邢康康，賀元川，劉 艷，陳仕江

(1.重慶市中藥研究院，重慶 400065；2.重慶市蠶業(yè)科學(xué)技術(shù)研究院，重慶 400700)

1 引言

冬蟲(chóng)夏草為麥角菌科真菌冬蟲(chóng)夏草菌(Cordycepssinensis(BerK.)Sacc.)寄生在蝙蝠蛾科昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)上的子座和幼蟲(chóng)尸體的干燥復(fù)合體。補(bǔ)腎益肺，止血化痰。用于腎虛精虧，陽(yáng)痿遺精，腰膝酸痛，久咳虛喘，勞嗽咯血[1]。天然冬蟲(chóng)夏草的生長(zhǎng)條件極其特殊，加之全球氣候變化、生態(tài)環(huán)境破壞，以及掠奪式的采挖，導(dǎo)致冬蟲(chóng)夏草的野生資源日趨減少，藥源緊缺。自20世紀(jì)70年代開(kāi)始，冬蟲(chóng)夏草人工繁育研究一直是中藥資源保護(hù)、再生領(lǐng)域的熱點(diǎn)課題。

冬蟲(chóng)夏草人工繁育技術(shù)主要通過(guò)收集冬蟲(chóng)夏草菌分生孢子，人工接種以提高蝙蝠蛾幼蟲(chóng)感菌率，再將感菌幼蟲(chóng)在低海拔室內(nèi)模擬高原環(huán)境條件培育或在高海拔冬蟲(chóng)夏草適生地培育，長(zhǎng)出子座形成冬蟲(chóng)夏草。因此，冬蟲(chóng)夏草菌分生孢子和人工接種技術(shù)對(duì)于規(guī)?；a(chǎn)冬蟲(chóng)夏草具有非常重要的意義。

2 冬蟲(chóng)夏草菌分生孢子

菌種繁育一直是冬蟲(chóng)夏草人工培育產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵，是實(shí)現(xiàn)冬蟲(chóng)夏草產(chǎn)業(yè)化的前提。目前冬蟲(chóng)夏草菌種繁育主要方式有兩種，一是冬蟲(chóng)夏草有性繁育，通過(guò)采收成熟子實(shí)體，收集子囊孢子通過(guò)微循環(huán)產(chǎn)孢獲取分生孢子菌種用于蝙蝠蛾幼蟲(chóng)的侵染，但此種方式成本較高、菌種純度低，菌種侵染力不穩(wěn)定，侵染率最高可達(dá)到90%以上，低的僅為30%，導(dǎo)致菌種制劑質(zhì)量難于控制；二是從野外新鮮冬蟲(chóng)夏草組織分離、純化的冬蟲(chóng)夏草菌株經(jīng)過(guò)無(wú)性培養(yǎng)獲得具有侵染力的分生孢子菌種，此種方式具有成本低廉，菌株純度高，分生孢子侵染力較穩(wěn)定，便于菌種制劑制備等優(yōu)勢(shì)。

我國(guó)經(jīng)多年研究已證明中國(guó)被毛孢(Hirsutellahepiali)是冬蟲(chóng)夏草菌的無(wú)性型[2～6]。最適培養(yǎng)溫度為15～20 ℃，適宜pH值為5～6[7，8]。在固體培養(yǎng)條件下，中國(guó)被毛孢的次級(jí)菌絲可以形成分生孢子梗，其頂端膨脹分裂后形成分生孢子[9]。中國(guó)被毛孢在培養(yǎng)條件下可產(chǎn)生無(wú)色和近黑色兩種顏色的分生孢子[10]，形態(tài)有腎形、橢圓形、長(zhǎng)橢圓形和近球形等多種形態(tài)腎，大小為 1.36～13.76 μm ×1.03～9.18 μm[11]。中國(guó)被毛孢菌株不同菌株的產(chǎn)孢能力存在差異，王錦鋒等比較了5株中國(guó)被毛孢菌株在不同培養(yǎng)條件下的產(chǎn)孢率，無(wú)論固體培養(yǎng)還是液體培養(yǎng)，5株菌株的產(chǎn)孢率均存在差異，篩選出產(chǎn)孢率較高的中國(guó)被毛孢菌株7B和8B[12]。此外，冬蟲(chóng)夏草不同部位來(lái)源的菌株產(chǎn)孢能力也存在差異，呂延華在泥炭土培養(yǎng)基中，子座菌株產(chǎn)孢能力優(yōu)于蟲(chóng)體菌株[13]。

除中國(guó)被毛孢菌株本身生長(zhǎng)特性外，不同培養(yǎng)條件、營(yíng)養(yǎng)條件、培養(yǎng)方式等都對(duì)分生孢子的產(chǎn)量具有重要影響。李玉玲篩選了冬蟲(chóng)夏草真菌在營(yíng)養(yǎng)、溫度及光照下產(chǎn)生分生孢子的最佳條件，發(fā)現(xiàn)在瓊脂培養(yǎng)基中加入玉米粉、麥麩或小麥時(shí)產(chǎn)生分生孢子較多，溫度在15～18 ℃，完全黑暗條件下分生孢子產(chǎn)生較多[14]。李玲玲等研究溫度條件和光照條件對(duì)冬蟲(chóng)夏草菌分生孢子產(chǎn)量的影響的結(jié)論與李玉玲基本一致，還篩選了最佳培養(yǎng)條件為：溫度14 ℃、pH值5.80、完全黑暗的環(huán)境下，培養(yǎng)40 d[15]。李玲玲[16]等比較了微量元素和氨基酸對(duì)冬蟲(chóng)夏草菌分生孢子產(chǎn)量的影響。微量元素中Fe2+、Zn2+、Mn2+均能促進(jìn)分生孢子的產(chǎn)生，而Cu2+有抑制作用；氨基酸中組氨酸對(duì)分生孢子產(chǎn)量的促進(jìn)作用最高，而蛋氨酸會(huì)抑制中國(guó)被毛孢孢子的產(chǎn)生。張宗耀等[17]研究了添加植物激素對(duì)冬蟲(chóng)夏草菌固體發(fā)酵產(chǎn)分生孢子影響，泥炭土培養(yǎng)基中添加 0.1‰ 吲哚乙酸、0.1‰ 吲哚丁酸和0.1‰萘乙酸能促進(jìn)冬蟲(chóng)夏草菌氣生菌絲的生長(zhǎng)和分生孢子的產(chǎn)生。最佳培養(yǎng)條件為：18 ℃培養(yǎng)30 d后，在10 ℃、相對(duì)濕度45%、藍(lán)光照射培養(yǎng)。

3 冬蟲(chóng)夏草的人工接種

冬蟲(chóng)夏草的人工繁育主要是通過(guò)人工接種冬蟲(chóng)夏草菌以提高蝙蝠蛾幼蟲(chóng)感菌率，再將感菌幼蟲(chóng)在低海拔室內(nèi)模擬高原環(huán)境條件培育或在高海拔冬蟲(chóng)夏草適生地培育，長(zhǎng)出子座形成冬蟲(chóng)夏草。人工接種的感染率是冬蟲(chóng)夏草人工繁育的關(guān)鍵參數(shù)，為此多位學(xué)者對(duì)接種方式進(jìn)行了研究以期提高接種感染率，促進(jìn)冬蟲(chóng)夏草的形成。涂永勤等[18]將冬蟲(chóng)夏草菌分別用表皮涂布、口器注入、體壁注射和混入飼料等方法進(jìn)行接菌感染試驗(yàn)，均能成功感染蝙蝠蛾幼蟲(chóng)，以拌入飼料接種法感染率最高。雷桅等[19]利用實(shí)時(shí)定量技術(shù)檢測(cè)了寄主蝠蛾幼蟲(chóng)不同組織中冬蟲(chóng)夏草菌定殖量，推論冬蟲(chóng)夏草菌隨口腔攝食侵染方式具有可行性。涂永勤等[20]用不同產(chǎn)地冬蟲(chóng)夏草菌侵染小金蝠蛾，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地冬蟲(chóng)夏草菌的侵染力有差異，小金產(chǎn)冬蟲(chóng)夏草菌菌株感染率最高。

目前，已有多家冬蟲(chóng)夏草研發(fā)機(jī)構(gòu)實(shí)現(xiàn)了冬蟲(chóng)夏草的人工繁育。廣東省昆蟲(chóng)研究所用冬蟲(chóng)夏草菌在米飯培養(yǎng)基中成功培育出冬蟲(chóng)夏草子實(shí)體，并感染蝙蝠蛾幼蟲(chóng)成功獲得冬蟲(chóng)夏草子實(shí)體[21]。重慶市中藥研究院在四川康定高原建立科研基地，并進(jìn)行了冬蟲(chóng)夏草人工培育的研究，成功地在室內(nèi)收獲冬蟲(chóng)夏草2萬(wàn)余株，室外產(chǎn)量是室內(nèi)的2～3倍[22]。廣東東陽(yáng)光藥業(yè)有限公司在低海拔地區(qū)建立冬蟲(chóng)夏草培育工廠，模擬青藏高原環(huán)境成功培育出冬蟲(chóng)夏草，其子實(shí)體也可以完成性成熟并產(chǎn)生子囊孢子[23]。為緩解野生冬蟲(chóng)夏草資源匱乏，實(shí)現(xiàn)資源可持續(xù)利用，創(chuàng)建了無(wú)公害冬蟲(chóng)夏草仿生態(tài)繁育技術(shù)體系[9]。

4 冬蟲(chóng)夏草人工繁育品評(píng)價(jià)

冬蟲(chóng)夏草含有多種特殊的活性成分，目前已知成分有糖類、氨基酸類、核苷酸類、酸脂類、無(wú)機(jī)元素類、維生素等[24]。隨著冬蟲(chóng)夏草人工繁育的實(shí)現(xiàn)，科研人員相繼開(kāi)展了冬蟲(chóng)夏草人工繁育品活性成分和藥理作用的相關(guān)研究。冬蟲(chóng)夏草人工繁育品藥理成分及含量均與野生冬蟲(chóng)夏草基本一致，且重金屬及有害元素含量符合國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)。冬蟲(chóng)夏草人工繁育品具有抗腫瘤、提高免疫力、補(bǔ)腎、益肺等多種藥理活性。

詹澤蘋等[25]對(duì)冬蟲(chóng)夏草野生品、繁育品進(jìn)行紅外測(cè)試。其指紋圖譜具有較好的一致性，相似度大于0.90。昝珂等[26]采用反相高效液相色譜法測(cè)定冬蟲(chóng)夏草人工繁育品與野生冬蟲(chóng)夏草中腺苷的含量無(wú)顯著性差異。李文慶等[27]采用超聲水提法提取蟲(chóng)草酸，高效液相色譜法檢測(cè)含量。冬蟲(chóng)夏草繁育品與野生冬蟲(chóng)夏草蟲(chóng)草酸含量差異不顯著，具有良好一致性。過(guò)立農(nóng)等[28]采用超高效液相色譜法，測(cè)定冬蟲(chóng)夏草人工繁育品與野生品的麥角甾醇含量基本一致。錢正明等[29]采用氣相色譜法分析冬蟲(chóng)夏草中脂肪酸和揮發(fā)性成分，均含有18種脂肪酸，主要脂肪酸比例相近。含有9種揮發(fā)性成分，揮發(fā)性成分組成比例相當(dāng)。昝珂等[30]采用氨基酸分析儀測(cè)定冬蟲(chóng)夏草人工繁育品、野生品中17種氨基酸的含量基本一致。劉杰等[31]采用質(zhì)譜法測(cè)定冬蟲(chóng)夏草人工繁育品的鉛、鎘、砷、汞、銅含量符合國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，汞難以達(dá)到檢測(cè)限。

冬蟲(chóng)夏草繁育品對(duì)黑色素瘤細(xì)胞、白血病細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞等多種癌細(xì)胞都有抑制作用。能將腫瘤細(xì)胞阻滯在G1/S期，從而顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，并通過(guò)抑制相關(guān)蛋白的表達(dá)來(lái)降低腫瘤細(xì)胞的遷移能力[32～34]。冬蟲(chóng)夏草繁育品可改善小鼠的腎陽(yáng)虛癥狀[35]，對(duì)糖尿病腎病大鼠足細(xì)胞損傷起保護(hù)作用[36]，對(duì)炎癥因子表達(dá)的升高具有顯著抑制作用，對(duì)不同病因?qū)е碌姆尾垦装Y均具有一定的治療作用[37]。改善給藥組小鼠的抗氧化能力、炎癥因子水平、體外NO釋放和腦組織形態(tài)等病理改，變起到增強(qiáng)免疫和抗衰老作用[38]。

5 結(jié)語(yǔ)

冬蟲(chóng)夏草的人工繁育，有利于彌補(bǔ)冬蟲(chóng)夏草野生資源的不足，滿足人們的健康需求。對(duì)提高冬蟲(chóng)夏草的質(zhì)量、規(guī)范冬蟲(chóng)夏草市場(chǎng)、保護(hù)高原生態(tài)環(huán)境和資源也具有重要意義。目前冬蟲(chóng)夏草人工繁育仍不成熟，存在產(chǎn)量低、成本高、繁育周期長(zhǎng)、寄主蝠蛾生長(zhǎng)易遭受病害侵襲等問(wèn)題。

未來(lái)應(yīng)該在以下幾個(gè)方面進(jìn)行重點(diǎn)研究。冬蟲(chóng)夏草菌的選育研究，篩選生長(zhǎng)速度快，對(duì)蝙蝠蛾幼蟲(chóng)侵染率高的優(yōu)質(zhì)菌種，以提高冬蟲(chóng)夏草繁育效率，縮短繁育周期；蝙蝠蛾幼蟲(chóng)的選育研究，提高抗病能力，降低死亡率，降低生產(chǎn)成本；蝙蝠蛾幼蟲(chóng)人工飼料的開(kāi)發(fā)，研發(fā)配套的自動(dòng)化設(shè)備，推動(dòng)冬蟲(chóng)夏草人工繁育的產(chǎn)業(yè)升級(jí)。在國(guó)家政策的扶持及冬蟲(chóng)夏草研究技術(shù)的發(fā)展下，未來(lái)我國(guó)冬蟲(chóng)夏草產(chǎn)業(yè)必將朝著可持續(xù)、健康穩(wěn)定的方向快速發(fā)展。