黃嬌嬌，王艷林，孫麗丹，曹春雨，秦 燁，楊建林

(三峽大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 腫瘤微環(huán)境與免疫治療湖北省重點實驗室，湖北 宜昌 443002)

多胺代謝途徑作為抗腫瘤治療的新靶點被廣泛研究，以往研究證實，高多胺含量對腫瘤細(xì)胞的迅速生長至關(guān)重要，干擾腫瘤細(xì)胞的多胺代謝途徑，耗竭多胺有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[1]。精胺氧化酶(spermine oxidase, SMO)和乙酰多胺氧化酶(acetylpolyamine oxidase, APAO)是重要的多胺代謝酶，已有研究證實SMO高表達(dá)與胃腸癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展直接相關(guān)[2]，本課題組前期通過計算機輔助藥物設(shè)計技術(shù)篩選出一種小分子的新型多胺代謝抑制劑，將其命名為SI-4650。研究發(fā)現(xiàn)SI-4650能夠有效抑制人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞SMO和APAO酶活性，干擾多胺代謝，抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡和自噬性死亡[3]。為一步探究SI-4650抗腫瘤的潛能以及作用機制，本研究以結(jié)腸癌CT-26細(xì)胞為研究對象，進行體外驗證SI-4650對CT-26細(xì)胞生長、凋亡和自噬的影響，為抗腫瘤藥物研發(fā)提供基礎(chǔ)依據(jù)和新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

結(jié)腸癌CT-26細(xì)胞株購自上?？吕咨锛夹g(shù)有限公司；SI-4650購自Specs生物特殊化合物公司；細(xì)胞培養(yǎng)試劑包括：DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素/鏈霉素雙抗分別購自Gibco公司和天津市灝洋生物制品科技有限公司；3-MA自噬抑制劑購自Selleck公司；各種抗體：β-actin、PARP、Bax、Bcl-2、LC3-Ⅰ/Ⅱ、P62、Beclin-1和辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗分別購自CST公司、Santa Cruz公司、北京科美博瑞有限公司和北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；ECL顯影液購自Thermo Scientific公司；pEGFP-LC3質(zhì)粒購自Add Gene公司；FITC-Annexin V 凋亡檢測試劑盒、CCK8試劑盒、線粒體膜電位(JC-1)檢測試劑盒和Fluo-3 AM探針均購自碧云天生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、分組及處理

結(jié)腸癌CT-26細(xì)胞用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基置于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞分為6組，0 μmol·L-1SI-4650處理48 h細(xì)胞為正常對照組；單獨2.5 mmol·L-13-MA處理細(xì)胞為自噬抑制對照組，4個實驗組分別為單獨40 μmol·L-1SI-4650處理48 h細(xì)胞、單獨80 μmol·L-1SI-4650處理48 h細(xì)胞、2.5 mmol·L-13-MA聯(lián)合40 μmol·L-1SI-4650處理48 h細(xì)胞以及2.5 mmol·L-13-MA聯(lián)合80 μmol·L-1SI-4650處理48 h細(xì)胞。

1.3 CCK8法檢測CT-26細(xì)胞生長抑制率

分別用終濃度為0(正常對照)、10、20、40、80、160 μmol·L-1SI-4650處理CT-26細(xì)胞24、48、72 h，每個濃度設(shè)置6個復(fù)孔，同時設(shè)不加細(xì)胞的空白孔；在每孔中加入10 μl CCK8試劑后繼續(xù)孵育30 min，用酶標(biāo)儀于460 nm波長處檢測每孔吸光度值(A)。SI-4650對CT-26細(xì)胞的生長抑制率=[1-(A實驗組-A空白組)/(A正常對照組-A空白組)]×100%。

或以2.5 mmol·L-13-MA預(yù)處理CT-26細(xì)胞2 h后，用終濃度為0(正常對照)、40、80 μmol·L-1SI-4650繼續(xù)處理細(xì)胞48 h，隨后同上方法，使用CCK8檢測計算細(xì)胞生長抑制率。

1.4 化學(xué)發(fā)光法分析CT-26細(xì)胞內(nèi)SMO、APAO酶活性

根據(jù)參考文獻[4]將收集到的0(正常對照)、40、80 μmol·L-1SI-4650處理48 h的CT26細(xì)胞中加入200 μl 0.083 mol·L-1甘氨酸緩沖液，-80℃冰箱中過夜裂解細(xì)胞，4℃、12 000 r·min-1離心10 min去除裂解細(xì)胞碎片，獲得含有SMO和APAO的上清液，BCA試劑盒測定上清中總蛋白含量，化學(xué)發(fā)光法檢測酶活性。以上清液中單位總蛋白質(zhì)量(mg)、單位時間(s)內(nèi)的平均化學(xué)發(fā)光強度(RLU)RLU/(mg·s)表示酶活性。

1.5 高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)檢測CT-26細(xì)胞內(nèi)多胺含量

收集0(正常對照)、40、80 μmol·L-1SI-4650處理48 h的CT26細(xì)胞，冰上裂解液作用細(xì)胞30 min，經(jīng)離心后獲得含多胺的上清液，BCA試劑盒檢測上清液中總蛋白含量，分別取總蛋白含量相同的3個樣品細(xì)胞裂解液，加入ddH2O使總體積為800 μl。隨后在上清液中依次加入：內(nèi)標(biāo)分子20 μl DAH(1 mmol·L-1)、500 μl NaOH(2 mol·L-1)、10 μl 苯甲酰氯后振蕩混勻，40℃水浴20 min后加入2 ml飽和NaCl溶液混勻，加入2 ml乙醚顛倒混勻后靜置待分層，留取上層萃取液，將下層液體再次乙醚萃取2次，合并3次上層萃取液于通風(fēng)櫥中揮發(fā)干燥過夜。沉淀物用1 ml甲醇溶解并過濾，獲得制備好的高效液相色譜分析樣品。分析條件為：Luna C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)為固定相，乙腈-水(38∶62)為流動相，流速1 ml·min-1，檢測波長254 nm，柱溫30℃。以相同細(xì)胞總蛋白中多胺濃度μg/(ml·mg)體現(xiàn)相對多胺含量。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測CT-26細(xì)胞周期

分別收集6個組CT-26細(xì)胞，經(jīng)75%乙醇重懸后4℃固定過夜。PBS洗滌細(xì)胞后用含50 μg·L-1RNase、0.1% TritonX-100和0.5 g·L-1碘化丙啶(propidium iodide, PI)的PBS重懸細(xì)胞，37℃避光水浴30 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測CT-26細(xì)胞凋亡

分別收集6個組CT-26細(xì)胞，按照試劑盒說明書操作，每樣品細(xì)胞中加入5 μl FITC-Annexin V和5 μl PI，室溫下避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀檢測凋亡細(xì)胞數(shù)量，計算細(xì)胞凋亡率=[Annexin V(+)細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)]×100%。。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測CT-26細(xì)胞鈣離子濃度

分別收集6個組CT-26細(xì)胞，按照試劑盒說明書操作，F(xiàn)luo-3 AM鈣離子熒光探針染色、洗滌后，用500 μl 1×PBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測Fluo-3 AM與細(xì)胞內(nèi)鈣離子結(jié)合形成的綠色熒光強度確定細(xì)胞中鈣離子濃度。

1.9 流式細(xì)胞術(shù)檢測CT-26細(xì)胞線粒體膜電位

分別收集6個組CT-26細(xì)胞按照試劑盒說明書操作，JC-1試劑染色、洗滌后，用500 μl 1×PBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測紅色熒光和綠色熒光的比例，確定線粒體膜電位去極化的程度。

1.10 Western blot檢測CT-26細(xì)胞凋亡和自噬相關(guān)蛋白表達(dá)

分別收集6個組CT-26細(xì)胞，100 μl 細(xì)胞裂解液冰上裂解30 min，4℃、12 000 r·min-1離心15 min，獲取上清液。BCA試劑盒檢測上清液總蛋白含量，每個樣品分別取含60 μg總蛋白的上清液，加適量上樣緩沖液，沸水浴10 min。蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE分離，電轉(zhuǎn)至PVDF膜。5%脫脂牛奶(TBST配制)室溫處理PVDF膜閉2 h，分別加抗體于4℃孵育過夜，經(jīng)TBST洗膜后加對應(yīng)二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜10 min×3次，ECL化學(xué)發(fā)光法檢測，以目的蛋白和內(nèi)參照蛋白灰度值之比表示相對蛋白表達(dá)量。

1.11 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 SI-4650對腸癌CT-26細(xì)胞增殖率的影響

CCK8法檢測結(jié)果顯示，SI-4650能有效抑制CT-26細(xì)胞增殖，且細(xì)胞增殖率隨藥物作用時間和濃度增加而下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表1)。后續(xù)實驗中以終濃度為40、80 μmol·L-1SI-4650處理48 h的CT-26細(xì)胞作為實驗組，以0 μmol·L-1SI-4650處理48 h的CT-26細(xì)胞作為正常對照組。

Tab. 1 Effects of SI-4650 on the proliferation rate of CT-26 cells(%, n=3)

2.2 SI-4650對腸癌CT-26細(xì)胞SMO與APAO酶活性及多胺質(zhì)量濃度的影響

與正常對照組相比，40、80 μmol·L-1SI-4650處理組細(xì)胞SMO和APAO酶活性分別從12781.67(RLU)RLU/(mg·s)和8530.67(RLU)RLU/(mg·s)下降到4436(RLU)RLU/(mg·s)和2650.67(RLU)RLU/(mg·s)；與之相一致的是，處理組細(xì)胞中SMO酶促反應(yīng)的底物精胺(spermine, Spm)含量從3.64 μg/(ml·mg)增多至5.05 μg/(ml·mg)，而反應(yīng)產(chǎn)物精脒(spermidine, Spd)含量從 8.03 μg/(ml·mg)減少到2.92 μg/(ml·mg)，APAO酶促反應(yīng)產(chǎn)物腐胺(putrescine, Put)含量也從3.12 μg/(ml·mg)下降為0.70 μg/(ml·mg)，同時細(xì)胞中總多胺含量也明顯降低，以上差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，表2)。提示SI-4650能有效抑制CT-26細(xì)胞中SMO和APAO酶活性，阻滯相應(yīng)酶促反應(yīng)進程，干擾多胺代謝，進而間接耗竭腫瘤細(xì)胞中總多胺含量。

Tab. 2 Effects of SI-4650 on activities of SMO and APAO and polyamine contents in CT-26 cells n=3)

2.3 SI-4650對腸癌CT-26細(xì)胞周期的影響

與正常對照組相比，40、80 μmol·L-1SI-4650處理可使CT-26細(xì)胞周期發(fā)生顯著改變，G0/G1期從(35.33±0.11)%增加至(52.35±1.32)%，S期則從(51.63±0.80)%減少到(30.28±0.58)%(P< 0.05，表3)，提示SI-4650可將CT-26細(xì)胞阻滯在G0/G1期，干擾細(xì)胞增殖。

Tab. 3 Effects of SI-4650 on cell cycle of CT-26 cells(%, n=3)

2.4 SI-4650對結(jié)腸癌CT-26細(xì)胞自噬的影響

Western blot分析自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)顯示，與SI-4650 0 μmol·L-1正常對照組相比，40、80 μmol·L-1SI-4650處理的CT-26細(xì)胞中的自噬活化蛋白beclin-1、標(biāo)志性自噬微管蛋白LC3-Ⅱ表達(dá)水平均隨SI-4650濃度的增高而顯著增加，自噬底物蛋白P62表達(dá)則隨之減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖1，表4)。以上結(jié)果提示SI-4650能誘導(dǎo)CT-26細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡。

與單獨0、40、80 μmol·L-1SI-4650處理 CT-26細(xì)胞相比較，聯(lián)合2.5 mmol·L-1的自噬抑制劑3-MA預(yù)處理后，相同濃度的SI-4650作用CT-26細(xì)胞中beclin-1和LC3-II表達(dá)減少，P62表達(dá)增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖2，表4)。結(jié)果提示 2.5 mmol·L-13-MA預(yù)處理可抑制SI-4650誘導(dǎo)CT-26細(xì)胞自噬的進程。

細(xì)胞自噬的發(fā)生對腫瘤細(xì)胞生長起保護性作用還是殺傷性作用目前尚未定論，為進一步探討SI-4650誘導(dǎo)CT-26細(xì)胞自噬在抗腫瘤作用中是有益還有不利的因素，本研究通過細(xì)胞增殖實驗證實，與SI-4650單獨處理細(xì)胞組相比，聯(lián)合使用3-MA抑制CT-26細(xì)胞自噬后，同樣濃度的SI-4650對CT-26細(xì)胞的增殖抑制率分別從23.28%和36.34%下降為14.30%和19.39%(P<0.01，表5)。表明阻滯CT-26細(xì)胞自噬會減弱SI-4650對CT-26細(xì)胞生長的抑制作用。以上結(jié)果顯示SI-4650誘導(dǎo)細(xì)胞自噬性死亡可能是抗結(jié)腸癌CT-26細(xì)胞分子機制之一。

Fig. 1 Effects of SI-4650 alone or in combination with 3-MA on autophagy of CT-26 cells

Tab. 4 Effects of SI-4650 alone or in combination with 3-MA on protein expressions of Beclin-I, P62, Lc3-I and Lc3-II after incubation of CT-26 cells

Tab. 5 Effects of 3-MA and SI-4650 on the proliferation rate of CT-26 cells(%, n=3)

2.5 SI-4650對結(jié)腸癌CT-26細(xì)胞凋亡的影響

與正常對照組相比，40、80 μmol·L-1SI-4650處理組凋亡細(xì)胞率從4.9%上升至7.69%和 16.87%，細(xì)胞中鈣離子濃度增加，線粒體膜電位下降(P<0.01，表6)，同時細(xì)胞內(nèi)標(biāo)志性凋亡降解蛋白c-PARP表達(dá)水平增加，同時促凋亡蛋白Bax表達(dá)上調(diào)、凋亡抑制蛋白Bcl-2表達(dá)下調(diào)、Bax/Bcl-2比值顯著升高(P<0.01，圖2，表7)。提示SI-4650可誘導(dǎo)CT-26細(xì)胞發(fā)生凋亡，其機制可能與線粒體依賴的細(xì)胞凋亡途徑相關(guān)。

進一步研究顯示，與單獨40、80 μmol·L-1SI-4650處理 CT-26細(xì)胞相比較，當(dāng)聯(lián)合2.5 mmol·L-1的自噬抑制劑3-MA預(yù)處理后，相同濃度的SI-4650作用后凋亡細(xì)胞率分別從7.69%和16.87%下降至6.81%和13.94%(P<0.01，表6)，凋亡相關(guān)蛋白、細(xì)胞鈣離子濃度和線粒體膜電位的改變程度均減弱(P<0.01，表6，表7)，以上結(jié)果提示自噬抑制劑3-MA可阻滯SI-4650誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，可能是通過干擾線粒體相關(guān)凋亡途徑的進程實現(xiàn)的。

Tab. 6 Effects of SI-4650 alone or in combination with 3-MA on mitochondrial function and apoptosis of CT-26 n=3)

3 討論

天然多胺(polyamine, PA)，包括腐胺(putrescine, Put)、精脒(spermidine, Spd)和精胺(spermine, Spm)，普遍存在于真核細(xì)胞當(dāng)中緊密參與細(xì)胞的增殖、分化、發(fā)育和細(xì)胞應(yīng)激等重要的生理過程。多胺代謝與包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)，細(xì)胞內(nèi)多胺水平的穩(wěn)定受到多胺合成酶、分解酶及其跨膜轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的嚴(yán)密調(diào)控[5]。APAO和SMO是多胺代謝關(guān)鍵酶，分別將N1-乙酰精脒、N1-乙酰精胺和Spm氧化為Put和Spd，同時生成3-乙酰氨基丙醛、3-氨基丙醛和H2O2[6]。本實驗室前期基于藥效團的計算機輔助藥物設(shè)計技術(shù)和高通量虛擬篩選技術(shù)獲得的一種多胺代謝酶新型小分子抑制劑SI-4650 也已證實具有抗人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞和骨肉瘤U87細(xì)胞增殖的藥理學(xué)活性[3.7]。為探索SI-4650抗腫瘤機制及其是否具有抗結(jié)腸癌臨床應(yīng)用潛能，本實驗研究SI-4650對結(jié)腸癌CT-26細(xì)胞增殖、凋亡和自噬的影響以及可能的分子機制，以期為開發(fā)更有效的結(jié)腸癌臨床治療新藥提供理論和實驗依據(jù)。

Fig. 2 Effects of SI-4650 alone or in combination with 3-MA on apoptosis-related proteins of CT-26 cells

Tab. 7 Effects of SI-4650 alone or in combination with 3-MA on apoptosis-related protein expressions of CT-26 cells n=3)

CCK8實驗結(jié)果證實SI-4650能高效抑制CT-26細(xì)胞的增殖，且抑制效應(yīng)隨SI-4650作用時間和劑量增加而增加。進一步酶活性檢測結(jié)果驗證SI-4650有效抑制CT-26細(xì)胞中SMO 和APAO酶活性，且抑制效率隨藥物濃度增加而增高。同時高效液相色譜法分析多胺含量的結(jié)果也證實SI-4650可引起CT-26細(xì)胞中SMO 和APAO酶促反應(yīng)產(chǎn)物Put、Spd的含量顯著減少，同時細(xì)胞中總多胺含量也明顯下降。我們推測，可能由于SI-4650抑制多胺代謝酶活性，引起N1-乙酰精脒、N1-乙酰精胺和Spm在細(xì)胞中堆積，從而活化細(xì)胞多胺代謝調(diào)控機制跨膜轉(zhuǎn)運系統(tǒng)活化，導(dǎo)致大量多胺成分轉(zhuǎn)運細(xì)胞外，進而細(xì)胞中總多胺含量下降，影響細(xì)胞增殖。以上結(jié)果提示SI-4650有效抑制CT-26結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，其機制與SI-4650作為多胺代謝酶抑制劑，抑制CT-26細(xì)胞中SMO、APAO酶活性，阻滯酶促反應(yīng)進行，減少細(xì)胞中總多胺含量相關(guān)。

SI-4650抗腫瘤機制研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌CT-26細(xì)胞經(jīng)SI-4650處理后，凋亡標(biāo)志性蛋白c-PARP表達(dá)增加，促凋亡蛋白Bax 表達(dá)上調(diào)，而凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達(dá)則顯著性下降，線粒體跨膜電位下降，同時可見細(xì)胞中鈣離子濃度同步上升，可引起線粒體攝取超載而導(dǎo)致線粒體損傷，符合細(xì)胞凋亡[8-9]發(fā)生的分子改變。與此相一致的是，流式細(xì)胞儀檢測顯示SI-4650處理后FITC-Annexin V(+)凋亡細(xì)胞明顯增多。以上結(jié)果提示，SI-4650通過線粒體途徑誘導(dǎo)結(jié)腸癌CT-26細(xì)胞發(fā)生凋亡可能是其抗腫瘤機制之一。

本研究發(fā)現(xiàn)同時，隨著SI-4650劑量的增加，CT-26細(xì)胞中自噬激活相關(guān)蛋白beclin-1、自噬活性標(biāo)志性蛋白LC3-II表達(dá)水平均顯著增加而自噬底物P62蛋白含量下降。以上結(jié)果說明SI-4650有效誘導(dǎo)結(jié)腸癌CT-26細(xì)胞發(fā)生自噬。

細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬之間存在相互影響和相互關(guān)聯(lián)的機制。二者能被多種應(yīng)激刺激共同激活，共享多個調(diào)節(jié)分子，兩者之間相互影響和相互聯(lián)系共同調(diào)控細(xì)胞死亡[10-11]。為驗證SI-4650抗CT-26腫瘤細(xì)胞作用中自噬與凋亡的相關(guān)性，本研究聯(lián)合自噬抑制劑3-MA預(yù)處理后再使用SI-4650作用結(jié)腸癌CT-26細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3-MA預(yù)處理有效減少SI-4650引起的自噬活化蛋白beclin-1和自噬標(biāo)志蛋白LC3-II的表達(dá)，抑制SI-4650誘導(dǎo)的CT-26細(xì)胞自噬流進程；與此同時SI-4650誘導(dǎo)CT-26細(xì)胞凋亡的能力下降，凋亡細(xì)胞數(shù)減少，線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白表達(dá)、線粒體膜電位以及細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化程度均顯著下降；同時發(fā)現(xiàn)SI-4650對CT-26細(xì)胞增殖抑制率分別顯著下降，說明3-MA抑制CT-26細(xì)胞自噬的過程中可能干擾細(xì)胞線粒體凋亡途徑的順利進行，導(dǎo)致SI-4650誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用同時下降，減弱SI-4650抗腫瘤效應(yīng)。以上結(jié)果提示SI-4650誘導(dǎo)CT-26細(xì)胞凋亡和自噬是其抗腫瘤藥理活性分子機制之一，SI-4650誘導(dǎo)CT-26發(fā)生自噬對腫瘤細(xì)胞起殺傷作用，而非保護性自噬，此過程中抑制自噬會阻滯細(xì)胞凋亡發(fā)生。因此推測SI-4650抗CT-26結(jié)腸癌機制中，自噬對凋亡起促進作用。

綜上所述，SI-4650具有抗結(jié)腸癌CT-26細(xì)胞的藥理學(xué)活性，機制可能與抑制多胺代謝酶活性，干擾多胺代謝，減少多胺總含量以及誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞自噬和凋亡相關(guān)。本研究為以多胺代謝途徑為抗腫瘤靶點的臨床藥物研發(fā)提供新的思路和研究基礎(chǔ)。