謝翎

摘 要：該實驗從菌株培養(yǎng)條件入手，模擬夏季田間高溫環(huán)境，采用熱脅迫的方法，研究白僵菌Bb38菌株小米培養(yǎng)基與SDAY培養(yǎng)基培養(yǎng)的耐熱性狀差異，以期篩選出耐熱性更強的菌株。結(jié)果表明：小米培養(yǎng)基培養(yǎng)的Bb38菌株的耐熱性能更好。

關(guān)鍵詞：球孢白僵菌；分生孢子；熱脅迫；耐熱性

中圖分類號 S476 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2017）23-0015-2

Abstract： In this study， the thermostability difference of Bb38 Beauveria bassiana strains which are respectively cultured on millet culture medium and SDAY medium are detected.The results show that the thermostability of Bb38 strains which are cultured on millet culture is better than the other one.

Key words： Beauveria bassiana；Conidium；Thermostability；Thermal stress

1 前言

白僵菌是一類寄主范圍廣且致病性強的昆蟲病原真菌，在真菌分類學(xué)上屬于絲孢綱（Hyphomycetes）叢梗孢目（Moniliales）從梗孢科（Moniliaceae）白僵菌屬（Beauveria）。其菌體由菌絲和分生孢子組成，根據(jù)孢子形態(tài)可以將白僵菌分為球孢白僵菌和布氏白僵菌[B.brongniartii（Sacc.）Petch]。自1897年美國利用球孢白僵菌（Beauveria bassiana）防治麥長蝽（Blissus lercoplerus）至今，其作為害蟲生物防治的重要因子受到了廣泛關(guān)注。由于白僵菌具有對環(huán)境和溫血動物無害、易培養(yǎng)、殺蟲譜廣、致病力強等特點，目前已廣泛應(yīng)用于農(nóng)林害蟲的防治。

然而，相關(guān)研究結(jié)果也表明球孢白僵菌分生孢子對不利環(huán)境的抗逆力在很大程度上決定著菌劑的生態(tài)適應(yīng)性和田間應(yīng)用效果。其分生孢子萌發(fā)和侵染害蟲的主要制約因子是濕度，而溫度與濕度具有互補與綜合作用。當(dāng)夏季田間溫度高于35℃時，球孢白僵菌的孢子萌發(fā)和生長一般會受到抑制。因此，目前球孢白僵菌的大面積田間應(yīng)用還面臨著一定的難題。本研究從菌株培養(yǎng)條件入手，研究白僵菌Bb38菌株小米培養(yǎng)基與SDAY培養(yǎng)基培養(yǎng)的耐熱性狀差異，以期培養(yǎng)獲得耐熱性更強的白僵菌孢子。

2 材料與方法

2.1 菌種 原始菌株為實驗室保存分離的球孢白僵菌菌株Bb38。

2.2 培養(yǎng)基配方 SDAY培養(yǎng)基（W/V）葡萄糖4%，蛋白胨1%，酵母粉1%，瓊脂粉2%。小米粉培養(yǎng)基（W/V）：小米粉7.5%，瓊脂粉1.5%。萌發(fā)液（W/V）：蔗糖2%，蛋白胨0.5%。

2.3 培養(yǎng) 球孢白僵菌菌株Bb38孢子配成濃度為1×106孢子/mL濃度的孢懸液，取100μL接種涂布于SDAY或小米粉培養(yǎng)基中，置于25℃恒溫培養(yǎng)14d至其完全產(chǎn)孢。

2.4 熱處理 分別鉤取2種培養(yǎng)基上的適量孢子于冷卻后的2支離心管中，標(biāo)記為S（表示SDAY培養(yǎng)基培養(yǎng)的孢子）、M（表示小米培養(yǎng)基培養(yǎng)的孢子）。在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中25℃高速120r振蕩。用血球計數(shù)板鏡檢，計算孢子數(shù)，將離心管中液體制成108孢子/mL的孢懸液。若達(dá)不到此濃度則繼續(xù)鉤取孢子、振蕩均勻。在41℃、43℃與45℃水浴下，采取不同處理時間分別熱激不同培養(yǎng)基中收獲的孢子，并檢測其活孢率（詳見表1、表2）。以上所有處理，均重復(fù)3次。

2.5 檢測孢子萌發(fā)率 水浴處理完成后將樣品置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)一晝夜，然后用血球計數(shù)板計數(shù)，計算離心管中孢子的萌發(fā)率。每個樣品重復(fù)觀察3次，記錄每次的孢子萌發(fā)數(shù)a、總孢子數(shù)b，則萌發(fā)率c（%）=a/b×100，3次平均萌發(fā)率為d=（c1+c2+c3）/3。

3 結(jié)果與分析

3.1 Bb38孢子在小米和SDAY培養(yǎng)基上30min熱處理后萌發(fā)率 從圖1中可以看出：無論實在小米培養(yǎng)基還是在SDAY培養(yǎng)基上，Bb38菌株的分生孢子隨溫度升高，萌發(fā)率明顯下降。在25～43℃，萌發(fā)率下降相對緩慢，在43～45℃，萌發(fā)率快速下降。在同一溫度下，除在41℃附近時小米培養(yǎng)基培養(yǎng)的分生孢子萌發(fā)率比SDAY低之外，其它溫度下，前者都比后者的萌發(fā)率要高。

3.2 Bb38孢子在小米和SDAY培養(yǎng)基上60min熱處理后萌發(fā)率 從圖2中可以看出：在小米和SDAY培養(yǎng)基上，Bb38菌株分生孢子的萌發(fā)率都隨著溫度的升高而下降。同一培養(yǎng)基培養(yǎng)的分生孢子，相比于水浴30min的相同溫度下，處理時間增加一倍后，萌發(fā)率極大降低。SDAY培養(yǎng)基上培養(yǎng)的孢子萌發(fā)率隨溫度疾速下降，在達(dá)到43℃時，萌發(fā)率已經(jīng)為0。而小米培養(yǎng)基上培養(yǎng)的孢子萌發(fā)隨溫度下降，在25～41℃疾速下降，在41～45℃，下降相對變緩。整個溫度下（25～45℃），小米培養(yǎng)基培養(yǎng)的分生孢子萌發(fā)率均高于SDAY。

4 討論

本研究基于球孢白僵菌分生孢子的熱脅迫反應(yīng)（水浴處理），探究培養(yǎng)條件（2種不同培養(yǎng)基）對同一菌株耐熱性的影響，發(fā)現(xiàn)小米培養(yǎng)基培養(yǎng)的Bb38菌株的耐熱性能比SDAY培養(yǎng)基培養(yǎng)的Bb38菌株要好。球孢白僵菌分生孢子對不利環(huán)境的抗逆力在很大程度上決定著菌劑的生態(tài)適應(yīng)性和田間應(yīng)用效果，尤其是溫度。不同培養(yǎng)基質(zhì)造成了白僵菌孢子熱穩(wěn)定性的不同，可能是由于孢子在形成過程中營養(yǎng)攝取的不同，造成了其孢子內(nèi)部結(jié)構(gòu)或代謝形成了差異。也有可能孢子在成熟期基質(zhì)中的不同離子強度、pH值或其他條件，造成了其最終熱穩(wěn)定性的不同。本研究對今后篩選耐熱性菌株孢子生產(chǎn)和抗逆相關(guān)機制研究無疑是新的探索，其相關(guān)深層機理還有待于進(jìn)一步研究。

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（責(zé)編：張宏民）endprint