郭義 林俊

(萍鄉(xiāng)市中醫(yī)院骨科，江西 萍鄉(xiāng) 337000)

椎間盤退變增加了腰痛的風險，并在社會中造成嚴重的經(jīng)濟和健康負擔〔1〕。成人椎間盤主要由三部分組成，包括內(nèi)髓核，外環(huán)狀纖維和終板〔2〕。椎間盤是無血管的，這使得損傷后完全修復。椎間盤退變有很多原因，其中炎癥起著重要作用〔3〕。白細胞介素(IL)-1β具有有效的促炎作用，可刺激促炎因子的釋放〔4〕。已經(jīng)證明它在椎間盤退變期間導致炎癥，基質(zhì)降解，氧化應激反應和細胞凋亡〔5〕。因此，由于在椎間盤退變早期階段的炎癥作用，抗炎治療是優(yōu)先考慮的因素。據(jù)報道，血府逐瘀湯是治療椎間盤退變疾病的一種古老的中藥配方，由11種粗草藥組成：桃李、當歸、川芎、紅花、芍藥、地黃、枳殼、柴胡、桔梗、牛膝和甘草〔6〕。血府逐瘀湯衍生的化合物，包括羥基紅花黃色素A和苦杏仁苷，已被證明具有控制炎癥反應的能力〔7〕。血府逐瘀湯具有血管生成作用，不僅可以增加雞胚絨毛尿囊膜模型中的血管數(shù)量，還可以動員骨髓內(nèi)皮祖細胞(EPC)，促進EPC分化和血管形成〔8，9〕。在炎癥相關(guān)的結(jié)腸癌發(fā)生受到血府逐瘀湯的抑制，表明它可以作為治療結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)腸癌的強有力的預防劑〔10〕。另外，已經(jīng)在兔關(guān)節(jié)軟骨細胞中證明了血府逐瘀湯抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-1、MMP-3、MMP-13的表達〔11～13〕。血府逐瘀湯對IL-1β誘導的髓核的影響尚未進行過研究，因此，本研究旨在探討血府逐瘀湯影響退變椎間盤髓核組織內(nèi)蛋白水解酶和微血管生成的機制。

1 材料和方法

1.1實驗動物 體重200～250 g的雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠由實驗動物研究中心提供。將它們在標準條件下維持至少1 w，然后禁食12 h，在每次實驗前自由獲取食物和水。

1.2椎間盤退變模型 根據(jù)體重，用1%戊巴比妥鈉(Sigma Aldrich，St.Louis，MO)以0.4 ml/kg麻醉SD大鼠。對于椎間盤退變模型，Co7/Co8或Co8/Co9尾椎椎間盤之間的椎間盤間隙首先通過放射線照相定位。將由手工制作的塞子控制的20號無菌針插入距離背側(cè)至腹側(cè)約5 mm處，旋轉(zhuǎn)360°并保持在固定位置30 s，然后移除。

1.3醫(yī)學倫理學問題 所有外科手術(shù)干預、治療和術(shù)后動物護理程序均嚴格按照機構(gòu)動物護理和使用委員會的規(guī)定進行，并符合實驗動物護理和使用指南。

1.4實驗分組 將72只雄性大鼠分為對照組(無針刺或治療)；椎間盤退變組(僅針刺)；血府逐瘀湯組(每周注射含50 μmol/L血府逐瘀湯的PBS進行針刺)各24只。由于椎間盤的無血管性質(zhì)，使用31-G針的微量注射器進行注射。這里使用的體內(nèi)劑量是基于體外實驗，其中我們確定了血府逐瘀湯的無毒性和有效性。

1.5實驗方法

1.5.1大鼠髓核細胞的分離、培養(yǎng)和治療 將髓核細胞維持在DMEM/F12(Gibco公司，紐約)和補充有抗生素的10%磷酸鹽緩沖液(PBS)中。使用0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)將細胞以80%～90%的傳導率傳代。在以下所有實驗中，我們對細胞使用了2～3次傳代。將細胞在37℃培養(yǎng)箱中于5%CO2下培養(yǎng)。培養(yǎng)基每2 d更換一次。對于細胞活力檢測，使用不同濃度的血府逐瘀湯處理髓核細胞 24 h。為了檢測炎癥的指標，用血府逐瘀湯預處理細胞2 h，然后用或不用IL-1β處理24 h。

1.5.2血府逐瘀湯制劑 血府逐瘀湯由以下成分組成：當歸9 g、地黃9 g、桃李12 g、紅花9 g、枳殼6 g、芍藥6 g、柴胡3 g、甘草6 g、桔梗4.5 g、川芎4.5 g和牛膝9 g。原料購自醫(yī)院藥房。每種藥草均由大學中草藥系的草藥植物學家認證。根據(jù)標準方法，使用具有上述比例的11種血府逐瘀湯草藥生成血府逐瘀湯的凍干粉末。最后，確定1 g凍干粉末含有5.2 g粗草藥。根據(jù)1 g/ml(W/V)的標準，將其在用蒸餾水分解之前儲存在4℃下使用。

1.5.3總RNA分離和實時PCR 使用RNAiso試劑提取總RNA。使用2 μg RNA和PrimeScriptTMRT Master Mix進行逆轉(zhuǎn)錄。使用SYBR?檢測cDNA，在StepOnePlus實時PCR系統(tǒng)(應用生物系統(tǒng)公司，美國)上的Premix Ex Taq TM Ⅱ試劑盒。使用2-ΔΔCt方法分析數(shù)據(jù)。使用的引物序列為MMP-1，上游GCGTATATGGGCTAGAAGCAT、下游GCGTATATACGTTTTAGAGCC；MMP-3，上游TAGCTATGCGTAAATTTCGCT、下游AAATTGCGCGTAGCGCGGCA；MMP-9，上游CATTTAGCTAGAGCTTTGCCG、下游GCTAGATCGCTAGCTAGCTAG；β-actin，上游GTATAAATTCTATGCGCGATA、AAAACGCGCTAGC TCGCCGT。

1.5.4酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA) 在9體積(1∶9，W/V)冰冷的生理鹽水中裂解髓核細胞。將勻漿物離心15 min(3 000 r/min，4℃)。根據(jù)制造商的說明書(武漢華美生物工程有限公司，中國)，將上清液用于測量MMP-1、MMP-3和MMP-9的含量。使用Bradford方法測量組織蛋白質(zhì)濃度。

1.5.5蛋白質(zhì)免疫印跡 通過蛋白質(zhì)免疫印跡檢測微血管生成相關(guān)因子〔血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)和轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)〕蛋白表達。在蛋白質(zhì)裂解緩沖液(碧云天生物技術(shù)研究所，上海)中裂解髓核細胞。通過二喹啉甲酸(BCA)蛋白質(zhì)測定試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所，上海)測試蛋白質(zhì)濃度，并將蛋白質(zhì)樣品與5倍加載緩沖液混合。通過10%或12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠分離等量的蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜(密理博公司，上海)。在5%脫脂牛奶中封閉2 h后，用TBST中的一抗在4℃下探測印跡過夜。將印跡與辣根過氧化物酶綴合的第二抗體(抗兔或抗小鼠；碧云天生物技術(shù)研究所，上海)一起溫育。然后使用增強的化學發(fā)光(密理博公司，上海)顯色印跡，并使用Bio-Rad XRS化學發(fā)光檢測系統(tǒng)(伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品有限公司，上海)成像。使用Image J軟件定量條帶密度。相對于GAPDH的水平呈現(xiàn)蛋白質(zhì)表達量。

1.5.6細胞活力測定 根據(jù)方案使用細胞計數(shù)試劑盒-8(CCK-8；東仁化學科技有限公司，上海)評估細胞活力。將大鼠髓核細胞以2 000個細胞/孔的密度接種在96孔板中。在血府逐瘀湯處理24 h后，除去每個孔中的培養(yǎng)基并用含有10% CCK-8溶液的200 μl新鮮培養(yǎng)基替換，并將細胞在37℃再培養(yǎng)2 h。收集100 μl樣品，并使用酶標儀(伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品有限公司，上海)在450 nm處在96孔板中測量活力。

1.5.7磁共振成像(MRI) 在大鼠尾椎針刺模型中在椎間盤之間每周注射一次血府逐瘀湯。在注射后通過MRI評估骶椎椎間盤。簡而言之，將大鼠麻醉并置于3.0T MRI掃描儀(Signa Excite，Little Chalfont公司，美國)中的俯臥位。T2加權(quán)切片在矢狀平面中成像。數(shù)據(jù)由3名獨立的盲法觀察員處理。

1.6統(tǒng)計分析 采用SPSS11.0軟件進行方差分析及LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1蛋白水解酶相關(guān)基因mRNA的表達水平 與對照組比較，椎間盤退變組MMP-1、MMP-3和MMP-9 mRNA的表達水平明顯增加，而血府逐瘀湯組較椎間盤退變組MMP-1、MMP-3和MMP-9 mRNA的表達水平明顯降低(均P<0.05)。見表1。

表1 各組蛋白水解酶相關(guān)基因mRNA表達

2.2蛋白水解酶相關(guān)基因蛋白含量檢測 與對照組相比，椎間盤退變組MMP-1、MMP-3和MMP-9含量明顯增加，而血府逐瘀湯組較椎間盤退變組MMP-1、MMP-3和MMP-9含量明顯降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組蛋白水解酶相關(guān)基因蛋白含量

2.3Western印跡檢測微血管生成相關(guān)因子蛋白表達 與對照組相比，椎間盤退變組VEGF、FGF和TGF蛋白表達水平明顯降低，而血府逐瘀湯組較椎間盤退變組VEGF、FGF和TGF蛋白表達水平明顯增加(P<0.05)。見表3、圖1。

2.4CCK-8檢測細胞活力 與對照組〔(98.23±8.72)%〕相比，椎間盤退變組細胞存活率〔(55.44±5.26)%〕明顯降低，而血府逐瘀湯組〔(82.74±7.95)%〕較椎間盤退變組細胞存活率明顯增加，3組比較差異有統(tǒng)計學意義(F=12.148，P=0.003)。

表3 各組微血管生成相關(guān)因子蛋白表達水平比較

圖1 Western印跡檢測微血管生成相關(guān)因子蛋白

2.5炎癥相關(guān)因子mRNA表達水平 與對照組相比，椎間盤退變組TNF-α、IL-6和IL-10 mRNA表達水平明顯增加，而血府逐瘀湯組較椎間盤退變組TNF-α、IL-6和IL-10 mRNA表達水平明顯降低(P<0.05)。見表4。

表4 各組TNF-α、IL-6和IL-10 mRNA表達

2.6血府逐瘀湯減緩了大鼠尾椎椎體針刺模型中椎間盤退變的進展 MRI結(jié)果表明，與對照組相比，椎間盤退變組MRI信號強度降低。然而，與椎間盤退變組相比，血府逐瘀湯組顯示出更高的MRI信號強度。見圖2。

圖2 各組MRI評估骶椎椎間盤

3 討 論

椎間盤退變是一種流行的疾病，在衰老過程中自然發(fā)生。其特征在于局部髓核區(qū)域中細胞外基質(zhì)的逐漸喪失，是成人背部疼痛的最常見原因，具有巨大的社會經(jīng)濟意義〔14，15〕。金屬蛋白酶和促炎細胞因子在該過程中起重要作用〔16〕。因此，抗炎策略是椎間盤退變治療的重要組成部分。血府逐瘀湯因其有效的抗炎作用而廣為人知〔17〕。IL-1β被認為是一種重要的細胞因子，它通過刺激一系列不同介質(zhì)(如趨化因子，細胞因子和MMPs)的產(chǎn)生而發(fā)揮有效的促炎作用〔18，19〕。已經(jīng)充分描述了IL-1β在由退行性椎間盤影響的細胞中升高，這種作用與椎間盤體內(nèi)平衡的功能失調(diào)密切相關(guān)并導致髓核組織的降解〔20〕。因此，本實驗中使用IL-1β作為促炎劑。

本研究結(jié)果表明，血府逐瘀湯抑制IL-1β誘導的炎癥介質(zhì)(TNF-α、IL-6和IL-10)和基質(zhì)降解蛋白酶(MMP-1，MMP-3和MMP-9)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)血府逐瘀湯通過調(diào)節(jié)VEGF、FGF和TGF蛋白表達，增加微血管生成。體內(nèi)MRI和組織學結(jié)果還顯示，血府逐瘀湯保護髓核免受椎間盤退變的進展。因此，血府逐瘀湯可能是治療椎間盤退變的潛在藥物。

除了體外研究，本研究使用大鼠尾椎針刺模型來評估血府逐瘀湯是否可以在體內(nèi)保護髓核。證據(jù)表明，在椎間盤退變的發(fā)展中，炎癥加劇了軟骨的退化。本研究結(jié)果表明血府逐瘀湯治療可以減緩椎間盤退變的進展。