expressed and secreted, RANTES), 腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)等細胞因子的分子機制,為治療宮頸癌提供理論基礎(chǔ)。
RELA, GAPDH抗體購自cst公司(貨號:59674, 5174)。宮頸癌HELA細胞購自上??道噬锟萍加邢薰?貨號:Y-01663)。RPMI-1640培養(yǎng)基購自上海北諾生物科技有限公司(貨號:R1145-500ML),胎牛血清購自Thermo Fisher Scientific公司(貨號:10099-133)。pMir-Glo miRNA功能研究載體購自上海海吉浩格生物科技有限公司(貨號:HH-LUC-016)。蛋白酶抑制劑Cocktail(不含EDTA, mini片劑)購自bimake公司(貨號:B14011)。PBS購自生工生物工程(上海)股份有限公司(貨號:E607008)。青鏈霉素混合液(100×)購自北京索萊寶科技有限公司(貨號:P1400)。2×SDS 蛋白電泳上樣緩沖液購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司(貨號:WB-0081)。雙熒光素酶報告基因試劑盒購自北京冬歌博業(yè)生物科技有限公司(貨號:SLDL-100)。蛋白裂解液購自碧云天生物技術(shù)有限公司(貨號:P0013)。miRNA轉(zhuǎn)染試劑購自上?;苌钌锟萍加邢薰?貨號:409-10)。LPS購自上海源葉生物科技有限公司(貨號:S11060)。miR-520a-3p的qPCR引物,miRNA NC,miR-520a-3p mimics,miR-520a-3p inhibitor均有上海生工合成,序列參考Zhang R 等人[5]。GCSF, GM-CSF, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-12 p40, IL-12 p70, IL-13, IL-17, IFN-γ, MCP-1, RANTES, TNFα的ELISA試劑盒購自上海喬羽生物科技有限公司(貨號:QN-PS0040, QY-BM11154, QY-x0605P, QY-BM10220, QN-PS0051, QN-PS0050, QY-BM10211, QY-BM10205, QY-BM10156, QY-BM10178, QY-BM10175, QY-BM10172, QN-PS0179, QY-BM10168, QY-Q11142, QY-BM11185, QY-BM10200)。MCP-5的ELISA試劑盒購自上海恒斐生物科技有限公司(貨號:SEC075Mu-1)。
宮頸癌HELA細胞在含有10%FBS和1%P/S的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將所有細胞維持在37℃的含5%CO2的培養(yǎng)箱中。將miR-520a-3p mimics或miR-520a-3p inhibitor與miRNA轉(zhuǎn)染試劑混合,靜止大約20 min后,緩緩滴入HELA細胞。將HELA細胞與500 ng/ml的LPS一起溫育20 h后進行下游試驗。其中,轉(zhuǎn)染miRNA NC的為對照組(control)、轉(zhuǎn)染miR-520a-3p mimics的為過表達組(overpression of miR-520a-3p)、LPS處理的為LPS處理組(LPS treatment)、轉(zhuǎn)染miR-520a-3p mimics并用LPS處理的為LPS處理過表達組(LPS treatment + overpression of miR-520a-3p)、轉(zhuǎn)染miR-520a-3p inhibitor的為過表達組(Knockdown of miR-520a-3p)、轉(zhuǎn)染miR-520a-3p inhibitor并用LPS處理的為LPS處理敲低組(LPS treatment + Knockdown of miR-520a-3p)。
使用TRIzol試劑提取總RNA,并進行cDNA合成。用Bio-Rad CFX96實時系統(tǒng)進行qRT-PCR。將轉(zhuǎn)錄水平標(biāo)準(zhǔn)化為甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的水平,檢測基因表達水平。
將RELA的3’UTR克隆進pMir-Glo質(zhì)粒,同時克隆RELA的3’UTR的UG突變進pMir-Glo質(zhì)粒。將每孔總共5×104個HELA細胞接種在24孔板中。培養(yǎng)24 h后,用含有200 ng/ml雙熒光素酶報告質(zhì)粒和40 nmol/L miR-520a-3p mimics混合后轉(zhuǎn)染細胞。使用熒光素酶報告檢測試劑盒在轉(zhuǎn)染后24 h通過酶標(biāo)儀測量熒光素酶活性。所有轉(zhuǎn)染獨立重復(fù)至少三次。
使用RIPA裂解緩沖液[50 mmol/l Tris-HCl(pH7.4),150 mmol/l NaCl,1%Nonidet P-40, 0.5%脫氧膽酸鈉]從細胞中提取總蛋白質(zhì),并使用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒進行定量[11]。使用多克隆抗RELA(1∶3 000), GAPDH(1∶6 000)抗體作為一抗、抗兔和抗小鼠IgG為二抗。使用ECL發(fā)光系統(tǒng)檢測相應(yīng)蛋白質(zhì)表達水平。
用涂層緩沖液中的抗原/分析物溶液充分涂覆微量滴定板。蓋上培養(yǎng)板,在4℃下孵育過夜。用300 μl洗滌緩沖液洗滌板三次。將阻斷緩沖液添加到板中。在37℃孵育1 h。準(zhǔn)備分析物抗體混合物用于樣品和標(biāo)準(zhǔn)品。將分析物和標(biāo)準(zhǔn)混合物添加到選定的孔中。在37℃孵育1 h。用300 μl洗滌緩沖液洗滌三次。將酶綴合的二抗添加到每個孔中。在37℃孵育1 h。用300 μl洗滌緩沖液洗滌三次。將底物溶液添加到選定的孔中。在室溫下孵育直至觀察到所需的顏色變化。添加反應(yīng)終止液。讀取吸光度值。
Targetscan在線工具分析結(jié)果表明,miR-520a-3p與RELA的3’UTR高度匹配,且匹配區(qū)域位于3’UTR的1268-1275位置(圖1)。將RELA的3’UTR中與miR-520a-3p相匹配區(qū)域中的U均突變?yōu)镃、C均突變?yōu)锳并插入pMir-Glo質(zhì)粒中,此為突變型。與突變型相比,野生型RELA的相對熒光素酶活性下降(100±6vs17±3,P<0.05,圖2)。
Fig. 1 miR-520a-3p and NF-κB complex subunit RELA highly matched
Fig. 2 Luciferase activity of 3 'UTR of wild and mutant miR-520a-3p after overexpression of miR-520a-3p
在宮頸癌HELA細胞中轉(zhuǎn)染miR-520a-3p mimics后,通過實時熒光定量PCR檢測miR-520a-3p水平發(fā)現(xiàn),與對照組相比,過表達miR-520a-3p組的miR-520a-3p基因表達水平上升(1.01±0.10vs3.59±0.66,P<0.05),同時通過免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn),與對照組相比,過表達miR-520a-3p組的NF-kB復(fù)合體亞基RELA的蛋白表達水平下降(圖3)。使用LPS激活NF-kB信號通路后發(fā)現(xiàn),與對照組和過表達miR-520a-3p組相比,宮頸癌HELA細胞分泌的細胞因子GCSF, GM-CSF, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-12 p40, IL-12 p70, IL-13, IL-17, IFN-γ, MCP-1, MCP-5, RANTES, TNF-α的蛋白表達水平上升(P<0.05),但是LPS處理的同時過表達miR-520a-3p后,相比于LPS處理組,宮頸癌HELA細胞分泌的這些細胞因子蛋白表達水平下降(P<0.05,表1)。
Fig. 3 Expression of the subunit RELA of the NF-kB complex after overexpression of miR-520a-3p
Tab. 1 Effects of overexpression of miR-520a-3p on HELA factor secretion in cervical cancer cells
在宮頸癌HELA細胞中轉(zhuǎn)染miR-520a-3p inhibitor后,實時熒光定量PCR檢測miR-520a-3p水平結(jié)果表明,與對照組相比,敲低miR-520a-3p組的miR-520a-3p基因表達水平下降(0.99±0.11vs0.35±0.05,P<0.05),同時免疫印跡檢測結(jié)果表明,與對照組相比,敲低miR-520a-3p組的NF-kB復(fù)合體亞基RELA的蛋白表達水平上升(圖4)。使用LPS激活NF-kB信號通路后發(fā)現(xiàn),與對照組和敲低miR-520a-3p組相比,宮頸癌HELA細胞分泌的細胞因子GCSF, GM-CSF, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-12 p40, IL-12 p70, IL-13, IL-17, IFN-γ, MCP-1, MCP-5, RANTES, TNFα的蛋白表達水平上升(P<0.05),但是LPS處理的同時敲低miR-520a-3p后,相比于LPS處理組,宮頸癌HELA細胞分泌的這些細胞因子蛋白表達水平進一步上升(P<0.05,表2)。
Fig. 4 Expression of subunit RELA in the NF-kB complex after miR-520a-3p knockdown
在本研究中發(fā)現(xiàn),在宮頸癌HELA細胞中miR-520a-3p靶向RELA的3’UTR。Zhang R等人[5]報道m(xù)iR-520a-3p能夠靶向EGFR調(diào)控結(jié)直腸癌細胞遷移,細胞凋亡。Li J等人[12]發(fā)現(xiàn),miR-520a-3p能夠靶向CCND1和CD44調(diào)控乳腺癌細胞增殖,遷移和侵襲。因此,miR-520a-3p是一個與多種癌癥相關(guān)的分子,能夠調(diào)控癌細胞的生命活動。
Tab. 2 Effect of miR-520a-3p knockdown on HELA factor secretion in cervical cancer cells
細胞因子也稱為白細胞介素,單核因子,淋巴因子,趨化因子和生長因子[13-15]。本研究結(jié)果表明,LPS激活NF-kB信號通路后,宮頸癌HELA細胞分泌的細胞因子GCSF, GM-CSF, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-12 p40, IL-12 p70, IL-13, IL-17, IFN-γ, MCP-1, MCP-5, RANTES, TNF-α的水平顯著上升。NF-κB在大多數(shù)細胞中作為p50和p65亞基的同源二聚體或異二聚體復(fù)合物存在,并且在與NF-κB抑制蛋白(I-κB)相關(guān)的細胞的細胞質(zhì)中保持無活性[16]。NF-κB被激活以響應(yīng)各種炎癥刺激分泌細胞因子,包括細菌LPS及其通過增加與細胞溶質(zhì)IκB蛋白減少相關(guān)的核p65蛋白誘導(dǎo)的NF-κB活化。在多種疾病中,NF-κB能夠調(diào)控多種炎癥基因的轉(zhuǎn)錄,包括TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、iNOS、COX2、趨化因子、粘附分子、集落刺激因子,因此NF-κB是治療各種疾病的重要靶點。
在本研究中,發(fā)現(xiàn)過表達miR-520a-3p后,RELA的表達水平顯著下降,宮頸癌HELA細胞分泌的細胞因子水平顯著下降;敲低miR-520a-3p后,RELA的表達水平上升,宮頸癌HELA細胞分泌的細胞因子水平顯著上升。最近的文獻揭示一些細胞因子的失調(diào)與宮頸癌前病變的發(fā)生率,從癌前期到“原位”癌癥的進展,進一步侵襲以及末期轉(zhuǎn)移之間的顯著關(guān)聯(lián)[17]。最初,細胞因子被認為是免疫系統(tǒng)中的信使分子,將白細胞引導(dǎo)至炎癥部位。然而,當(dāng)失調(diào)時,細胞因子與大多數(shù)腫瘤組織的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系,可能在惡性轉(zhuǎn)化,增殖,存活,血管生成,侵襲和轉(zhuǎn)移中起作用?,F(xiàn)在已經(jīng)鑒定近50種細胞因子,其中一些或它們的受體在宮頸癌的癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移中顯著改變[18]。細胞因子如GCSF, GM-CSF, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-12 p40, IL-12 p70, IL-13, IL-17, IFN-γ, MCP-1, MCP-5, RANTES, TNF-α等已被證明可作為潛在的生物標(biāo)志物來評估侵襲性癌癥和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險[19]。許多細胞因子在宮頸癌前期和癌癥中顯著改變,在患有轉(zhuǎn)移的晚期癌癥中更是如此。其中一些例如IL-6,IL-17,IL-8與腫瘤生長相關(guān)[20],而一些與抑制HPV復(fù)制和抑制腫瘤相關(guān),例如RANTES,TNFα,IFNγ。目前,幾種miRNA靶向治療已在臨床應(yīng)用,包括腫瘤抑制因子miRNA miR-34的模擬物,已經(jīng)進行治療癌癥的I期臨床試驗,以及針對miR-122的antimiRs,已經(jīng)進行治療肝炎的II期臨床試驗[21]。因此,通過體外合成的miR-520a-3p模擬物可能抑制RELA的表達,抑制宮頸癌細胞因子的分泌,抑制腫瘤的生存、遷移和增殖等過程,延長宮頸癌患者生存率。