竇瑤 魏琳 宋伍 孫聰 王宏英 王衛(wèi)芳 郭艷霞 閻慧 郭寰宇 梁雪嬌 毛璐 周曉晶

(長春中醫(yī)藥大學(xué) 1臨床醫(yī)學(xué)院，吉林 長春 130117；2藥學(xué)院)

蛹蟲草又名北冬蟲夏草、北蟲草、蛹草。屬子囊菌門、肉座菌目、蟲草菌科、蟲草屬(Cordyceps)〔1〕，與冬蟲夏草為同屬異種。蛹蟲草與冬蟲夏草具有幾乎相同的藥用成分〔2〕，其中活性成分如蟲草素、蟲草酸、蟲草多糖、氨基酸、維生素、微量元素和超氧化物歧化酶等的含量比冬蟲夏草還要高，且蛹蟲草生長較快易于人工培養(yǎng)，作為蟲草屬的模式種，目前已廣泛被國內(nèi)外科研人員所認(rèn)知和接受并成為科學(xué)研究的熱點，蛹蟲草已逐漸成為冬蟲夏草的理想替代品。在《全國中草藥匯編》中已有記載：“蛹蟲草(北蟲草)的子實體及蟲體也可作為冬蟲夏草入藥。”我國的《中華人民共和國藥典》把蛹蟲草的藥理功效歸納為補肺益腎、止咳化痰。用于慢性支氣管炎癥屬肺腎氣虛、腎陽不足者；癥見咳嗽氣喘、咯痰、自汗、惡風(fēng)、易感、身寒肢冷、腰酸肢軟、乏力、頭昏耳鳴等。無論是古代藥書中對蟲草“止血化痰，治諸虛百損”的記載還是現(xiàn)代《藥典》中對蛹蟲草藥效的歸納，在蛹蟲草的多種藥理作用中，抗炎癥作用已成為目前國內(nèi)外的科研熱點。

炎癥是威脅人類健康的一種常見病和多發(fā)病。從一方面來說，炎癥是有利于機體的防御反應(yīng)。但炎癥反應(yīng)對人體也存在重大威脅，過度的炎癥反應(yīng)可能致傷致殘甚至危及生命。目前，每年全球約有8 500萬慢性炎癥患者和 193 萬急性炎癥患者都承受著病痛的困擾〔3〕。最新研究表明，炎癥已經(jīng)與腫瘤的發(fā)生聯(lián)系起來〔4〕。因此，炎癥是醫(yī)學(xué)研究中最原始、最復(fù)雜又最具挑戰(zhàn)的新課題。

蛹蟲草的活性成分蟲草素即3′-脫氧腺苷，是第一個從真菌中分離出來的核苷類抗菌素。蟲草素具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、清除自由基等多種藥理作用〔5〕。以蟲草素為主要成分的新藥已臨床上試用于白血病的治療，有良好的臨床應(yīng)用前景〔6〕。蟲草酸，即D-甘露醇，是蟲草的主要有效成分之一。蛹蟲草中的蟲草酸含量要高于天然的冬蟲夏草〔7〕。蟲草酸具有利尿脫水、提高血漿滲透壓、鎮(zhèn)喘祛痰等藥理作用。在臨床上可用于血管痙攣、腦血栓、抗氧化、利尿脫水、鎮(zhèn)咳、祛痰平喘、腎衰竭的治療〔8〕。然而蛹蟲草的這兩種活性成分在炎癥作用發(fā)揮的藥效機制尚不清楚。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可通過對多種復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)及多水平相互連接的分析闡述中藥多成分、多靶點的潛在作用及作用機制，可通過系統(tǒng)觀察藥物對生物網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)與影響，揭示中藥整體調(diào)控的藥效機制〔9〕。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的原理，構(gòu)建蛹蟲草活性成分蟲草素和蟲草酸抗炎癥作用蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)。并依據(jù)該網(wǎng)絡(luò)，以脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞為模型，在確立蟲草素和蟲草酸合適的干預(yù)濃度和時間后，對在互作網(wǎng)絡(luò)中篩選到的關(guān)鍵節(jié)點蛋白質(zhì)的基因表達情況進行分析。以期從多成分、多靶點整合作用的角度，揭示蛹蟲草的抗炎癥作用機制。

1 材料與方法

1.1化學(xué)結(jié)構(gòu)研究 通過PubChem數(shù)據(jù)庫分別檢索蛹蟲草的活性成分蟲草素和蟲草酸的2D、3D結(jié)構(gòu)，隨后下載并保存2D和3D結(jié)構(gòu)的SDF格式文件。

1.2蟲草素和蟲草酸作用靶點和炎癥作用靶點研究 將獲得的蛹蟲草活性成分蟲草素和蟲草酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)(2D結(jié)構(gòu)和3D結(jié)構(gòu))的SDF格式文件導(dǎo)入pharmmapper數(shù)據(jù)庫，預(yù)測蟲草素和蟲草酸的作用靶點。隨后通過Uiprot、Pubme等數(shù)據(jù)庫對獲取的化合物作用靶點名稱進行矯正。

Genecards是一個以基因為中心的數(shù)據(jù)庫，每個人類基因都有一個網(wǎng)頁。 以炎癥“inflammation”為關(guān)鍵詞進行檢索并下載有關(guān)的全部基因。使用“Venny”將化合物作用靶點與炎癥作用靶點取交集得到化合物抗炎靶點，用于后續(xù)研究。

1.3活性化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)和靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 通過Cytoscape3.2.1軟件將蟲草素和蟲草酸靶點和抗炎癥作用靶點，構(gòu)建蟲草素和蟲草酸抗炎癥靶點網(wǎng)絡(luò)圖，初步探究蟲草素和蟲草酸對抗炎的藥理作用和機制。

1.4蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 為了研究靶點蛋白在系統(tǒng)水平上的相互作用，確定化合物作用靶點群，將化合物治病靶點基因上傳至在線STRING10.5軟件，構(gòu)建由導(dǎo)入基因表達產(chǎn)物組成的PPI網(wǎng)絡(luò)，并且利用Origin9.1軟件對PPI網(wǎng)絡(luò)中的蛋白繪制條形圖。

1.5基因本體論(GO)功能富集和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析 本研究采用David v 6.8 數(shù)據(jù)庫對1.4的靶點進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。從通路分析來闡釋藥對生物學(xué)角度的科學(xué)內(nèi)涵。

1.6互作網(wǎng)絡(luò)中篩選到的8個關(guān)鍵節(jié)點蛋白質(zhì)的基因表達情況分析 首先以1 μg/ml脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞24 h構(gòu)建炎癥反應(yīng)模型，然后設(shè)置濃度梯度確立蟲草素和蟲草酸對細(xì)胞合適的干預(yù)濃度，設(shè)定的蟲草素和蟲草酸干預(yù)濃度為12.5 μmol/L、25.0 μmol/L、50.0 μmol/L，并設(shè)置干預(yù)時間分別為24 h、48 h。同時以賴氨匹林(100 mg/kg)干預(yù)LPS誘導(dǎo)后RAW264.7細(xì)胞24 h和48 h作為陽性對照。提取上述處理細(xì)胞的總RNA，并在此基礎(chǔ)上利用qRT-PCR方法對在互作網(wǎng)絡(luò)中篩選到的8個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵節(jié)點蛋白質(zhì)的基因表達情況進行分析。

2 結(jié) 果

2.1收集蛹蟲草活性成分蟲草素和蟲草酸的相關(guān)靶點 通過將蟲草素和蟲草酸的2D和3D化學(xué)結(jié)構(gòu)導(dǎo)入pharmmapper數(shù)據(jù)庫和ChEMBL數(shù)據(jù)庫預(yù)測蟲草素和蟲草酸作用靶點。收集到蟲草素的靶點蛋白質(zhì)共有91個：PRIM1、GPI、CRKL、MAGI1、MSH2、NUB1、ERBB2、TTR、SLC30A9、RNF8、PCNA、CPA1、CSNK1G1、RBKS、HHEX、ALDH3A1、RRM1、RAN、NLGN1、SMURF2、MDH2、EXTL2、NR1I3、VEGFA、MTA3、NUDT4、SSB、CPB2、PATJ、CD3E、GSS、PUS10、PLK4、SULTA4A1、SRP19、MICA、STAT5A、P4HB、SMG7、ACTR3、DPP4、CA14、PROC、FLNB、OLA1、SEPSECS、SACS、EWSR1、PTPRD、LPA、BPHL、ZCWPW1、RAB26、PA2G4、F2、POU1F1、ARF6、SKP1、UBTF、SWAP70、NCR1、ACAD11、TOM1、EIF5A、ACTA1、SEC13、B2M、ARSA、RAP1GAP、CDKN1B、SORCS2、POU2F1、DNAJC16、APR6、ALB、RNASE1、BBX、THOC1、UBE3A、PCYT2、GSTM1、GARS、DHPS、TLR4、ERK1、PTGS2/COX2、MAPKP38、NOS、IL6、NFKB1、TNF；蟲草酸靶點蛋白質(zhì)共82個：ACTR3、PRIM1、TNFRSF1A、ZKSCAN5、QPRT、CPB2、CRDL、HTATIP2、PATJ、MAGI2、NCAM1、SEC13、RINS2、NUB1、TTR、CYP2C8、PPAT、GSTM4、RRM1、SRR、CNTN2、GDI1、SLC30A9、NCR1、MSH2、LOX、PRDM4、MUS81、SH3BGRL、FLNB、CYB5A、PAX5、IGFBP1、EIF5A、RPL9、CDKN1B、COTL1、SDK2、SAP18、DAPK2、ACTA1、CPM、ATP6V1A、TRAF4、OGG1、GALK1、GPI、NR1I3、ARHGAP21、PLK4、EXTL2、MDH2、MDH1、POU2F1、CNN2、WNK1、CNKSR1、ELOF1、EPS8L2、TXNL4B、VRK2、COL20A1、PPP1CB、HNF1B、DLD、CD3E、SKPQ、ESRRB、DAAM1、GAD2、GDA、TP63、TOM1、RBKS、TLR4、ERK1、PTGS2/COX2、MAPKP38、NOS、IL6、NFKB1、TNF。

2.2挖掘到抗炎癥作用相關(guān)靶點的蛋白質(zhì) 以“inflammation”為關(guān)鍵詞在 Genecards數(shù)據(jù)庫進行檢索并下載有關(guān)的全部基因，共獲得9 000多相關(guān)基因。使用“Venny”將化合物作用靶點與炎癥作用靶點取交集得到蟲草素和蟲草酸的抗炎靶點86個，用于后續(xù)研究。

2.3構(gòu)建蛹蟲草活性成分蟲草素和蟲草酸的抗炎癥作用靶點的PPI網(wǎng)絡(luò) 依據(jù)String數(shù)據(jù)庫中檢索到的蟲草素/蟲草酸抗炎癥作用靶點的PPI數(shù)據(jù)信息，導(dǎo)入PPI網(wǎng)絡(luò)可視化軟件Cytoscape3.6.0，對每個靶點的PPI數(shù)據(jù)進行計算，去掉數(shù)據(jù)重復(fù)信息，構(gòu)建復(fù)雜的蛹蟲草活性成分蟲草素和蟲草酸的“藥物活性成分-靶點-疾病蛋白網(wǎng)絡(luò)”即與抗炎癥作用-網(wǎng)絡(luò)。見圖1。

2.4蟲草素/蟲草酸抗炎癥作用靶點的通路富集分析 對蟲草素/蟲草酸抗炎癥作用靶點進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，這些靶點分布在35條通路當(dāng)中，根據(jù)P>0.01篩選出26條(見表1)，其中KEGG通路通過查看基因在通路中的分布情況，可以了解該基因在代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等通路中的作用。

圖1 蟲草素和蟲草酸抗炎癥作用靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)

表1 蟲草素和蟲草酸抗炎癥作用靶點的通路富集分析

2.5選取蛹蟲草活性成分蟲草素和蟲草酸的抗炎癥作用靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵節(jié)點 依據(jù)蛹蟲草活性成分蟲草素和蟲草酸的抗炎癥作用的PPI網(wǎng)絡(luò)及網(wǎng)絡(luò)中的GO和KEGG分析數(shù)據(jù)，結(jié)合抗炎癥作用關(guān)鍵的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，選擇蛹蟲草活性成分蟲草素和蟲草酸在炎癥作用中的關(guān)鍵作用蛋白質(zhì)8個：TLR4、ERK1、COX-2、P38、iNOS、IL-6、NF-κB、TNF-α。

2.6通過細(xì)胞水平的實驗探究蛹蟲草介導(dǎo)多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抗炎癥作用藥效機制 蟲草素和蟲草酸干預(yù)24 h后與陽性對照(抗炎癥藥物賴氨匹林100 mg/kg)相比，8個關(guān)鍵靶點蛋白均明顯下調(diào)。其中，COX-2、ERK1、iNOS、TNF-α 4個靶點蛋白蟲草酸干預(yù)24 h后比蟲草素干預(yù)24 h后下調(diào)更明顯；IL-6、TLR4 2個靶點蛋白蟲草酸干預(yù)24 h后與蟲草素干預(yù)24 h后無明顯區(qū)別；P38蟲草素干預(yù)24 h后比蟲草酸干預(yù)24 h后下調(diào)更為明顯；NF-κB雖然在蟲草素和蟲草酸干預(yù)24 h后也表達下調(diào)，但NF-κB表現(xiàn)為對蟲草素和蟲草酸濃度更加敏感，低濃度蟲草素/蟲草酸和中濃度的蟲草酸干預(yù)24 h后NF-κB表達下調(diào)更加明顯，中、高濃度蟲草素和高濃度蟲草酸干預(yù)24 h后反而表達上調(diào)。蟲草素和蟲草酸干預(yù)48 h后與陽性對照(抗炎癥藥物賴氨匹林100 mg/kg)相比，明顯表達下調(diào)的靶點蛋白包括：ERK1、iNOS、P38、TLR4、TNF-α、NF-κB；明顯表達上調(diào)的靶點蛋白包括：COX2、IL6。蟲草素和蟲草酸干預(yù)24 h后的靶點蛋白表達情況更有分析意義。見圖2。

3 討 論

盡管抗炎癥作用的機制還有待探討，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出蛹蟲草活性成分蟲草素和蟲草酸抗炎癥作用的86個靶點蛋白。通過活性成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)特征分析，構(gòu)建了靶點蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)，并將靶點蛋白富集在26條信號通路中，如NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，NF-κB是前炎癥因子基因表達調(diào)節(jié)的關(guān)鍵成分之一，誘導(dǎo)前炎癥細(xì)胞因子、趨化因子、黏附分子等表達〔10〕。NF-κB在多種炎癥性疾病的炎癥部位高度活化，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、炎癥性腹瀉、多發(fā)性硬化癥、哮喘等〔11〕。受體蛋白TLR是動物體與生俱來的一類免疫蛋白，在非特異性免疫過程中起到至關(guān)重要的作用〔12〕，其受體蛋白為TLRs。TLRs完成了非特異性免疫的最初識別步驟的同時也可介導(dǎo)LPS誘發(fā)的多種細(xì)胞反應(yīng)的中間受體，其活性與表達程度直接決定了巨噬細(xì)胞的激活程度〔13，14〕。TLR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集到的4個靶點蛋白在腸炎信號通路、肺結(jié)核信號通路、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎信號通路，這3條炎癥相關(guān)信號通路中同樣被富集，說明這些靶點蛋白為多種炎癥疾病的共同調(diào)控因子。TNF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中富集了3個關(guān)鍵靶點蛋白(IL6、TNF-α、NFKB)，其中TNF-α是一種參與免疫應(yīng)答的細(xì)胞因子，還是一種重要的炎癥介質(zhì)，TNF-α還對腫瘤細(xì)胞有細(xì)胞毒性、細(xì)胞溶解、抑制增殖等作用〔15〕。說明炎癥與腫瘤之間存在密切聯(lián)系。

綜上，蛹蟲草的有效成分通過上述靶點相互作用，實現(xiàn)其抗炎等作用。本研究結(jié)果為進一步闡釋蛹蟲草抗炎癥作用的藥效機制奠定了理論基礎(chǔ)，也為后續(xù)的實驗研究提供了科學(xué)依據(jù)。