郭 銳，秦衛(wèi)帥，張雙勇，張淑玲

(1.鄭州市中醫(yī)院腦病一科，河南 鄭州 450007；2.鄭州市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 鄭州 450003)

抑郁癥是嚴(yán)重威脅人類身心健康的重大疾病，目前全球約有9億人口患有不同程度的抑郁癥，且發(fā)病率逐年升高，預(yù)測到2020年，將成為世界第二大疾病[1]。越來越多的證據(jù)表明，腦內(nèi)免疫失衡是導(dǎo)致抑郁癥發(fā)生的關(guān)鍵原因[2-3]。小膠質(zhì)細(xì)胞作為腦內(nèi)的巨噬細(xì)胞，扮演著神經(jīng)系統(tǒng)“清道夫”的角色，可通過固有和適應(yīng)性免疫反應(yīng)參與神經(jīng)免疫調(diào)控[4]。那么，在抑郁癥狀態(tài)下，小膠質(zhì)細(xì)胞是否呈現(xiàn)過度激活態(tài)，其涉及的相關(guān)分子機(jī)制如何，尚鮮有深入報(bào)道。加味逍遙散是在經(jīng)方逍遙散基礎(chǔ)上增加姜黃、香附、酸棗仁等藥物，能增強(qiáng)原方的疏肝健脾、寧心安神功效，臨床療效明顯[5]。本研究以海馬小膠質(zhì)細(xì)胞為靶區(qū)，從免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的TLR4/NF-κB信號(hào)通路為切入點(diǎn)，探討加味逍遙散對LPS誘導(dǎo)的免疫損傷抑郁模型大鼠的保護(hù)作用及其機(jī)制，以期為該方在臨床上進(jìn)一步推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)健康雄性SD大鼠，60只，體質(zhì)量為180～220 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。實(shí)驗(yàn)期間大鼠均飼養(yǎng)在室溫(24±2)℃、相對濕度(50±5)%、光/暗周期12 h/12 h的標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境中，自由攝食飲水。

1.2 藥物

加味逍遙散由柴胡、白芍、當(dāng)歸、川芎、白術(shù)、茯苓、姜黃、香附、酸棗仁、郁金、甘草組成，藥材均購自鄭州市中醫(yī)院。該方提取兩次，第一次加入10倍量水浸泡30 min后武火煎煮至沸騰，轉(zhuǎn)為文火慢煎 1.5 h～2 h，倒出煎液，加入8倍量水再煎煮一次，合并兩次水煎液，濃縮至生藥量為2 g/ml后保存?zhèn)溆谩｛}酸氟西汀分散片購于禮來蘇州制藥有限公司，批號(hào)為0934A。

1.3 試劑與主要儀器

LPS購自美國Sigma公司；ELISA試劑盒購自南京建成生物公司；RIPA裂解液購自美國Thermo公司；兔抗大鼠Iba-1單克隆抗體購自美國Sigma公司；兔抗大鼠TLR4、NF-κB多克隆抗體購自英國Abcam公司；山羊抗兔二抗購自武漢博士德公司；超微量核酸蛋白測定儀購自英國BioDrop公司；凝膠成像分析儀購自美國Bio-Rad公司；組織切片機(jī)購自美國Thermo公司，顯微鏡購自德國Zeiss公司。

1.4 動(dòng)物分組、造模與給藥

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，進(jìn)行曠場實(shí)驗(yàn)，剔除掉自主活動(dòng)次數(shù)明顯偏離平均值的大鼠，并依照該指標(biāo)將動(dòng)物隨機(jī)分為5組，包括對照組、模型組、氟西汀組、加味逍遙散低、高劑量組，每組11只。除對照組外，其余組均參照文獻(xiàn)方法[6]，采用慢性LPS注射誘導(dǎo)抑郁大鼠模型，每天腹腔注射LPS 0.5 mg·kg-1，共14 d，對照組注射等量生理鹽水。于造模同時(shí)灌胃給藥，氟西汀組給藥劑量為10.8 mg·kg-1，加味逍遙散低、高劑量組分別給予臨床等效1、2倍劑量(3.64、7.28 g·kg-1)，正常組與模型組均給予等量蒸餾水，灌胃體積為10 ml·kg-1。末次給藥結(jié)束后1 h，對所有大鼠進(jìn)行行為學(xué)測試，完成后立即取材。

1.5 行為學(xué)測試

1.5.1 曠場測試 將大鼠放入底部及四周均為黑色的敞箱中，底部均勻劃分為25個(gè)小格。大鼠于敞箱中自由活動(dòng)1 min后，記錄其接下來4 min內(nèi)的水平活動(dòng)次數(shù)(四爪均落在小格內(nèi))和垂直站立次數(shù)(兩前爪抬離底部)。

1.5.2 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn) 將大鼠放入高50 cm、直徑20 cm、水深35 cm的透明圓柱形筒中，待大鼠適應(yīng)1 min后，記錄接下來4 min內(nèi)的不動(dòng)時(shí)間(以兩前爪停止游動(dòng)，身體漂浮為不動(dòng))。

1.6 免疫組化法檢測小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白Iba-1的表達(dá)

取固定于4%多聚甲醛溶液中的腦組織，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋后，以5 μm厚連續(xù)切片；分別用75%、95%、100%梯度乙醇脫水，浸蠟，水化，沖洗，滴加山羊血清封閉液，37℃孵育30 min，加Iba-1一抗孵育過夜；PBS洗3次，反應(yīng)增強(qiáng)液孵10 min，二抗孵10 min；沖洗，DAB染色，蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水，封片。將切片置于顯微鏡下進(jìn)行拍攝，并采用Image-Pro Plus軟件分析積分光密度值(integrated optical density, IOD)。

1.7 ELISA試劑盒檢測海馬勻漿液TNF-α、IL-6的含量

取冷凍保存的海馬組織，稱重，加入3倍量的生理鹽水，冰上勻漿，4℃、12 000 r·min-1離心10 min，取上清液，ELISA法檢測TNF-α、IL-6的含量，操作過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.8 Western blot法檢測TLR4、NF-κB蛋白的表達(dá)

取冷凍保存的海馬組織，加入一定量RIPA裂解液，冰上勻漿，在4℃、12 000 r·min-1條件下離心10 min，取上清液制備組織蛋白提取液，BCA試劑盒法測定總蛋白含量。制備分離膠和濃縮膠，蛋白上樣，SDS-PAGE凝膠電泳至溴酚藍(lán)跑出分離膠后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h，根據(jù)目的蛋白分子量裁剪條帶，分別加入稀釋后的一抗，4℃孵育過夜。次日用TBST液洗滌條帶4次，每次10 min，加入二抗室溫下孵育4 h，TBST液洗4次，每次10 min，之后進(jìn)行ECL顯影。應(yīng)用Image J軟件分析條帶灰度值，根據(jù)目的蛋白和內(nèi)參蛋白對應(yīng)灰度值的比值計(jì)算蛋白相對表達(dá)水平。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 加味逍遙散對大鼠行為學(xué)的影響

與對照組比較，模型組大鼠水平及垂直運(yùn)動(dòng)能力均顯著下降(P<0.01，表1)，強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間顯著增加(P<0.01)，抑郁樣行為顯著；與模型組比較，施加氟西汀及高劑量加味逍遙散干預(yù)后均能提高抑郁大鼠的自主活動(dòng)能力(P<0.01或P<0.05)，降低大鼠的不動(dòng)時(shí)間(P<0.01)，改善抑郁樣行為；與氟西汀組比較，加味逍遙散低劑量組不動(dòng)時(shí)間顯著增加(P<0.01)，但高劑量組各行為學(xué)均與氟西汀無明顯差異(P>0.05)。

Tab. 1 Effects of modified Xiaoyao San on behavior of rats n=10)

2.2 加味逍遙散對大鼠海馬小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白Iba-1表達(dá)量的影響

與對照組比較，模型組大鼠海馬Iba-1表達(dá)顯著增加(P<0.01，圖1，表2)，小膠質(zhì)細(xì)胞呈激活態(tài)；與模型組比較，施加氟西汀或高劑量加味逍遙散干預(yù)后，Iba-1表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)且基本恢復(fù)正常水平，小膠質(zhì)細(xì)胞逐漸恢復(fù)成靜息態(tài)；與氟西汀組比較，加味逍遙散高、低劑量組Iba-1表達(dá)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

Fig. 1 Immunohistochemical detection of hippocampal Iba-1 expression in rats(×200)

Tab. 2 Effect of modified Xiaoyao San on the expression of Iba-1 in hippocampus of rats n=5)

2.3 加味逍遙散對大鼠海馬勻漿液中TNF-α、IL-6含量的影響

LPS注射建立抑郁模型成功后，與對照組比較，模型組大鼠海馬炎癥因子TNF-α、IL-6含量顯著升高(P<0.01，表3)；與模型組比較，施加氟西汀或高劑量加味逍遙散組后，海馬中TNF-α、IL-6含量顯著下降(P<0.01)，同時(shí)，低劑量的加味逍遙散也能降低海馬TNF-α的水平(P<0.05)；與氟西汀組比較，高劑量加味逍遙散組TNF-α、IL-6含量無明顯差異(P>0.05)，低劑量加味逍遙散組IL-6含量升高(P<0.05)。

Tab. 3 Effects of modified Xiaoyao San on TNF-α and IL-6 in hippocampal homogenate of rats(pg/ml, n=5)

2.4 加味逍遙散對大鼠海馬TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)的影響

與對照組比較，模型組大鼠海馬TLR4、NF-κB表達(dá)均顯著升高(P<0.01，圖2，表4)；施加氟西汀或高劑量加味逍遙散干預(yù)后，TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)水平均得到明顯逆轉(zhuǎn)(P<0.01或P<0.05)，同時(shí)低劑量加味逍遙散也能下調(diào)TLR4表達(dá)；與氟西汀組比較，高、低劑量的加味逍遙散對TLR4、NF-κB表達(dá)的影響均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

Fig. 2 The protein expressions of hippocampal TLR4 and NF-κB in rats detected by Western blot

Tab. 4 Effects of modified Xiaoyao San on TLR4 and NF-κB expressions in hippocampus of rats n=4)

3 討論

抑郁癥動(dòng)物模型主要包括物理應(yīng)激和藥物誘導(dǎo)兩大類。近年來，免疫紊亂在抑郁癥發(fā)生過程中的作用日益受到重視，采用LPS腹腔注射的方法能建立抑郁癥神經(jīng)免疫損傷模型。本研究中，模型大鼠自主活動(dòng)能力下降，強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間增加，抑郁樣行為顯著；而在給予陽性藥氟西汀及中藥復(fù)方加味逍遙散后，動(dòng)物的抑郁樣行為明顯緩解。

海馬是負(fù)責(zé)機(jī)體學(xué)習(xí)、記憶的關(guān)鍵腦區(qū)，與抑郁癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。海馬主要由神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞組成，其中，小膠質(zhì)細(xì)胞被認(rèn)為是中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫監(jiān)督的關(guān)鍵細(xì)胞，具有巨噬細(xì)胞的特征，約占膠質(zhì)細(xì)胞總數(shù)的20%[7]。小膠質(zhì)細(xì)胞具有靜息和活化兩種狀態(tài)，在健康狀態(tài)下，MG呈靜息狀態(tài)；當(dāng)受到病理因素的刺激時(shí)，其被激活，由分枝狀變?yōu)榘⒚装蜖?，并釋放大量的氧自由基、促炎性因子等神?jīng)毒性物質(zhì)，引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)[8-9]。過度的炎癥反應(yīng)會(huì)刺激并損傷神經(jīng)元，進(jìn)而導(dǎo)致抑郁癥、阿爾茲海默癥、帕金森癥等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生[10]。因此，如何抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的過度活化，從而減輕炎癥反應(yīng)所引起的損傷顯得尤為重要。本研究發(fā)現(xiàn)，抑郁模型大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白Iba-1表達(dá)顯著增加，炎癥因子TNF-α、IL-6含量顯著上升，而加味逍遙散能抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的過度激活，減輕腦內(nèi)的炎癥反應(yīng)。

TLR4/NF-κB信號(hào)通路是調(diào)節(jié)TNF-α和IL-6等炎癥因子表達(dá)的重要途徑[11-12]。TLR4屬于I型跨膜受體蛋白，是一種模式識(shí)別受體，識(shí)別包括LPS在內(nèi)的多種配體。當(dāng)TLR4與相應(yīng)配體結(jié)合后，能進(jìn)一步激活NF-κB通路，從而促進(jìn)各種炎性細(xì)胞因子基因表達(dá)的激活、炎性因子產(chǎn)生和釋放[13]。在腦內(nèi)，TLR-4和NF-κB主要在小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，小膠質(zhì)細(xì)胞的活性受到TLR4/NF-κB通路的調(diào)控，以往研究發(fā)現(xiàn)，抑制TLR4的表達(dá)能夠降低小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，并減少神經(jīng)元凋亡[14]。因而，本研究認(rèn)為TLR4/NF-κB通路參與LPS抑郁大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞激活的過程。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組大鼠海馬TLR4、NF-κB表達(dá)均明顯升高，施加加味逍遙散治療后能逆轉(zhuǎn)該表達(dá)，說明該藥物是通過調(diào)控該通路而抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，并降低炎癥因子的表達(dá)水平，進(jìn)而保護(hù)海馬組織。

抑郁癥屬于中醫(yī)郁證范疇，多由于肝氣郁結(jié)、脾失健運(yùn)而致腦失神明，表現(xiàn)為胸脅脹滿、納呆、疲乏、燥渴等，病機(jī)屬本虛標(biāo)實(shí)，肝脾虧虛為本，氣機(jī)阻滯、心神不寧為標(biāo)，治宜健脾疏肝、寧心安神[15]。加味逍遙散是以《太平惠民和劑局方》中疏肝健脾經(jīng)典方劑逍遙散為基礎(chǔ)，根據(jù)臨床實(shí)踐，增加姜黃、香附、酸棗仁、郁金等藥物，組成加味逍遙散，以增強(qiáng)其疏肝解郁、寧心安神功效，臨床效果顯著[16]。綜上，加味逍遙散能明顯改善LPS誘導(dǎo)抑郁模型大鼠的抑郁樣行為，其作用機(jī)制可能與抑制海馬小膠質(zhì)細(xì)胞TLR4/NF-κB通路，進(jìn)而下調(diào)炎癥因子的表達(dá)有關(guān)。本文結(jié)果為臨床治療抑郁癥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。