高亮 歐勤芳 鄭建 陳華昕 于志明 陳茜 秦小雯

(無錫市第五人民醫(yī)院結(jié)核科，江蘇 無錫 214000)

活動性肺結(jié)核是指痰涂片呈陽性，有結(jié)核分枝桿菌排出，病灶仍處于活動期或呈散播病灶，說明結(jié)核桿菌繁殖活躍，毒力較強，病情較為嚴(yán)重，因此在發(fā)病早期應(yīng)及時診斷以進(jìn)行對癥治療控制病情，避免病灶進(jìn)一步擴散〔1～3〕。肺結(jié)核發(fā)病早期無典型臨床癥狀及體征，不易被檢出，而臨床主要根據(jù)痰菌涂片、肺部影像學(xué)檢查及細(xì)菌培養(yǎng)等方法進(jìn)行早期診斷，但肺部影像學(xué)僅作為一種輔助診療手段，其靈敏度較低，而痰菌涂片及細(xì)菌培養(yǎng)檢查靈敏度較高，但檢查時間較長，常導(dǎo)致早期治療滯后，增加疾病傳染風(fēng)險〔4〕。因此，如何準(zhǔn)確快速地完成對肺結(jié)核的檢出，以及時進(jìn)行防控成為臨床廣泛關(guān)注的熱點問題。隨著支氣管鏡在肺部疾病檢查中的廣泛應(yīng)用，肺泡灌洗Xpert檢測逐漸被推薦應(yīng)用于臨床肺結(jié)核疾病診斷中〔5〕。Xpert是GeneXpert MTB/RIF的簡稱，其主要以半巢式實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)為基礎(chǔ)原理，針對MTBrpoB基因引物及探針設(shè)計，以檢測其是否發(fā)生突變，且Xpert檢測是一個全封閉的檢測系統(tǒng)，操作自動化，樣本被污染風(fēng)險小，檢測快速，且不受人為因素影響，檢測準(zhǔn)確度較高〔6,7〕。本研究分析肺泡灌洗液Xpert在老年新發(fā)活動性肺結(jié)核診斷中的應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1研究對象 本研究獲得醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)。選取無錫市第五人民醫(yī)院2018年7月至2019年11月接診的102例疑似新發(fā)活動性肺結(jié)核患者，其中男59例，女43例；年齡60～88歲，平均年齡(68.27±4.27)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①胸部影像學(xué)改變考慮可能為活動性肺結(jié)核者；②三次痰菌涂片抗酸染色呈陰性者；③可行支氣管鏡檢查，并自愿簽署知情同意書者。均接受痰菌涂片、痰培養(yǎng)檢測及肺泡灌洗液Xpert檢測3項檢查。

1.2標(biāo)本獲取 (1)痰液標(biāo)本采集：痰液標(biāo)本由患者自行采集，囑咐患者留痰液前清水漱口，從肺部深處用力咳出痰液，使用一次性醫(yī)用無菌杯子送檢，每份標(biāo)本量在3～5 ml，以進(jìn)行痰菌涂片、痰培養(yǎng)。(2)肺泡灌洗液采集：先采用支氣管鏡進(jìn)行檢查，根據(jù)肺部影像學(xué)檢查結(jié)果，將發(fā)生病變支氣管作為肺泡灌洗部位，將10～20 ml生理鹽水經(jīng)支氣管鏡灌入病變支氣管中，重復(fù)此項操作2～3次后，采集肺泡灌洗液20 ml，分別置于3個試管中，離心處理后置于無菌瓶中保存?zhèn)錂z。

1.3檢測方法 (1)痰菌涂片：取適量痰液涂于1 cm×2 cm載玻片，烘干，對標(biāo)本進(jìn)行萋-尼抗酸染色，參照《痰涂片鏡檢標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊》〔8〕中相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)及程序采用顯微鏡進(jìn)行鏡檢。(2)痰培養(yǎng)：采用改良羅氏培養(yǎng)基進(jìn)行分枝桿菌培養(yǎng)，并參照《分枝桿菌分離培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化操作程序及質(zhì)量保證手冊》〔9〕相關(guān)實驗室操作程序?qū)嵤?，取適量標(biāo)本置入濃度為4%的氫氧化鈉溶液中，振蕩靜置20 min后，使用無菌吸取100 μl置于準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基上，將其放于溫度為37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每周觀察1次，并記錄培養(yǎng)結(jié)果，若連續(xù)8 w后仍未出現(xiàn)菌落生長，則判定為陰性。(3)肺泡灌洗液Xpert檢測：取無菌瓶中備用肺泡灌洗液5 ml與含有氫氧化鈉、異丙醇的處理液(2∶1)混合均勻，室溫下放置15 min后，打開反應(yīng)盒，使用無菌吸管吸取2 ml處理后樣品經(jīng)打樣孔加入反應(yīng)盒中，放于檢測模塊，采用美國Cepheid公司生產(chǎn)的GeneXpert MTB/RIF檢測系統(tǒng)及相應(yīng)試劑盒進(jìn)行自動化檢測，儀器可自動對樣本進(jìn)行過濾和洗滌，將超聲溶菌中釋放的DNA與PCR試劑混合，半巢式實時擴增及檢測熒光信號。2 h后系統(tǒng)給出檢測結(jié)果。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：CT值≤38即為陽性，5個探針中至少出現(xiàn)2個探針CT值在38及以下則確診檢測到結(jié)核分枝桿菌。

1.4觀察指標(biāo) 以2018年實施的中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《肺結(jié)核診斷(WS 288-2017)》〔10〕中病原學(xué)或病理學(xué)證據(jù)、涂片、痰培養(yǎng)等臨床診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，對比痰菌涂片、痰培養(yǎng)檢測及肺泡灌洗液Xpert檢測3種檢測的診斷結(jié)果，分析靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值及Kappa值。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS23.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行χ2檢驗及一致性檢驗。

2 結(jié) 果

2.1臨床診斷結(jié)果 102例疑似病例中，經(jīng)臨床診斷最終確診71例新發(fā)活動性肺結(jié)核，非新發(fā)活動性肺結(jié)核31例(其中肺炎18例，肺間質(zhì)性肺病3例，慢性阻塞性肺疾病1例，支氣管擴張5例，其他4例)。

2.2痰菌涂片、痰培養(yǎng)及肺泡灌洗液Xpert檢測結(jié)果 以臨床診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，痰菌涂片、痰培養(yǎng)、肺泡灌洗液Xpert靈敏度分別為49.30%、63.38%、83.10%，3種檢測方法的靈敏度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；3種檢測特異度、準(zhǔn)確度、陽性預(yù)測值及陰性預(yù)測值比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。經(jīng)一致性檢驗，3種檢測方法結(jié)果與金標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果Kappa值分別為0.339、0.444、0.630，其中肺泡灌洗液Xpert與金標(biāo)準(zhǔn)一致性最高。見表1～4。

表1 痰菌涂片檢測結(jié)果(n)

1)新發(fā)活動性肺結(jié)核，2)非新發(fā)活動性肺結(jié)核；表2，表3同

表2 痰培養(yǎng)檢測結(jié)果(n)

表3 肺泡灌洗液Xpert檢測結(jié)果(n)

表4 痰菌涂片、痰培養(yǎng)及肺泡灌洗液Xpert診斷效能比較〔%，(n/n)〕

3 討 論

肺結(jié)核作為一種慢性傳染性疾病，發(fā)病較為隱匿，導(dǎo)致臨床早期診斷易出現(xiàn)誤診及漏診情況，影響早期治療，增加傳染風(fēng)險，故早期診斷檢出肺結(jié)核并及時給予有效的治療尤為重要〔11〕。實驗室檢測是目前診斷肺結(jié)核的重要依據(jù)之一，同時也是檢測傳染源的主要手段及途徑，而痰菌涂片及痰培養(yǎng)技術(shù)是當(dāng)前臨床診斷肺結(jié)核疾病的主要手段，其中痰菌涂片檢測具有快速、簡單特點，但臨床診斷靈敏度較低，存在較高漏診及誤診風(fēng)險，而痰培較痰菌涂片檢測靈敏度有所提高，但檢測較為復(fù)雜，耗時較長，需要在6～8 w才出診斷結(jié)果，且培養(yǎng)過程中易受到外界及人為因素的影響，易影響檢測結(jié)果，致使臨床早期確診難度較大〔12，13〕。

隨著新型分子生物學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展與進(jìn)步，Xpert快速檢測方法已應(yīng)用于臨床肺結(jié)核診斷中，該項技術(shù)主要由美國Cepheid公司研發(fā)，在經(jīng)人工處理標(biāo)本后，使用定量核酸擴增儀提取DNA、核酸擴增及靶標(biāo)測全自動完成檢測，整個檢測僅需2 h即可完成，避免了復(fù)雜操作程序，減少交叉污染風(fēng)險，可減少外界因素對檢測的干擾，檢測準(zhǔn)確定更高〔14，15〕。本研究說明與傳統(tǒng)的痰菌涂片及痰培養(yǎng)檢測相比，肺泡灌洗液Xpert檢測技術(shù)在老年新發(fā)活動性肺結(jié)核臨床輔助診斷中具有更高的應(yīng)用價值。秦志華等〔7〕在相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，肺泡灌洗液中Xpert MTB/RIF檢測靈敏度、特異度均較高，對肺結(jié)核有較高的早期快速診斷價值，與本研究結(jié)果相似。但該研究主要以痰培養(yǎng)結(jié)果作為診斷金標(biāo)準(zhǔn)，對Xpert診斷結(jié)果進(jìn)行效能評價，會出現(xiàn)漏診經(jīng)病理活檢及支氣管鏡檢查最終確診的肺結(jié)核患者，而本研究中以臨床診斷作為金標(biāo)準(zhǔn)，對3種不同檢測方法進(jìn)行診斷效能評估，更加客觀地反映Xpert檢測在新發(fā)活動性肺結(jié)核臨床診斷中價值。此外，采用纖維支氣管鏡檢查方式獲取的肺泡灌洗液中抗酸結(jié)核桿菌率要高于痰液標(biāo)本獲取率，則利于進(jìn)一步提高新發(fā)活動性肺結(jié)核診斷靈敏度〔16〕。因此，肺泡灌洗液Xpert檢測作為一種簡便、快速、系統(tǒng)自動化、不受人為因素影響的分子診斷方法，在老年新發(fā)活動性肺結(jié)核診斷中具有較高的應(yīng)用價值。且Xpert檢測僅在檢測早期需要人為進(jìn)行標(biāo)本處理，其他檢測操作均由系統(tǒng)自動化自主完成，不僅有效節(jié)省臨床診斷時間，盡快確診進(jìn)行針對性治療，降低傳染性，還可減少醫(yī)學(xué)檢測過程中感染風(fēng)險，具有較高的生物安全性〔17〕。