楊夢(mèng)婷 張 春 王作平 鄒華文 吳忠義,*

研究簡(jiǎn)報(bào)

玉米基因的克隆及功能研究

楊夢(mèng)婷1,2,**張 春2,**王作平2鄒華文1,*吳忠義2,*

1長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 湖北荊州 434023;2北京市農(nóng)林科學(xué)院 / 北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心 / 農(nóng)業(yè)基因資源與生物技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100097

bHLH轉(zhuǎn)錄因子是植物第二大轉(zhuǎn)錄因子家族, 在調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和逆境脅迫響應(yīng)等方面發(fā)揮著重要的作用。為了研究玉米bHLH家族基因在逆境脅迫響應(yīng)中的功能, 本研究從玉米根組織中克隆了(AC: NC_AQK75074)基因。生物信息學(xué)分析表明: 該基因包含3個(gè)外顯子, cDNA全長(zhǎng)1460 bp, 編碼序列全長(zhǎng)1059 bp, 編碼352個(gè)氨基酸; 在玉米基因組中以單拷貝形式存在, 功能未知; ZmbHLH161蛋白分子量為37.1 kD, 理論等電點(diǎn)為6.10, 具有bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族特有的保守結(jié)構(gòu)域, 但不具跨膜結(jié)構(gòu), 無(wú)信號(hào)肽, 為親水性蛋白, 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)無(wú)規(guī)則卷曲所占比例最大, 為42.05%。玉米原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)試驗(yàn)表明, ZmbHLH161定位在細(xì)胞核內(nèi)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qPCR)分析表明, 正常生長(zhǎng)條件下,主要在根系和幼胚中表達(dá); 在脫水和干旱處理下,在玉米苗期葉片中上調(diào)表達(dá)。轉(zhuǎn)基因異源表達(dá)擬南芥株系經(jīng)不同濃度NaCl處理后, 其根長(zhǎng)與野生型差異不顯著, 而不同濃度甘露醇處理后其根長(zhǎng)優(yōu)于野生型。由此推測(cè)基因可能參與玉米對(duì)滲透脅迫應(yīng)答。

玉米;; 轉(zhuǎn)錄因子; 原生質(zhì)體; qPCR; 滲透脅迫

玉米是我國(guó)第一大農(nóng)作物, 種植面積3300多萬(wàn)公頃, 其總產(chǎn)量2億多噸, 在我國(guó)糧食安全和國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展中起著重要作用[1]。玉米起源于南美洲高溫多濕的熱帶地區(qū), 喜溫、需水較多、耐旱性不強(qiáng), 耐鹽性較差[2]。如今, 隨著人類活動(dòng)范圍的擴(kuò)大, 生態(tài)環(huán)境也遭受著巨大的破環(huán), 如土壤沙漠化、鹽堿化、水流污染和地下水枯竭等, 而土壤干旱、鹽堿化則嚴(yán)重影響玉米產(chǎn)量, 如何提高玉米對(duì)干旱、高鹽等不利因素的抵抗能力越來(lái)越受到重視。

轉(zhuǎn)錄因子(transcription factors) 是RNA聚合酶在真核生物特異啟動(dòng)子上起始轉(zhuǎn)錄所需要的作用因子, 由DNA結(jié)合區(qū)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)、寡聚化位點(diǎn)和核定位信號(hào)區(qū)組成[3]。bHLH (堿性/螺旋-環(huán)-螺旋, basic/Helix-Loop-Helix)轉(zhuǎn)錄因子名稱來(lái)自其結(jié)構(gòu)中的bHLH基序, bHLH結(jié)構(gòu)域由50~60個(gè)氨基酸組成, 其結(jié)構(gòu)包括2個(gè)保守區(qū)域: 一是長(zhǎng)度為10~15個(gè)氨基酸的堿性區(qū)域, 分布在多肽鏈的N端,含有大量堿性氨基酸, 與DNA結(jié)合相關(guān); 另一為長(zhǎng)度40個(gè)氨基酸左右HLH區(qū)域, 分布在C端, 主要由疏水氨基酸殘基構(gòu)成, 利于HLH之間相互作用形成二聚體, 其中環(huán)的長(zhǎng)度在不同bHLH蛋白中會(huì)有差異。1989年Murre等[4]從小鼠中首次鑒定出bHLH轉(zhuǎn)錄因子E12和E47, 之后越來(lái)越多bHLH轉(zhuǎn)錄因子在線蟲、果蠅、小鼠和人類中得到了分離鑒定。Nuno等[5]發(fā)現(xiàn), 在4.4億年前的早期陸地植物中就已經(jīng)存在bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族。在研究較為深入的動(dòng)物中, 依據(jù)其進(jìn)化關(guān)系和DNA結(jié)合模式, 將bHLH蛋白分為6個(gè)組(A~F組)[6], 而植物中bHLH蛋白大多數(shù)都屬于B組。與植物逆境抗性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子家族中, 研究較多的有bZIP、WRKY、AP2/EREBP和MYB四大類[7], bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族在植物抗逆中的研究則相對(duì)滯后, 正因如此, 引起了科學(xué)家們廣泛關(guān)注。bHLH轉(zhuǎn)錄因子是一個(gè)大家族, 在調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育[8-11]、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[12-15]和逆境脅迫響應(yīng)[16-19]方面發(fā)揮著重要作用。其中bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因不僅能促進(jìn)玉米側(cè)根生長(zhǎng)發(fā)育, 而且對(duì)促進(jìn)ABA合成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和提高耐旱性等方面都起到正向調(diào)控作用[20]。目前, 在擬南芥和水稻中分別鑒定到了162個(gè)和167個(gè)bHLH家族成員[21-22]。Zhang等[23]利用全基因組分析在玉米中鑒定到208個(gè)bHLH蛋白, 并通過與擬南芥bHLH蛋白進(jìn)行比較, 將這些蛋白劃分為18個(gè)亞家族。而其他植物因?yàn)榛蚪M測(cè)序工作開展得較晚, 因此對(duì)其基因組中的bHLH家族成員分析還未見報(bào)道。由于已知的植物bHLH基因序列主要來(lái)源于水稻和擬南芥這兩種模式植物, 對(duì)其他植物bHLH蛋白的功能研究開展的還比較少。

前期工作中, 我們對(duì)玉米根系生長(zhǎng)發(fā)育4個(gè)關(guān)鍵時(shí)期進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析, 在相鄰時(shí)期間均顯著差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子中, 鑒定到唯一一個(gè)bHLH家族轉(zhuǎn)錄因子基因, 推測(cè)該基因可能在調(diào)控玉米根系生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮重要的作用, 那么作為bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族的成員之一, 它是否也參與逆境脅迫響應(yīng)呢？為了證實(shí)這一猜測(cè), 我們首先克隆了玉米基因, 對(duì)其表達(dá)模式、亞細(xì)胞定位以及在高鹽、脫水、低溫和干旱脅迫處理下的表達(dá)情況進(jìn)行了研究; 然后將該基因在擬南芥中進(jìn)行了異源表達(dá), 利用轉(zhuǎn)基因擬南芥株系進(jìn)行相關(guān)耐逆性研究, 初步探索了玉米轉(zhuǎn)錄因子的功能, 旨在為玉米抗逆遺傳改良提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料及試劑

試驗(yàn)材料為玉米自交系B73、鄭58、野生型擬南芥()和農(nóng)桿菌GV3101, 以上材料均為本實(shí)驗(yàn)室提供。

試驗(yàn)所用試劑為大腸桿菌Trans1-T1、pEASY T5 Zero Clone載體、RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒等均購(gòu)于北京全式金公司; Ex、LA、SYBRPremix ExII (Tli RNaseH Plus)等購(gòu)于TaKaRa公司; EDTA、蔗糖、NaCl、乙醇、Tris、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉酚、氯仿、異戊醇、異丙醇、濃硫酸、PEG-4000、冰醋酸、濃鹽酸、甘油、瓊脂糖、蛋白胨、酵母粉和β-巰基乙醇等生化試劑均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司, 所有的測(cè)序工作都由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

試驗(yàn)所用設(shè)備為低溫高速臺(tái)式離心機(jī)(型號(hào): MUITLFUGE X1R); 低溫臺(tái)式水平離心機(jī)(型號(hào): SC-3612); PCR儀(型號(hào): T100 Thermal Cycler); 激光共聚焦顯微鏡(型號(hào): Leica TCS SP8)。

玉米材料處理: 挑選顆粒飽滿的自交系B73種子種植于溫室花盆中, 分別設(shè)置對(duì)照組、脫水處理組、鹽(0.2 mol L–1NaCl)處理組、冷(4℃)處理組、不澆水干旱處理組, 每組6盆, 每盆2株, 各設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。玉米幼苗正常生長(zhǎng)至三葉一心時(shí)分別進(jìn)行脫水、高鹽、冷、干旱處理, 分別取脫水(將盆栽三葉期玉米幼苗整株取出, 用流水沖洗掉泥土, 用吸水紙吸收表面多余水分后, 室溫放置, 自然脫水)、高鹽、冷處理0、1、2、5、10和24 h后材料的葉片和根, –80℃凍存。不澆水干旱處理取0、3、7和12 d后的葉片和根(其中0 d為最后一次充分澆水時(shí)取樣), –80℃凍存。組織差異表達(dá)材料取露地栽培自然生長(zhǎng)至三葉期幼苗的根、葉以及抽雄期的根、莖、葉、雄穗、花絲、幼胚, –80℃凍存。

1.2 ZmbHLH161 cDNA的克隆及生物信息學(xué)分析

按照Transzol Up Plus RNA Kit試劑盒(北京全式金公司)說明提取玉米根組織的總RNA, 逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA模板。依據(jù)基因信息利用Primer 5設(shè)計(jì)1號(hào)引物對(duì)(表1), 以逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 反應(yīng)程序?yàn)? 94℃預(yù)變性60 s; 98℃ 10 s, 68℃ 70 s, 30個(gè)循環(huán); 72℃延伸10 min, 獲得全長(zhǎng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收后連接至T5Zero載體, 獲得單克隆后送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行菌落測(cè)序。各引物序列見表1。

用DNAMAN 8軟件進(jìn)行序列比對(duì)分析, 應(yīng)用ProParam (http://web.expasy.org/protparam/)分析玉米ZmbHLH161的編碼氨基酸的數(shù)目、蛋白相對(duì)分子量、等電點(diǎn)等理化性質(zhì); 應(yīng)用SPOMA (https://npsa-prabi.ibcp. fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_opma.html)) 在線分析軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu), 利用(https://www. swissmodel.expasy.org/)預(yù)測(cè)其空間結(jié)構(gòu); 利用在線分析軟件TMHMM2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)對(duì)氨基酸序列進(jìn)行跨膜分析; 用在線軟件BaCelLo (http://gpcr2.biocomp.unibo.it/bacello/pred.htm)對(duì)ZmbHLH161進(jìn)行了亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè); 用在線軟件Plant CARE (http: //bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對(duì)轉(zhuǎn)錄起始位置ATG上游長(zhǎng)度為2 kb啟動(dòng)子的序列進(jìn)行分析。

表1 本試驗(yàn)中所用的引物

1.2.1 植物表達(dá)載體pYBA1132:ZmbHLH161:EGFP的構(gòu)建 使用2號(hào)引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增, 獲得在5′端和3′端分別引入R I、d III酶切位點(diǎn)的基因編碼區(qū), PCR產(chǎn)物經(jīng)R I、dIII雙酶切連接至PYBA1132表達(dá)載體上獲得重組載體。將重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Trans1-T1)后, 挑取陽(yáng)性克隆測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.2 玉米原生質(zhì)體的提取及轉(zhuǎn)化 以玉米自交系鄭58黃化苗胚芽鞘為材料, 依據(jù)Song-Dong[24]的方法進(jìn)行改良后提取原生質(zhì)體并轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體23℃黑暗孵育16 h后, 輕輕混勻后再加入終濃度為5 μmol L–1的DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole)染色5 min, PBS緩沖液洗滌后置于激光共聚焦顯微鏡下觀看熒光情況。

1.3 玉米ZmbHLH161基因表達(dá)模式分析

按照試劑盒的說明提取地上部及根RNA, 逆轉(zhuǎn)錄后作為qPCR模板。設(shè)計(jì)3號(hào)特異引物對(duì)及內(nèi)參基因特異引物5號(hào)引物對(duì)。應(yīng)用BIO-RAD CFX96 Real-Time System qPCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增。反應(yīng)體系如下: 10 μL 2×SYBR Premix Ex、0.5 μL GSP (10 μmol L–1)、1 μL cDNA模板、8.5 μL ddH2O。PCR條件: 95℃ 30 s; 95℃ 10 s, 60℃ 20 s, 共40個(gè)循環(huán); 融解曲線分析, Step 1: 95℃ 10 s; Step 2: 65℃ 1 min; Step 3: 95℃ 15 s。每組試驗(yàn)設(shè)3個(gè)生物學(xué)樣本, 每個(gè)生物學(xué)樣本設(shè)3個(gè)技術(shù)重復(fù), 數(shù)據(jù)為3個(gè)生物學(xué)重復(fù)平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。應(yīng)用2–??CT方法分析在各組織中的相對(duì)表達(dá)情況[25]。逆境處理試驗(yàn)分別以0 h時(shí),在幼苗根和葉片的表達(dá)量計(jì)為1, 組織差異表達(dá)試驗(yàn)中以抽雄期花絲的該基因表達(dá)量計(jì)為1。

1.4 植物異源表達(dá)載體pYBA1132:ZmbHLH161的構(gòu)建及擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化

1.4.1 異源表達(dá)載體構(gòu)建 設(shè)計(jì)4號(hào)引物對(duì)擴(kuò)增獲得含有酶切位點(diǎn)的編碼區(qū)片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)R I、I雙酶切連接至pYBA1132表達(dá)載體上獲得重組載體, 將重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Trans1-T1)后, 挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行菌體PCR檢驗(yàn)及酶切驗(yàn)證, 并送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.4.2 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101及侵染擬南芥 pYBA1132:重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101, 篩選鑒定后通過浸花法[26]侵染擬南芥幼苗。單株收取T0代種子, 經(jīng)卡那霉素抗性篩選后獲得T1代轉(zhuǎn)基因擬南芥。提取T1代幼苗葉片基因組DNA為模板, 以4號(hào)引物對(duì)為引物進(jìn)行PCR檢測(cè), 單株收獲陽(yáng)性植株種子并加代獲得T3代純合植株。

1.4.3 轉(zhuǎn)基因擬南芥種子逆境處理 利用含NaCl、甘露醇的1/2 MS培養(yǎng)基對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥分別模擬鹽和滲透脅迫。NaCl濃度梯度為0、0.10、0.15和0.18 mol L–1, 甘露醇濃度梯度為0、0.15、0.20和0.30 mol L–1, 調(diào)pH 5.8。逆境脅迫處理試驗(yàn): 將擬南芥種子用消毒液消毒后, 將1/2 MS固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)7 d的轉(zhuǎn)基因和野生型擬南芥幼苗(根長(zhǎng)相同), 分別移栽到含不同濃度NaCl、甘露醇的1/2 MS固體培養(yǎng)基上。培養(yǎng)基分為兩部分, 野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥各占一半, 各移6株, 設(shè)3個(gè)重復(fù), 垂直放置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 7 d后統(tǒng)計(jì)擬南芥根長(zhǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米轉(zhuǎn)錄因子基因ZmbHLH161序列擴(kuò)增與生物信息學(xué)分析

從玉米根中提取RNA, 經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA, 以其為模,板用1號(hào)引物對(duì)擴(kuò)增獲得目的基因, 經(jīng)測(cè)序表明,基因的cDNA序列全長(zhǎng)1460 bp, 編碼352個(gè)氨基酸。氨基酸序列比對(duì)表明,基因含有典型的HLH結(jié)構(gòu)域(圖1-A)。生物信息學(xué)分析表明, 其蛋白分子量為37.1 kD, 理論等電點(diǎn)pI為6.10; 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)無(wú)規(guī)則卷曲所占比例最大, 為42.05%, 其次是α螺旋(34.66%), 其空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果如圖1-B所示。該蛋白無(wú)信號(hào)肽, 為親水性蛋白, 無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)(圖1-C)。亞細(xì)胞定位分析預(yù)測(cè)可能定位在細(xì)胞核。

圖1 ZmbHLH161生物信息學(xué)分析

A: 氨基酸序列比對(duì); B: 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè); C: 跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

A: amino acid sequence alignment; B: protein secondary structure prediction; C: transmembrane structure prediction.

序列比對(duì)結(jié)果顯示,()和()同水稻()同源性較高, 與擬南芥中的、()和()具有較高的相似性(圖2)。

啟動(dòng)子序列分析結(jié)果如圖3,基因啟動(dòng)子含有多個(gè)與逆境脅迫相關(guān)的順式作用元件, 如ABRE響應(yīng)ABA脅迫、MYB響應(yīng)干旱脅迫以及MYC響應(yīng)ABA、低溫脅迫。

2.2 亞細(xì)胞定位結(jié)果與分析

構(gòu)建瞬時(shí)表達(dá)載體pYBA1132:ZmbHLH161:EGFP并轉(zhuǎn)化玉米原生質(zhì)體, 通過融合蛋白GFP熒光顯示目的蛋白的亞細(xì)胞定位。原生質(zhì)體經(jīng)DAPI染色后置于激光共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)(圖4)，轉(zhuǎn)有綠色熒光蛋白空載體對(duì)照pYBA1132的玉米原生質(zhì)體中, 整個(gè)細(xì)胞都有綠色熒光分布, 無(wú)明顯細(xì)胞器定位特異性, 而轉(zhuǎn)入目的基因的原生質(zhì)體中, GFP綠色熒光只分布在細(xì)胞核, 并且與核特異染料DAPI的藍(lán)色熒光完全重合, 表明ZmbHLH161定位于細(xì)胞核內(nèi)。

2.3 玉米ZmbHLH161在不同組織中的表達(dá)情況

分別提取三葉期幼苗的根、葉, 抽雄期的根、莖、葉、雄穗、花絲和幼胚組織總RNA, 逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA后進(jìn)行qPCR分析, 結(jié)果表明,在不同組織中表達(dá)差異較大, 以抽雄期花絲中的表達(dá)量為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較, 生長(zhǎng)旺盛期根中的表達(dá)量最高, 約為花絲中表達(dá)量的29.2倍; 其次是幼根和幼胚, 分別為8.3倍和5.4倍; 其他組織的表達(dá)量均低于花絲, 幼葉中的表達(dá)量最低(圖5), 表明基因可能參與玉米根和幼胚的生長(zhǎng)發(fā)育。

圖2 擬南芥、水稻和玉米bHLH轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 不同逆境處理對(duì)葉片和根中ZmbHLH161表達(dá)的影響

由圖6可知, 不澆水干旱處理下, 葉片中的表達(dá)量在1~7 d一直呈下調(diào)趨勢(shì), 至12 d上調(diào), 約為對(duì)照8.6倍, 而在根中則一直呈下調(diào)趨勢(shì)。在脫水處理下, 葉片中的表達(dá)量在1 h內(nèi)上調(diào), 然后下調(diào), 到5 h時(shí)約為對(duì)照的18倍, 隨后上調(diào)并在10 h時(shí)達(dá)到峰值, 約為對(duì)照的82倍, 24 h時(shí)表達(dá)量約為對(duì)照的72倍; 而根中的表達(dá)量基本保持不變。低溫處理下, 葉片中的表達(dá)量在1 h上調(diào)至對(duì)照1.9倍左右, 隨后則是下調(diào), 到24 h時(shí)為對(duì)照0.3倍; 根中先上調(diào)在2 h時(shí)達(dá)到峰值, 約為對(duì)照的1.4倍然后回落, 至24 h時(shí)約為對(duì)照的0.28倍。鹽處理下,的表達(dá)量在葉片中急劇下調(diào), 至24 h時(shí)約為對(duì)照的0.01倍; 根中先下調(diào)至5 h時(shí)約為對(duì)照的0.72倍, 后逐漸上調(diào)至24 h時(shí), 約為對(duì)照1.5倍左右。以上結(jié)果表明，玉米葉片中基因受到非生物脅迫干旱和脫水的誘導(dǎo)表達(dá), 對(duì)冷和鹽脅迫信號(hào)也有應(yīng)答反應(yīng); 在玉米根中基因受到非生物脅迫干旱的誘導(dǎo)表達(dá), 對(duì)冷和鹽脅迫信號(hào)也有應(yīng)答反應(yīng), 但不受脫水脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)。

圖3 ZmbHLH161啟動(dòng)子序列分析

圖4 ZmbHLH161蛋白在玉米葉片原生質(zhì)體中的亞細(xì)胞定位

GFP: GFP標(biāo)記的ZmbHLH161在玉米原生質(zhì)體的亞細(xì)胞定位; DAPI: DAPI標(biāo)記的原生質(zhì)體細(xì)胞核; Bright: 同一視野光鏡下的原生質(zhì)體; Merged: 光鏡及熒光照片的疊加; CK: 轉(zhuǎn)入空載體的原生質(zhì)體; ZmbHLH161: 轉(zhuǎn)入目的基因載體的原生質(zhì)體; 標(biāo)尺為3 μm。

GFP: GFP-labeled ZmbHLH161 subcellular localization in maize protoplasts; DAPI: DAPI-labeled protoplast nuclei; Bright: protoplasts under the same field of view light microscope; Merged: superposition of light microscope and fluorescence photos; CK: transfer empty vector protoplasts; ZmbHLH161: transfer into protoplast of target vector; Bar = 3 μm.

2.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥陽(yáng)性植株鑒定

提取卡那霉素抗性陽(yáng)性植株葉片DNA進(jìn)行PCR檢測(cè),結(jié)果如圖7所示, 陰性對(duì)照和野生型都無(wú)目的條帶, 有3株轉(zhuǎn)基因擬南芥含有目的基因。

2.6 轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性分析

0 mol L–1NaCl濃度時(shí)野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥均能正常生長(zhǎng), 當(dāng)NaCl濃度為0.10 mol L–1和0.15 mol L–1時(shí), 野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥均能正常生長(zhǎng), 轉(zhuǎn)基因擬南芥主根比野生型略長(zhǎng), 但差異不顯著; 當(dāng)NaCl濃度升為0.18 mol L–1時(shí), 野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥均不能正常生長(zhǎng), 葉片發(fā)黃枯死, 主根不生長(zhǎng), 無(wú)側(cè)根(圖8)。說明在轉(zhuǎn)基因擬南芥響應(yīng)鹽脅迫過程中沒有起到明顯促進(jìn)作用。

圖5 ZmbHLH161在玉米不同組織中的相對(duì)表達(dá)量

圖6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析不同處理?xiàng)l件下ZmbHLH161基因在葉片和根中的表達(dá)情況

A: 干旱處理; B: 脫水處理; C: 低溫(4℃)處理; D: 高鹽(200 mmol L–1NaCl)處理。數(shù)據(jù)為3個(gè)生物學(xué)重復(fù)±標(biāo)準(zhǔn)差。

A: drought treatment; B: dehydration treatment; C: cold (4℃) treatment; D: high salt (200 mmol L–1NaCl) treatment. The error bar represents ± SD of three biological replications.

圖7 T1代擬南芥PCR檢測(cè)

M: DL2000 marker; P: 陽(yáng)性對(duì)照; W: 野生型擬南芥; N: 陰性對(duì)照; 1~3: T1代擬南芥。

M: DL2000 marker; P: positive control; W: wild-type; N: negative control; 1–3: T1generation.

2.7 轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐甘露醇分析

由圖9可知, 0 mol L–1甘露醇濃度時(shí), 野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥均能正常生長(zhǎng), 根系發(fā)達(dá); 當(dāng)甘露醇濃度為0.15 mol L–1時(shí), 野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥均能正常生長(zhǎng), 但轉(zhuǎn)基因擬南芥根長(zhǎng)明顯長(zhǎng)于野生型, 且差異顯著(<0.05)。當(dāng)甘露醇濃度為0.2 mol L–1時(shí), 野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥長(zhǎng)勢(shì)較弱, 葉片略微發(fā)黃, 轉(zhuǎn)基因擬南芥主根比野生型略長(zhǎng), 差異顯著(<0.05)。當(dāng)甘露醇濃度為0.3 mol L–1時(shí), 2種擬南芥葉片明顯變黃, 生長(zhǎng)明顯受到影響, 植株細(xì)小, 其中OE-1和OE-2擬南芥主根長(zhǎng)度較野生型擬南芥呈差異極顯著水平(<0.01)。說明基因在擬南芥響應(yīng)滲透脅迫過程中起到一定的促進(jìn)作用。

3 討論

轉(zhuǎn)錄因子是能與真核基因順式作用元件相互作用的DNA結(jié)合蛋白, 起激活或者抑制轉(zhuǎn)錄的作用。近年來(lái), 越來(lái)越多的研究關(guān)注各種轉(zhuǎn)錄因子在響應(yīng)植物脅迫中的作用, bHLH轉(zhuǎn)錄因子也是其中之一。在干旱研究方面, Chen等[27]通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將和在水稻中過表達(dá), 其結(jié)果表明可以顯著提高對(duì)缺水脅迫的耐受性。Rozenn等[28]報(bào)道了缺失突變體對(duì)干旱脅迫的敏感性比野生型略高, 且過表達(dá)株系顯示出側(cè)根形成缺陷和對(duì)干旱脅迫的耐受性顯著提高。Yao等[29]將苦蕎基因在擬南芥中進(jìn)行異源過表達(dá), 結(jié)果顯示其干旱和氧化耐受性增強(qiáng), 這不僅歸因于丙二醛(MDA)降低, 離子泄漏(IL)和活性氧(ROS)降低, 而且脯氨酸(Pro)含量高; 與野生型抗氧化劑活性相比較高, 轉(zhuǎn)基因品系中的酶和光合作用效率更高。在鹽脅迫研究方面, Li等[30]從東鄉(xiāng)野生稻中分離并鑒定了bHLH蛋白基因, 在擬南芥中過表達(dá)此基因后增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因擬南芥植株對(duì)冰凍和鹽脅迫的耐受性; Zhou等[31]從野生稻克隆并鑒定的基因在擬南芥中的過表達(dá)賦予了其對(duì)鹽和滲透脅迫的耐受性。Liu等[32]研究表明, 與野生型相比, 過表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)干旱、NaCl和滲透脅迫表現(xiàn)出更大的抗性。相反, bHLH122突變體比野生型植物對(duì)NaCl和滲透脅迫更敏感。在低溫脅迫研究方面, Xu等[33]研究發(fā)現(xiàn), 中國(guó)野生葡萄或耐冷種“黑龍江苗”VvbHLH1轉(zhuǎn)錄因子過表達(dá)不影響轉(zhuǎn)基因擬南芥植物生長(zhǎng)和發(fā)育, 但增強(qiáng)了對(duì)冷脅迫的耐受性。煙草bHLH轉(zhuǎn)錄因子, 響應(yīng)冷脅迫(4℃), 過表達(dá)煙草在冷脅迫下表現(xiàn)出電解質(zhì)泄漏較低, 丙二醛含量降低, H2O2和ROS積累, 這有助于減輕冷脅迫處理后對(duì)細(xì)胞膜的氧化損傷, 從而增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因煙草植株耐寒性[34]。

A~D分別為0、0.10、0.15和0.18 mol L–1鹽處理的生長(zhǎng)情況; E: 不同鹽濃度下擬南芥平均主根長(zhǎng)度; WT: 野生型擬南芥; OE: 轉(zhuǎn)擬南芥; 標(biāo)尺為1.5 cm。

A–D indicates the seedling growth under the NaCl concentrations of 0, 0.10, 0.15, and 0.18 mol L–1; E: the average main root length; WT: wild type; OE:transgenic. Bar = 1.5 cm

圖9 不同甘露醇濃度下轉(zhuǎn)基因擬南芥根長(zhǎng)比較

A~D分別為0、0.15、0.2和0.3 mol L–1甘露醇處理的生長(zhǎng)情況; E: 不同甘露醇濃度下擬南芥平均主根長(zhǎng)度; WT: 野生型擬南芥; OE: 轉(zhuǎn)擬南芥; 標(biāo)尺為1.5 cm。*和**分別表示轉(zhuǎn)基因擬南芥主根長(zhǎng)度較野生型呈差異顯著水平(<0.05)和差異極顯著水平(<0.01)。

A–D indicates the seedling growth under the mannitol concentrations of 0, 0.15, 0.2, and 0.3 mol L–1; E: the average main root length ofat different mannitol concentrations; WT: wild type; OE:of transgenic; Bar = 1.5 cm.*and**indicate that the root length of transgenicis significantly different from that of wild type (< 0.05) and the difference is extremely significant (<0.01).

本研究應(yīng)用qPCR分析不同組織中表達(dá)情況, 結(jié)果表明該基因在不同時(shí)期多種組織中均有表達(dá)。其中以生長(zhǎng)旺盛期根中表達(dá)量最高, 其次是幼根和幼胚, 因此推測(cè)可能參與根和幼胚生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控。在轉(zhuǎn)錄起始密碼子上游2 kb的DNA序列分析發(fā)現(xiàn), 有多個(gè)與逆境脅迫、光反應(yīng)等功能相關(guān)的順式作用元件, 如ABRE、MYB、MYC等是響應(yīng)鹽、干旱、ABA、低溫脅迫的響應(yīng)元件。在脫水和干旱逆境處理中的葉片表達(dá)量上調(diào)程度最明顯, 最高分別能達(dá)到對(duì)照的82.0倍和8.6倍, 推測(cè)參與植株體內(nèi)干旱等逆境脅迫應(yīng)答。利用不同濃度梯度NaCl和甘露醇處理過表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型并統(tǒng)計(jì)根長(zhǎng), 結(jié)果表明, 甘露醇處理下轉(zhuǎn)基因擬南芥主根比野生型長(zhǎng), 且差異顯著(<0.05); 而在鹽脅迫處理試驗(yàn)中, 轉(zhuǎn)基因株系根系生長(zhǎng)與野生型無(wú)顯著差異。

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Cloning and functional analysis ofgene in maize

YANG Meng-Ting1,2,**, ZHANG Chun2,**, WANG Zuo-Ping2, ZOU Hua-Wen1,*, and WU Zhong-Yi2,*

1College of Agriculture, Yangtze University, Jingzhou 434023, Hubei, China;2Beijing Agro-Biotechnology Research Center, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences / Beijing Key Laboratory of Agricultural Gene Resources and Biotechnology, Beijing 100097, China

bHLH transcription factors are the second largest family of transcription factors in plants and play an important role in regulating plant growth and development, signal transduction, and stress response. In order to study the function of maize bHLH family genes in response to stress,(AC: NC_AQK75074) gene from maize root tissue was cloned in this study. Bioinformatic analysis showed that this gene contains 3 exons, the full-length of its cDNA is 1460 bp, coding sequence is 1059 bp in length, encoding 352 amino acids. It exists as a single copy in the maize genome and its function is unknown. The molecular weight of ZmbHLH161 protein is 37.1 kD, and its theoretical isoelectric point is 6.10, with a conserved domain unique to the bHLH transcription factor family, but does not have a transmembrane structure or signal peptide. It is a hydrophilic protein, and the secondary structure of the protein has a maximum proportion of 42.05%. Transient expression experiments in maize protoplasts showed that ZmbHLH161 was localized in the nucleus. Real-time quantitative PCR (qPCR) analysis showed that under normal growth conditions,was mainly expressed in roots and immature embryos, while under dehydration and drought treatment,was up-regulated in maize seedling leaves. After treated with different concentrations of NaCl, the root length oftransgenic heterologousstrains was not significantly different from that of wild type, and their root was longer than that of wild type after being treated with different concentrations of mannitol. It is speculated thatgene may be involved in the response of maize to osmotic stress.

maize;; transcription factor; protoplast; qPCR; osmotic stress

本研究由北京市農(nóng)林科學(xué)院青年基金項(xiàng)目(QNJJ201724), 北京市農(nóng)林科學(xué)院科技創(chuàng)新能力建設(shè)專項(xiàng)(KJCX20200204, KJCX20200205, KJCX 20200407)和國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31971839, 31471510)資助。

This study was supported by the Beijing Academy of Agricultural Youth Fund (QNJJ201724), the Beijing Academy of Agricultural and Forestry Sciences (KJCX20200204, KJCX20200205, KJCX20200407), and the National Natural Science Foundation of China (31971839, 31471510).

鄒華文, E-mail: zouhuawen73@hotmail.com; 吳忠義, E-mail: zwu22@126.com

**同等貢獻(xiàn)(Contributed equally to this work)

楊夢(mèng)婷, E-mail: yangmengting213@163.com; 張春, E-mail: spring2007318@163.com

2020-03-28;

2020-06-02;

2020-06-22.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20200622.1447.016.html

10.3724/SP.J.1006.2020.03022