邢康康，賀元川，劉 艷，陳仕江

(1.重慶市中藥研究院，重慶 400065；2.重慶市蠶業(yè)科學(xué)技術(shù)研究院，重慶 400700)

1 引言

冬蟲夏草為麥角菌科真菌冬蟲夏草菌(Cordycepssinensis(BerK.)Sacc.)寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座和幼蟲尸體的干燥復(fù)合體。補(bǔ)腎益肺，止血化痰。用于腎虛精虧，陽痿遺精，腰膝酸痛，久咳虛喘，勞嗽咯血[1]。天然冬蟲夏草的生長條件極其特殊，加之全球氣候變化、生態(tài)環(huán)境破壞，以及掠奪式的采挖，導(dǎo)致冬蟲夏草的野生資源日趨減少，藥源緊缺。自20世紀(jì)70年代開始，冬蟲夏草人工繁育研究一直是中藥資源保護(hù)、再生領(lǐng)域的熱點(diǎn)課題。

冬蟲夏草人工繁育技術(shù)主要通過收集冬蟲夏草菌分生孢子，人工接種以提高蝙蝠蛾幼蟲感菌率，再將感菌幼蟲在低海拔室內(nèi)模擬高原環(huán)境條件培育或在高海拔冬蟲夏草適生地培育，長出子座形成冬蟲夏草。因此，冬蟲夏草菌分生孢子和人工接種技術(shù)對于規(guī)?；a(chǎn)冬蟲夏草具有非常重要的意義。

2 冬蟲夏草菌分生孢子

菌種繁育一直是冬蟲夏草人工培育產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵，是實(shí)現(xiàn)冬蟲夏草產(chǎn)業(yè)化的前提。目前冬蟲夏草菌種繁育主要方式有兩種，一是冬蟲夏草有性繁育，通過采收成熟子實(shí)體，收集子囊孢子通過微循環(huán)產(chǎn)孢獲取分生孢子菌種用于蝙蝠蛾幼蟲的侵染，但此種方式成本較高、菌種純度低，菌種侵染力不穩(wěn)定，侵染率最高可達(dá)到90%以上，低的僅為30%，導(dǎo)致菌種制劑質(zhì)量難于控制；二是從野外新鮮冬蟲夏草組織分離、純化的冬蟲夏草菌株經(jīng)過無性培養(yǎng)獲得具有侵染力的分生孢子菌種，此種方式具有成本低廉，菌株純度高，分生孢子侵染力較穩(wěn)定，便于菌種制劑制備等優(yōu)勢。

我國經(jīng)多年研究已證明中國被毛孢(Hirsutellahepiali)是冬蟲夏草菌的無性型[2～6]。最適培養(yǎng)溫度為15～20 ℃，適宜pH值為5～6[7，8]。在固體培養(yǎng)條件下，中國被毛孢的次級(jí)菌絲可以形成分生孢子梗，其頂端膨脹分裂后形成分生孢子[9]。中國被毛孢在培養(yǎng)條件下可產(chǎn)生無色和近黑色兩種顏色的分生孢子[10]，形態(tài)有腎形、橢圓形、長橢圓形和近球形等多種形態(tài)腎，大小為 1.36～13.76 μm ×1.03～9.18 μm[11]。中國被毛孢菌株不同菌株的產(chǎn)孢能力存在差異，王錦鋒等比較了5株中國被毛孢菌株在不同培養(yǎng)條件下的產(chǎn)孢率，無論固體培養(yǎng)還是液體培養(yǎng)，5株菌株的產(chǎn)孢率均存在差異，篩選出產(chǎn)孢率較高的中國被毛孢菌株7B和8B[12]。此外，冬蟲夏草不同部位來源的菌株產(chǎn)孢能力也存在差異，呂延華在泥炭土培養(yǎng)基中，子座菌株產(chǎn)孢能力優(yōu)于蟲體菌株[13]。

除中國被毛孢菌株本身生長特性外，不同培養(yǎng)條件、營養(yǎng)條件、培養(yǎng)方式等都對分生孢子的產(chǎn)量具有重要影響。李玉玲篩選了冬蟲夏草真菌在營養(yǎng)、溫度及光照下產(chǎn)生分生孢子的最佳條件，發(fā)現(xiàn)在瓊脂培養(yǎng)基中加入玉米粉、麥麩或小麥時(shí)產(chǎn)生分生孢子較多，溫度在15～18 ℃，完全黑暗條件下分生孢子產(chǎn)生較多[14]。李玲玲等研究溫度條件和光照條件對冬蟲夏草菌分生孢子產(chǎn)量的影響的結(jié)論與李玉玲基本一致，還篩選了最佳培養(yǎng)條件為：溫度14 ℃、pH值5.80、完全黑暗的環(huán)境下，培養(yǎng)40 d[15]。李玲玲[16]等比較了微量元素和氨基酸對冬蟲夏草菌分生孢子產(chǎn)量的影響。微量元素中Fe2+、Zn2+、Mn2+均能促進(jìn)分生孢子的產(chǎn)生，而Cu2+有抑制作用；氨基酸中組氨酸對分生孢子產(chǎn)量的促進(jìn)作用最高，而蛋氨酸會(huì)抑制中國被毛孢孢子的產(chǎn)生。張宗耀等[17]研究了添加植物激素對冬蟲夏草菌固體發(fā)酵產(chǎn)分生孢子影響，泥炭土培養(yǎng)基中添加 0.1‰ 吲哚乙酸、0.1‰ 吲哚丁酸和0.1‰萘乙酸能促進(jìn)冬蟲夏草菌氣生菌絲的生長和分生孢子的產(chǎn)生。最佳培養(yǎng)條件為：18 ℃培養(yǎng)30 d后，在10 ℃、相對濕度45%、藍(lán)光照射培養(yǎng)。

3 冬蟲夏草的人工接種

冬蟲夏草的人工繁育主要是通過人工接種冬蟲夏草菌以提高蝙蝠蛾幼蟲感菌率，再將感菌幼蟲在低海拔室內(nèi)模擬高原環(huán)境條件培育或在高海拔冬蟲夏草適生地培育，長出子座形成冬蟲夏草。人工接種的感染率是冬蟲夏草人工繁育的關(guān)鍵參數(shù)，為此多位學(xué)者對接種方式進(jìn)行了研究以期提高接種感染率，促進(jìn)冬蟲夏草的形成。涂永勤等[18]將冬蟲夏草菌分別用表皮涂布、口器注入、體壁注射和混入飼料等方法進(jìn)行接菌感染試驗(yàn)，均能成功感染蝙蝠蛾幼蟲，以拌入飼料接種法感染率最高。雷桅等[19]利用實(shí)時(shí)定量技術(shù)檢測了寄主蝠蛾幼蟲不同組織中冬蟲夏草菌定殖量，推論冬蟲夏草菌隨口腔攝食侵染方式具有可行性。涂永勤等[20]用不同產(chǎn)地冬蟲夏草菌侵染小金蝠蛾，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地冬蟲夏草菌的侵染力有差異，小金產(chǎn)冬蟲夏草菌菌株感染率最高。

目前，已有多家冬蟲夏草研發(fā)機(jī)構(gòu)實(shí)現(xiàn)了冬蟲夏草的人工繁育。廣東省昆蟲研究所用冬蟲夏草菌在米飯培養(yǎng)基中成功培育出冬蟲夏草子實(shí)體，并感染蝙蝠蛾幼蟲成功獲得冬蟲夏草子實(shí)體[21]。重慶市中藥研究院在四川康定高原建立科研基地，并進(jìn)行了冬蟲夏草人工培育的研究，成功地在室內(nèi)收獲冬蟲夏草2萬余株，室外產(chǎn)量是室內(nèi)的2～3倍[22]。廣東東陽光藥業(yè)有限公司在低海拔地區(qū)建立冬蟲夏草培育工廠，模擬青藏高原環(huán)境成功培育出冬蟲夏草，其子實(shí)體也可以完成性成熟并產(chǎn)生子囊孢子[23]。為緩解野生冬蟲夏草資源匱乏，實(shí)現(xiàn)資源可持續(xù)利用，創(chuàng)建了無公害冬蟲夏草仿生態(tài)繁育技術(shù)體系[9]。

4 冬蟲夏草人工繁育品評價(jià)

冬蟲夏草含有多種特殊的活性成分，目前已知成分有糖類、氨基酸類、核苷酸類、酸脂類、無機(jī)元素類、維生素等[24]。隨著冬蟲夏草人工繁育的實(shí)現(xiàn)，科研人員相繼開展了冬蟲夏草人工繁育品活性成分和藥理作用的相關(guān)研究。冬蟲夏草人工繁育品藥理成分及含量均與野生冬蟲夏草基本一致，且重金屬及有害元素含量符合國際標(biāo)準(zhǔn)。冬蟲夏草人工繁育品具有抗腫瘤、提高免疫力、補(bǔ)腎、益肺等多種藥理活性。

詹澤蘋等[25]對冬蟲夏草野生品、繁育品進(jìn)行紅外測試。其指紋圖譜具有較好的一致性，相似度大于0.90。昝珂等[26]采用反相高效液相色譜法測定冬蟲夏草人工繁育品與野生冬蟲夏草中腺苷的含量無顯著性差異。李文慶等[27]采用超聲水提法提取蟲草酸，高效液相色譜法檢測含量。冬蟲夏草繁育品與野生冬蟲夏草蟲草酸含量差異不顯著，具有良好一致性。過立農(nóng)等[28]采用超高效液相色譜法，測定冬蟲夏草人工繁育品與野生品的麥角甾醇含量基本一致。錢正明等[29]采用氣相色譜法分析冬蟲夏草中脂肪酸和揮發(fā)性成分，均含有18種脂肪酸，主要脂肪酸比例相近。含有9種揮發(fā)性成分，揮發(fā)性成分組成比例相當(dāng)。昝珂等[30]采用氨基酸分析儀測定冬蟲夏草人工繁育品、野生品中17種氨基酸的含量基本一致。劉杰等[31]采用質(zhì)譜法測定冬蟲夏草人工繁育品的鉛、鎘、砷、汞、銅含量符合國際標(biāo)準(zhǔn)，汞難以達(dá)到檢測限。

冬蟲夏草繁育品對黑色素瘤細(xì)胞、白血病細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞等多種癌細(xì)胞都有抑制作用。能將腫瘤細(xì)胞阻滯在G1/S期，從而顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，并通過抑制相關(guān)蛋白的表達(dá)來降低腫瘤細(xì)胞的遷移能力[32～34]。冬蟲夏草繁育品可改善小鼠的腎陽虛癥狀[35]，對糖尿病腎病大鼠足細(xì)胞損傷起保護(hù)作用[36]，對炎癥因子表達(dá)的升高具有顯著抑制作用，對不同病因?qū)е碌姆尾垦装Y均具有一定的治療作用[37]。改善給藥組小鼠的抗氧化能力、炎癥因子水平、體外NO釋放和腦組織形態(tài)等病理改，變起到增強(qiáng)免疫和抗衰老作用[38]。

5 結(jié)語

冬蟲夏草的人工繁育，有利于彌補(bǔ)冬蟲夏草野生資源的不足，滿足人們的健康需求。對提高冬蟲夏草的質(zhì)量、規(guī)范冬蟲夏草市場、保護(hù)高原生態(tài)環(huán)境和資源也具有重要意義。目前冬蟲夏草人工繁育仍不成熟，存在產(chǎn)量低、成本高、繁育周期長、寄主蝠蛾生長易遭受病害侵襲等問題。

未來應(yīng)該在以下幾個(gè)方面進(jìn)行重點(diǎn)研究。冬蟲夏草菌的選育研究，篩選生長速度快，對蝙蝠蛾幼蟲侵染率高的優(yōu)質(zhì)菌種，以提高冬蟲夏草繁育效率，縮短繁育周期；蝙蝠蛾幼蟲的選育研究，提高抗病能力，降低死亡率，降低生產(chǎn)成本；蝙蝠蛾幼蟲人工飼料的開發(fā)，研發(fā)配套的自動(dòng)化設(shè)備，推動(dòng)冬蟲夏草人工繁育的產(chǎn)業(yè)升級(jí)。在國家政策的扶持及冬蟲夏草研究技術(shù)的發(fā)展下，未來我國冬蟲夏草產(chǎn)業(yè)必將朝著可持續(xù)、健康穩(wěn)定的方向快速發(fā)展。