張曼 徐錦華 劉 廣 姚協(xié)豐 李蘋芳 羊杏平

目的與意義： 西瓜枯萎病是由尖鐮孢菌西瓜專化型侵染引起的維管束系統(tǒng)病害，是國內(nèi)外西瓜生產(chǎn)上最嚴(yán)重的病害之一，已成為制約西瓜生產(chǎn)的主要障礙。而有關(guān)枯萎病菌侵染途徑及植株抗病反應(yīng)機制尚不明確。本項研究以期明確西瓜枯萎病菌在西瓜幼苗中的侵染過程，及其侵染后西瓜植株的組織結(jié)構(gòu)變化與相關(guān)防衛(wèi)基因的表達(dá)，進而探討組織結(jié)構(gòu)變化和防衛(wèi)基因的表達(dá)與抗病性的關(guān)系。

材料與方法： （1）采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法將pGFP載體導(dǎo)入枯萎病菌基因組。（2）采用Leica CP SP2（Germany）激光共聚焦顯微鏡實時觀察菌絲侵染過程。記錄的圖形數(shù)據(jù)導(dǎo)入Adobe Photoshop7.0進行處理。（3）采用XL30 ESEM掃描電鏡觀察植株的組織結(jié)構(gòu)。（4）采用ABI PRISM7300實時定量PCR儀進行Real-time PCR分析。采用2?ΔΔCT 法分析數(shù)據(jù)，確定基因的相對表達(dá)量。采用SAS 9.2（SAS Institute， Cary， NC）軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。

結(jié)果與分析： （1）枯萎病菌接種后7 d，植株開始顯癥。葉片萎蔫，子葉枯萎下垂。接種后15 d，植株發(fā)病率達(dá)81.2%，大部分受侵染的植株基部變褐縊縮，有時有膠狀物流出，發(fā)病植株猝倒，干枯死亡。接種后21 d，96%的植株完全枯萎死亡。（2）菌絲侵染途徑觀察結(jié)果表明，接種后4 h，孢子松散的附著在根表皮，12 h，個別孢子萌發(fā)產(chǎn)生菌絲，接種后2 d，可見菌絲大量緊密附著于根毛。接種后3 d，小分生孢子和成熟菌絲向皮層滲透。接種后6 d，分生孢子已經(jīng)到達(dá)木質(zhì)部導(dǎo)管。而受侵染植株從表型上看長勢健壯、無病害癥狀。接種后7 d，菌絲進入到木質(zhì)部導(dǎo)管。植株開始出現(xiàn)萎蔫癥狀。接種后10 d，植株出現(xiàn)明顯病害癥狀，如基部變褐縊縮、發(fā)病植株猝倒等。此時，可見根和下胚軸木質(zhì)部導(dǎo)管中遍布菌絲。接種后15 d，大部分侵染植株（81.2%）死亡。（3）組織結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果表明，接種后2 d，進入腔內(nèi)的菌絲周圍出現(xiàn)膠狀物質(zhì)，這種物質(zhì)在病原菌剛進入導(dǎo)管后不久便出現(xiàn)，是寄主對病原菌入侵的快速反應(yīng)。隨著菌絲的進一步侵染，接種后5 d，受侵染組織周圍、甚至整個維管腔周圍的薄壁細(xì)胞細(xì)胞壁出現(xiàn)加厚現(xiàn)象，對菌絲的橫向擴散起到了阻礙作用。接種后7 d，在木質(zhì)部導(dǎo)管內(nèi)部出現(xiàn)了侵填體。侵填體形成初期，在管壁上首先看到多個小的突起，這些小突起逐漸長大，至接種后11 d，可見導(dǎo)管被一個或多個侵填體所堵塞。同時，接種后7 d，薄壁細(xì)胞細(xì)胞壁慢慢溶解，并導(dǎo)致空洞形成。當(dāng)維管組織被膠狀物大面積覆蓋，且被侵填體嚴(yán)重堵塞時，被侵染的維管組織會啟動脫落程序。接種后11 d，被破壞的組織首先從管壁上分離，隨后脫落，接種后15 d，根部維管系統(tǒng)中空。（4）防御基因表達(dá)分析結(jié)果表明，枯萎病菌侵染顯著誘導(dǎo)了ClPDF2.1基因的表達(dá)。侵染后2 d和7 d的表達(dá)量分別較對照升高了1.5倍和1.7倍。與ClPDF2.1基因不同的是，侵染后2 d，ClPDF2.4基因的表達(dá)較對照升高2.1倍，隨后表達(dá)量急劇下降，侵染后7 d，表達(dá)量僅比對照提高1.1倍。PAL基因的表達(dá)隨枯萎病菌侵染而逐漸增高。侵染后2 d，PAL基因的表達(dá)量為對照的1.4倍，至實驗結(jié)束，其表達(dá)量為對照的1.5倍。CHI基因的誘導(dǎo)表達(dá)模式與PAL基因相同，但基因表達(dá)量要高于PAL基因。APX基因的表達(dá)模式與ClPDF2.4基因相同，侵染后2 d表達(dá)量升高，隨后下降?？菸【秩緵]有誘導(dǎo)PPO基因的表達(dá)，在整個實驗期沒有檢測到表達(dá)量的差異。

結(jié)? ? 論： 本研究明確了枯萎病菌的侵染過程，即接菌后3 d，菌絲在根表皮附著生長，之后菌株開始穿過表皮細(xì)胞向皮層侵染，接菌后7 d菌絲侵入維管束，此后沿維管束向上侵染?？菸【那秩具^程中，西瓜根部木質(zhì)部導(dǎo)管通過快速形成膜狀物、侵填體及細(xì)胞壁增厚阻塞菌絲入侵。同時，ClPDF2.1、PAL、CHI等防御基因隨枯萎病菌侵染表達(dá)量升高。表明，植株一方面通過快速的組織結(jié)構(gòu)響應(yīng)，另一方面從轉(zhuǎn)錄水平提高了相關(guān)防衛(wèi)基因的表達(dá)，提高植株的抗病性。