李 輝 李德芳 鄧 勇 潘 根 陳安國 趙立寧 唐慧娟

紅麻海藻糖生物合成關(guān)鍵酶基因的克隆及響應(yīng)逆境的表達(dá)分析

李 輝1,2李德芳2,*鄧 勇2潘 根2陳安國2趙立寧2唐慧娟2

1湖南文理學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院, 湖南常德 415000;2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所, 湖南長沙 410205

海藻糖生物合成關(guān)鍵酶基因在植物響應(yīng)各種非生物脅迫過程中具有重要作用。為了明確紅麻基因在應(yīng)對非生物脅迫過程中的作用, 本研究根據(jù)轉(zhuǎn)錄組CL541.Contig2Unigene序列設(shè)計特異性引物, 通過PCR獲得紅麻基因的cDNA全長序列。生物信息學(xué)分析表明, 該基因最大開放讀碼框為1128 bp, 編碼一個含有375個氨基酸的蛋白質(zhì)。序列一致性分析發(fā)現(xiàn), 該蛋白質(zhì)氨基酸序列與其他物種TPPJ氨基酸序列的一致性為71.18%, 故將該基因命名。表達(dá)模式分析表明, 該基因在根、莖、葉中均有表達(dá), 在鹽、干旱脅迫下, 隨著脅迫時間的延長,表達(dá)顯著上調(diào), 表明該基因參與紅麻的鹽、干旱脅迫響應(yīng)過程。在鹽、干旱脅迫下,顯著上調(diào)表達(dá), 而外源噴施脫落酸時,表達(dá)變化不明顯。由此推測, 在紅麻響應(yīng)鹽、干旱脅迫過程中, 該基因的表達(dá)可能不受脫落酸信號分子的調(diào)控。這將為進(jìn)一步闡明該基因在紅麻響應(yīng)鹽、干旱脅迫過程的作用奠定基礎(chǔ)。

紅麻; 鹽脅迫; 海藻糖-6-磷酸磷酸酶; 脫落酸

海藻糖是由2個葡萄糖分子以1,1糖苷鍵構(gòu)成的非還原性糖, 廣泛存在于微生物、真菌、酵母、無脊椎動物和植物體內(nèi), 不僅可以作為生物體內(nèi)的能源、碳源, 還可以作為信號物質(zhì)調(diào)控生物體內(nèi)的物質(zhì)代謝和生長發(fā)育[1-2]。海藻糖對多種生物活性物質(zhì)具有非特異性保護(hù)作用, 在抵御高溫、干旱、高鹽堿等非生物逆境脅迫過程中具有重要作用[3-4]。謝冬微等[5]的研究表明, 在低溫脅迫條件下, 施加一定濃度的外源海藻糖能夠促進(jìn)冬小麥胚芽的生長, 提高其抗寒性。施加一定濃度的外源海藻糖不僅能夠提高玉米幼苗的抗寒性還能夠提高其對鹽脅迫的抗性[6-7]。

海藻糖的合成在不同生物體內(nèi)、不同外界環(huán)境下具有不同的途徑, 迄今為止, 已經(jīng)報道了5條生物合成途徑[8]。在植物體內(nèi)海藻糖的合成途徑是TPS/TPP途徑: 海藻糖-6-磷酸合成酶(trehalose- 6-phosphate synthase, TPS)催化葡萄糖從UDP-葡糖糖向葡萄糖-6-磷酸轉(zhuǎn)化形成海藻糖-6-磷酸和UDP, 然后海藻糖-6-磷酸磷酸酶(trehalose-6-phosphate phosphatase, TPP)催化海藻糖-6-磷酸脫磷酸化形成海藻糖。由此可知, TPP是植物體內(nèi)海藻糖合成途徑的最后一步關(guān)鍵酶。

植物體內(nèi)基因是以基因家族的形式存在。在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了10個基因(~), 共線性分析發(fā)現(xiàn), 這10個基因都是由全基因組復(fù)制產(chǎn)生的, 且都具有酵母異源表達(dá)活性[9]。通過酵母功能互補(bǔ)試驗, Vogel等[10]首次鑒定并克隆了2個擬南芥基因家族成員和。在酵母突變體中表達(dá)這2個基因能夠產(chǎn)生海藻糖, 實現(xiàn)功能互補(bǔ), 證明和基因具有編碼海藻糖-6-磷酸磷酸酶的活性。過表達(dá)基因能夠提高擬南芥植株淀粉和可溶性糖的含量, 從而提高擬南芥的耐鹽性[11]。水稻中有13個基因位點, 其中基因的表達(dá)受低溫脅迫、鹽脅迫、滲透脅迫和ABA處理的誘導(dǎo), 在12℃低溫脅迫下, 水稻根系TPP酶活性和海藻糖含量瞬時升高, 推測基因參與水稻早期的低溫脅迫響應(yīng)過程; 超表達(dá)分析表明,基因能夠激活一系列下游基因的表達(dá), 從而提高轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性和抗寒性[12-13]。以上研究表明,基因在植物響應(yīng)逆境脅迫過程中具有重要的作用, 可以作為作物抗逆遺傳改良的候選基因。

脫落酸(abscisic acid, ABA)是植物體內(nèi)響應(yīng)逆境脅迫的重要信號分子。大量研究表明, 9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶(9-cis-epoxycarotenoid, NCED)是ABA合成途徑的關(guān)鍵酶,基因的表達(dá)量能夠反應(yīng)植物內(nèi)源ABA含量的變化。Satoshi等[14]的研究表明, 缺失基因的擬南芥突變體, 體內(nèi)的ABA含量降低, 同時突變體對干旱脅迫敏感, 而提高基因的表達(dá)量, 能夠增加擬南芥體內(nèi)ABA的含量[15]。在擬南芥中, 超表達(dá)水稻基因能夠增加轉(zhuǎn)基因擬南芥的ABA含量, 且與野生型擬南芥相比更加耐旱[16]。

紅麻(L)是錦葵科木槿屬一年生草本植物。紅麻的栽培主要以收獲韌皮纖維為主要目的。紅麻纖維是重要的紡織原料, 主要用于麻繩、麻袋、地毯等[17-18]。隨著全球人口的增加, 人口、糧食、耕地之間的矛盾日益加劇, 紅麻的種植必須轉(zhuǎn)向鹽堿地、干旱坡地、不能生產(chǎn)糧食的重金屬污染土地。因此, 研究紅麻的耐逆機(jī)理、選育紅麻耐逆品種對維持紅麻產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

基因參與植物響應(yīng)逆境脅迫過程, 且具有多種生物功能。迄今為止, 有關(guān)紅麻基因參與逆境調(diào)控的研究還未見報道。本課題組前期通過對紅麻轉(zhuǎn)錄組序列(CL541.Contig2)分析發(fā)現(xiàn),基因表達(dá)受鹽脅迫的誘導(dǎo)[19]。因此, 本研究通過PCR擴(kuò)增獲得了CL541.Contig2 cDNA序列, 并通過熒光定量PCR分析了其在鹽、干旱、脫落酸不同逆境脅迫下的時空表達(dá)特征。

1 材料與方法

1.1 試驗材料的種植和處理

紅麻品種K215由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所紅麻育種課題組提供。挑選籽粒飽滿, 大小均勻的紅麻種子, 用0.1%的氯化汞消毒10 min, 蒸餾水沖洗3次, 然后播種于發(fā)芽盒, 光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)(溫度25~28℃, 光照13 h d-1)。培養(yǎng)10 d后, 選取植株健壯、長勢均勻的紅麻幼苗, 移植到1/2 Hoagland營養(yǎng)液中培養(yǎng), 直到紅麻幼苗植株長到四葉一心(14 d)。

1.1.1 紅麻植株的鹽脅迫處理 選取健壯的紅麻幼苗進(jìn)行NaCl脅迫處理。在1/2 Hoagland營養(yǎng)液中加入NaCl, 使其最終濃度分別為50 mmol L-1NaCl、100 mmol L-1NaCl、150 mmol L-1NaCl, 處理3 d, 每個處理5株, 每個處理重復(fù)3次。同時在150 mmol L-1NaCl條件下, 進(jìn)行不同時間脅迫處理, 處理時間分別為0.5、1、2、4、8 h。對照組按正常模式進(jìn)行培養(yǎng)。

1.1.2 紅麻植株的模擬干旱脅迫處理 選取健壯的紅麻幼苗進(jìn)行模擬干旱處理。在1/2 Hoagland營養(yǎng)液中加入PEG-6000, 使其最終濃度為10%, 脅迫處理時間分別為0.5、1、2、4、8 h; 對照組按正常模式進(jìn)行培養(yǎng)。每個處理5株, 每個處理重復(fù)3次。

1.1.3 紅麻植株的脫落酸噴施處理 對紅麻幼苗葉片噴施濃度為200 μmol L-1ABA溶液, 處理時間分別為0 (噴施清水)、1、2、4、6 h。每個處理5株, 每個處理重復(fù)3次。

1.2 紅麻HcTPPJ基因的克隆及測序

參照多糖多酚植物總RNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]說明書提取紅麻葉片總RNA, 然后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA作為基因克隆的模板。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組Unigene序列(編號: CL541.Contig2), 利用Primer Premier 5.0設(shè)計基因全長擴(kuò)增引物HcTPPJ-F/R (表1)?；蛉L擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系包含2.5 μL 10×LA PCR buffer (Mg2+plus)、0.25 μL LA酶(TaKaRa)、1 μL 2.5 mmol L-1dNTP、0.25 μL 10 μmol L-1HcTPPJ-F、0.25 μL 10 μmol L-1HcTPPJ-R、20 ng cDNA, ddH2O補(bǔ)足25 μL。基因全長擴(kuò)增PCR反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性2 min; 94℃變性30 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸90 s, 30個循環(huán); 72℃延伸3 min, 4℃終止反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。參照瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]的說明書切膠回收, 然后將回收片段連接到pMD19-T載體上, 轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞, 挑取陽性菌落送生工生物工程(上海)有限公司測序。

表1 本研究所用引物

1.3 紅麻HcTPPJ基因的生物信息學(xué)分析

利用NCBI在線程序ORF finder (http//www. ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)預(yù)測基因序列的最大開放讀碼框; 運(yùn)用在線工具(http:// www.expasy.ch/tools/pi_tool.html)預(yù)測基因編碼蛋白質(zhì)的分子量和等電點; 利用在線工具BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)對HcTPPJ的氨基酸序列進(jìn)行在線序列比對; 利用DNAMAN軟件進(jìn)行HcTPPJ氨基酸序列一致性比對; 利用MEGA6.0 軟件構(gòu)建基因系統(tǒng)進(jìn)化樹[17]。

1.4 不同器官紅麻HcTPPJ基因的表達(dá)特征

培養(yǎng)3 d后, 分別提取對照組紅麻根、莖、葉的總RNA, 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA作為熒光定量PCR的模板, 熒光定量PCR引物序列HcTPPJ-QF/QR見表1, 內(nèi)參基因為, 內(nèi)參引物為Actin-QF/QR (表1)[15]。熒光定量PCR的反應(yīng)體系為10 μL, 包含Power 2×SYBR PCR Premixture 5 μL、上下游引物各0.3 μL、cDNA 2 μL, ddH2O補(bǔ)足10 μL。熒光定量PCR的反應(yīng)程為95℃預(yù)變性2 min; 95℃變性15 s, 61℃退火15 s, 72℃延伸20 s, 40個循環(huán)。每個反應(yīng)3個生物學(xué)重復(fù), 每個生物學(xué)重復(fù)3個技術(shù)重復(fù)。

1.5 鹽、干旱、ABA脅迫下紅麻HcTPPJ基因的表達(dá)特征

分別提取對照組和150 mmol L-1NaCl處理組第3天植株的根、莖、葉總RNA, 150 mmol L-1NaCl處理組0.5、1、2、4、8 h不同脅迫時間以及50 mmol L-1NaCl、100 mmol L-1NaCl處理組植株葉片的總RNA; 分別提取對照組和干旱脅迫處理8 h植株的根、莖、葉總RNA以及0.5、1、2、4 h不同脅迫處理時間植株葉片的總RNA; 分別提取噴施ABA 0 (噴施清水)、1、2、4、6 h的植株葉片總RNA, 并反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為熒光定量PCR的模板, 熒光定量PCR引物序列HcTPPJ-QF/QR見表1, 內(nèi)參基因為, 內(nèi)參引物為Actin-QF/QR (表1)。熒光定量PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序同1.4。

1.6 鹽和干旱脅迫下紅麻脫落酸合成途徑關(guān)鍵酶基因HcNCED3的表達(dá)特征

分別提取對照組和150 mmol L-1NaCl脅迫下0.5、1、2、4 h不同時間植株葉片的總RNA; 分別提取對照組和干旱脅迫下0.5、1、2、4 h不同處理時間植株葉片的總RNA, 并反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為熒光定量PCR的模板, 熒光定量PCR引物序列HcNCED3-QF/QR見表1, 內(nèi)參基因為, 內(nèi)參引物為Actin-QF/QR (表1)。熒光定量PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序同1.4。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅麻HcTPPJ基因的克隆及測序

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組CL541.Contig2Unigene序列設(shè)計特異性引物, 以葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,結(jié)果如圖1所示。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收, 然后連接到pMD19-T載體上, 送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

圖1 HcTPPJ cDNA全長瓊脂糖凝膠電泳

M: DNA marker 2K Plus II; 1: PCR產(chǎn)物。

M: DNA marker 2K Plus II; 1: PCR product.

2.2 紅麻HcTPPJ基因的生物信息學(xué)分析

紅麻基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)上海生工sanger測序后發(fā)現(xiàn),基因cDNA序列全長1128 bp, 經(jīng)ORF finder在線預(yù)測, 該基因最大開放讀碼框為1128 bp, 編碼一個含有375個氨基酸的多肽蛋白, 其理論分子量為42.5 kD, 等電點為9.23。經(jīng)NCBI在線工具BLASTP序列比對后發(fā)現(xiàn),編碼的氨基酸序列與可可樹(XP007047993.1)、木槿(XP021300935.1)、榴蓮(XP022752277.1)、雷蒙德氏棉(XP012469771.1)、橡膠樹(XP021678420.1)、毛果楊(XP002307096.2)、石榴(XP031395344.1)中TPPJ氨基酸序列的相似性分別為92.53%、92.53%、91.73%、88.80%、80.05%、79.95%、79.09%。利用DNAMAN軟件將以上物種的TPPJ氨基酸序列同水稻、擬南芥的TPPJ氨基酸序列進(jìn)行一致性比對分析發(fā)現(xiàn), 其氨基酸序列的一致性為71.18%, TPPJ氨基酸序列在不同的物種間具有高度的相似性(圖2)。推測該基因可能在不同的物種具有相似的生物學(xué)功能, 故命名該基因為。利用MEGA6.0軟件構(gòu)建基因系統(tǒng)進(jìn)化樹, 結(jié)果如圖3所示。紅麻與木槿的親緣關(guān)系最近, 這可能是因為兩者同屬錦葵科木槿屬。

2.3 紅麻HcTPPJ基因在不同器官的表達(dá)特征

由圖4可知,基因在紅麻植株的根、莖、葉中均有表達(dá), 且其在根中的表達(dá)量高于莖、葉中。說明是一個組成型表達(dá)基因。

2.4 鹽脅迫下紅麻HcTPPJ基因的表達(dá)特征

由圖5可知, 150 mmol L-1NaCl溶液脅迫3 d后, 根、莖、葉中基因的表達(dá)顯著上調(diào), 與對照相比, 該基因在根、葉中的上調(diào)表達(dá)量達(dá)到了極顯著差異水平(<0.01)。由圖6可知, 葉片中基因的表達(dá)量隨著NaCl溶液濃度的增加先降低后升高, 當(dāng)NaCl溶液濃度為150 mmol L-1時,基因的表達(dá)量與對照(0 mmol L-1NaCl)差異達(dá)極顯著水平(<0.01)。由圖7可知, 在150 mmol L-1NaCl溶液脅迫下, 隨著時間的增加,基因在葉片中的表達(dá)量呈現(xiàn)先下降后上升然后再下降的變化趨勢, 當(dāng)NaCl溶液脅迫4 h時,基因的表達(dá)量達(dá)到最高, 且與對照相比達(dá)極顯著差異水平(<0.01)。這可能是因為低濃度的NaCl脅迫或短時間的NaCl脅迫能夠促進(jìn)紅麻的生長, 而高濃度或者長時間的脅迫會抑制紅麻的生長。表明基因的表達(dá)受鹽脅迫的誘導(dǎo), 可以進(jìn)一步研究其在紅麻響應(yīng)鹽脅迫過程的作用。

2.5 干旱脅迫下紅麻HcTPPJ基因的表達(dá)特征

干旱脅迫8 h時, 紅麻植株根、莖、葉中基因均上調(diào)表達(dá), 且在干旱脅迫下,基因在根、莖、葉的表達(dá)量與對照相比差異顯著(<0.05)(圖8-A)。隨著干旱脅迫時間的增加,基因在葉片中的表達(dá)量呈先下降再上升然后再下降的變化趨勢(圖8-B), 在干旱脅迫4 h時,基因的表達(dá)量最高, 且與對照相比差異極顯著(<0.01)。這可能是因為短期的干旱脅迫有利于紅麻的生長, 而隨著干旱脅迫時間的延長, 紅麻的生長逐漸受到抑制。表明基因的表達(dá)受干旱脅迫的誘導(dǎo)。

圖2 紅麻HcTPPJ與其他植物TPPJ蛋白氨基酸序列一致性比對

OsTPP1: 水稻; AtTPPA、AtTPPB、AtTPPD: 擬南芥; TPPJ: 可可樹、木槿、榴蓮、雷蒙德氏棉、毛果楊、紅麻、橡膠樹、石榴。不同顏色代表不同氨基酸殘基的保守性。藍(lán)色表示氨基酸完全保守; 粉紅色、青色、黃色分別表示氨基酸的保守性為75%以上、50%以上及33%以上; 白色表示氨基酸的保守性不足33%。

OsTPP1:; AtTPPA, AtTPPB, AtTPPD:; TPPJ:,,,,,,,. The different colors indicate that conservatism of different amino acid residues. The blue means amino acids are complete conservation, the pink, cyan, yellow mean that the conservation of amino acids is no less than 75%, no less than 50%, no less than 33%, respectively, and white mean no more than 33%.

圖3 紅麻HcTPPJ基因與其他植物TPPJ基因系統(tǒng)進(jìn)化樹

TPPJ: 可可樹、木槿、榴蓮、雷蒙德氏棉、毛果楊、紅麻、橡膠樹、石榴; AtTPPA、AtTPPB、AtTPPD: 擬南芥; OsTPP1: 水稻。

TPPJ:,,,,,,,; AtTPPA, AtTPPB, AtTPPD:; OsTPP1:.

圖4 HcTPPJ基因在不同器官的表達(dá)

* 表示在0.05水平下差異顯著。誤差線為每組處理的標(biāo)準(zhǔn)誤差(= 3)。

* indicates significantly different at the 0.05 probability level. Error bars represent the standard error of each treating group (= 3).

圖5 150 mmol L-1 NaCl脅迫3 d后HcTPPJ基因在不同器官的表達(dá)

*與**分別表示在0.05和0.01水平下差異顯著。誤差線為每組處理的標(biāo)準(zhǔn)誤差(= 3)。

* and ** indicate significantly different at the 0.05 and 0.01 proba-bility levels, respectively. Error bars represent the standard error of each treating group (= 3).

圖6 不同NaCl濃度脅迫下HcTPPJ基因在葉片的表達(dá)

*與**分別表示在0.05和0.01水平下差異顯著。誤差線為每組處理的標(biāo)準(zhǔn)誤差(= 3)。

* and ** indicate significantly different at the 0.05 and 0.01 probability levels, respectively. Error bars represent the standard error of each treating group (= 3).

圖7 150 mmol L-1 NaCl脅迫下不同時間HcTPPJ基因在葉片的表達(dá)

**表示在0.01水平下差異顯著。誤差線為每組處理的標(biāo)準(zhǔn)誤差(= 3)。

** indicate significantly different at the 0.01 probability level. Error bars represent the standard error of each treating group (= 3).

圖8 干旱脅迫8 h HcTPPJ在不同器官的表達(dá)(A)和干旱脅迫下不同時間HcTPPJ基因在葉片的表達(dá)(B)

*與**分別表示在0.05和0.01水平下差異顯著。誤差線為每組處理的標(biāo)準(zhǔn)誤差(= 3)。

* and ** indicate significantly different at the 0.05 and 0.01 probability levels, respectively. Error bars represent the standard error of each treating group (= 3).

2.6 鹽、干旱脅迫下紅麻脫落酸(ABA)合成途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)特征

由圖9可知, 隨著鹽脅迫時間的延長,基因的表達(dá)量先下降后上升然后再下降后上升; 隨著干旱脅迫時間的延長,基因的表達(dá)量先上升再下降。在鹽、干旱脅迫0.5 h后,基因表達(dá)量總體呈現(xiàn)上調(diào)趨勢, 其表達(dá)量與對照相比差異達(dá)極顯著水平(<0.01)。表明, 在鹽、干旱脅迫下, 紅麻植株體內(nèi)ABA的含量增加, 且ABA可能在不同的時間誘導(dǎo)不同的基因表達(dá)。

圖9 鹽(A)、干旱(B)脅迫下HcNCED3基因在不同時間的表達(dá)

*與**分別表示在0.05和0.01水平下差異顯著。誤差線為每組處理的標(biāo)準(zhǔn)誤差(= 3)。

* and ** indicate significantly different at the 0.05 and 0.01 probability levels, respectively. Error bars represent the standard error of each treating group (= 3).

2.7 外源激素ABA調(diào)控紅麻HcTPPJ基因的表達(dá)特征

ABA在植物響應(yīng)逆境脅迫過程中具有重要的調(diào)控作用。為了明確基因是否受ABA的調(diào)控, 本研究利用熒光定量PCR技術(shù)分析了噴施200 μmol L-1ABA溶液后, 紅麻葉片基因的表達(dá)特征。由圖10可知, 噴施ABA后, 隨著時間的延長,基因在葉片中的表達(dá)量先下降后上升, 但是同對照相比, 其下調(diào)和上升的表達(dá)量都不明顯。由此推測,基因的表達(dá)可能不受ABA的誘導(dǎo)。

3 討論

海藻糖是一種穩(wěn)定的可溶性非還原糖, 能夠作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來提高植物適應(yīng)非生物逆境脅迫的能力。李昉峻等[20]研究表明, 鎘脅迫下海藻糖能夠顯著抑制水稻幼苗對鎘離子的吸附和積累。龐椿朋等[21]研究表明, 高溫脅迫下, 對番茄葉片噴施1.0%的海藻糖溶液能夠顯著促進(jìn)番茄葉片的光合作用。在植物體內(nèi), TPP是海藻糖合成的關(guān)鍵酶, 因此, 研究基因的生物功能對提高植物的抗逆性具有重要意義。

圖10 ABA脅迫下HcTPPJ基因在不同時間的表達(dá)

誤差線為每組處理的標(biāo)準(zhǔn)誤差(= 3)。Error bars represent the standard error of each treating group (= 3).

基因在植物響應(yīng)非生物逆境脅迫過程中具有重要作用。楊雪等[22]的研究表明, 同對照相比, 干旱和鹽脅迫下基因在水稻幼苗根和芽中的表達(dá)量顯著提高。丁澤紅等[23]研究表明, 在干旱脅迫下,基因在木薯根和葉片中的表達(dá)量顯著上升。本研究通過熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn), 在鹽、干旱脅迫下,基因在紅麻植株根、莖、葉中的表達(dá)量顯著上升, 隨著鹽脅迫濃度的提高, 鹽脅迫、干旱脅迫時間的延長, 葉片中基因的表達(dá)量顯著上升。表明基因的表達(dá)受鹽、干旱脅迫的誘導(dǎo), 推測其在紅麻響應(yīng)鹽、干旱脅迫過程中具有重要作用。

脫落酸是廣泛分布在植物體內(nèi)的天然激素, 同時作為重要的信號分子能夠誘導(dǎo)某些抗逆基因的表達(dá), 提高植物的耐逆性。在高鹽、干旱、低溫等逆境脅迫下具有重要作用, 且受ABA誘導(dǎo)表達(dá)的基因已陸續(xù)被克隆, 如紅麻[18]、番茄[24]等。本研究通過熒光定量分析發(fā)現(xiàn), 在紅麻葉片中基因的表達(dá)受鹽、干旱脅迫誘導(dǎo), 且隨著脅迫時間的延長,的表達(dá)量顯著上升, 這表明紅麻植株體內(nèi)ABA的含量在不斷增加。

在鹽、干旱脅迫下, 紅麻葉片基因與ABA合成途徑關(guān)鍵酶基因都呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)趨勢。為了研究基因的表達(dá)是否受ABA信號分子的誘導(dǎo), 本研究以ABA作為信號分子, 對葉片噴施200 μmol L-1ABA溶液。通過熒光定量分析發(fā)現(xiàn), 噴施ABA溶液后隨著時間的延長,基因在紅麻葉片中的表達(dá)量變化不明顯, 這表明基因的表達(dá)不受ABA的誘導(dǎo)。

4 結(jié)論

基因可能在紅麻響應(yīng)鹽、干旱脅迫過程中具有重要作用。在紅麻響應(yīng)鹽、干旱脅迫過程中,基因表達(dá)可能不受ABA的信號調(diào)控。關(guān)于基因如何在紅麻響應(yīng)鹽、干旱脅迫過程中發(fā)揮作用還需要進(jìn)一步的研究。

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Cloning of the key enzyme genein trehalose biosynthesis of kenaf and its expression in response to abiotic stress in kenaf

LI Hui1,2, LI De-Fang2,*, DENG Yong2, PAN Gen2, CHEN An-Guo2, ZHAO Li-Ning2, and TANG Hui-Juan2

1College of Life and Environment Science, Hunan University of Arts and Science, Changde 415000, Hunan, China;2Institute of Bast Fiber Crops, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Changsha 410205, Hunan, China

Trehalose biosynthesis key enzyme geneplays an important role in plant response to various abiotic stresses. In this study, in order to clarify the role ofgene in response to abiotic stress in kenaf, a specific primer was designed according to the sequence of CL541.contig2unigene, and the full-length cDNA sequence ofgene was obtained by PCR. Bioinformatics analysis showed thathad an open reading frame (ORF) length of 1128 bp, and encoded a protein containing 375 amino acids. The results of amino acid sequence consistency indicated that the agreement between the amino acid sequence of protein and that of TPPJ from other species was 71.18%, so the gene named as.was expressed in roots, stems and leaves. Under salt or drought stress,was up-regulated significantly with the extension of stress treatment, indicating that the gene was involved in the response process of salt or drought stress in kenaf. Under the same conditions,andwas significantly up-regulated, while the change ofexpression was not obvious under ABA stress;was significantly down-regulated, under the stress of MeJA for six hours. Therefore it was speculated that thegene expression may be not regulated by the signal molecule of ABA, but negatively regulated by methyl jasmonate signal molecule. This study will lay a solid foundation for further elucidating the role of the gene in response to salt and drought stress in kenaf.

kenaf; salt stress; trehalose-6-phosphate phosphatase; ABA

本研究由國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項-紅麻育種項目(CARS-19-E07), 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程一年生麻類育種項目(ASTIP-IBFC03), 湖南省教育廳項目(18C0737)和湖南文理學(xué)院博士科研啟動項目(17BSQD13)資助。

This study was supported by the China Agriculture Research System (CARS-19-E07), the Agricultural Science and Technology Innovation Program at the Chinese Academy of Agricultural Science (ASTIP-IBFC03), the Hunan Education Department Project (18C0737), and the Doctoral Research Start-up Project of Hunan University of Arts and Sciences (17BSQD13).

李德芳, E-mail:18973612200@163.com

E-mail: guangjunmuzi@126.com

2020-01-10;

2020-08-19;

2020-09-08.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20200905.1226.002.html

10.3724/SP.J.1006.2020.04006