羅 慧, 馮程程, 趙境怡, 岳中輝

哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 黑龍江省普通高等學(xué)校植物生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 黑龍江 哈爾濱 150025

土壤多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO)是土壤中一類重要的氧化還原酶，能參與芳香族類化合物的分解轉(zhuǎn)化過(guò)程，將土壤中芳香族化合物氧化成醌[1]，因其對(duì)土壤環(huán)境的變化較為敏感，學(xué)者們常將其作為土壤環(huán)境生態(tài)恢復(fù)的監(jiān)測(cè)指標(biāo)[2-4]. 石油污染后土壤酶活性變化的研究發(fā)現(xiàn)，土壤酶能夠迅速反映出污染程度[5-6]，且利用植物對(duì)石油污染進(jìn)行修復(fù)時(shí)，土壤酶也隨之發(fā)生相應(yīng)變化[7]. 石油污染后土壤多酚氧化酶的變化主要受石油污染物的濃度和持續(xù)時(shí)間以及修復(fù)植被或修復(fù)微生物種類的影響，如王金成等[8]研究表明，石油污泥原位修復(fù)25～80 d時(shí)，土壤多酚氧化酶活性呈下降趨勢(shì)；李政等[9-10]研究認(rèn)為，施用微生物菌劑修復(fù)石油污染會(huì)增加土壤多酚氧化酶活性；而陳凱麗等[11]研究發(fā)現(xiàn)，微生物修復(fù)后土壤多酚氧化酶活性在第2周達(dá)到最大，之后降低；朱凡等[12]研究了不同樹種修復(fù)PAHs(多環(huán)芳烴)污染土壤后多酚氧化酶活性的變化，結(jié)果表明酶活性在處理9個(gè)月時(shí)升高隨后又降低，PAHs含量為10 gkg時(shí)會(huì)促進(jìn)酶活性，而當(dāng)其含量達(dá)到50 gkg時(shí)，表現(xiàn)為隨時(shí)間延長(zhǎng)，酶活性被抑制，不同樹木種類對(duì)酶活性的影響沒(méi)有差異；而王洪等[13]研究認(rèn)為，植物(黑麥草、苜蓿)修復(fù)、微生物修復(fù)及二者聯(lián)合修復(fù)均促進(jìn)了土壤多酚氧化酶活性，其促進(jìn)程度表現(xiàn)為植物+微生物菌劑>植物>菌劑；王嬌嬌等[14]發(fā)現(xiàn)，甜菜與牧草間作修復(fù)PAHs污染土壤后，土壤多酚氧化酶活性提高；還有研究[13,15-16]表明，多酚氧化酶活性與石油降解率之間存在一定的相關(guān)關(guān)系. 以上研究從不同角度分析了石油污染對(duì)土壤多酚氧化酶活性的影響，但大多僅關(guān)注了酶活變化的結(jié)果，對(duì)土壤多酚氧化酶在石油污染土壤中的反應(yīng)過(guò)程機(jī)制還較少涉及[17]. 土壤酶促反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)特征是土壤酶學(xué)研究中的重要領(lǐng)域，對(duì)探討土壤酶促反應(yīng)機(jī)制有著重要意義[18-20]，研究土壤多酚氧化酶活性的動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)特征能夠判斷酶促反應(yīng)進(jìn)行的可能性、方向和限度，有利于進(jìn)一步研究多酚氧化酶在石油污染土壤中的酶促反應(yīng)速度、過(guò)程和能量變化.

鑒于此，該文在已有石油污染對(duì)土壤多酚氧化酶影響研究[21-22]的基礎(chǔ)上，以距油田工作區(qū)中心不同距離的區(qū)域代表不同石油污染程度，研究不同溫度下各區(qū)域內(nèi)裸地和羊草(Leymuschinensis)修復(fù)地的土壤多酚氧化酶活性變化，進(jìn)而分析土壤多酚氧化酶的動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)特征，探究其在石油污染土壤中的酶促反應(yīng)機(jī)制及行為特征，揭示其在石油污染土壤中的作用，以期為松嫩草地石油污染退化土壤的生物修復(fù)提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域概況

大慶油田位于松嫩平原西部(121°36′E～126°36′E、44°00′N～48°35′N)，該區(qū)屬溫帶大陸性季風(fēng)氣候，年均氣溫4.2 ℃，春季干燥，夏季炎熱，秋季涼爽，冬季嚴(yán)寒；年均無(wú)霜期143 d左右，年均降水量427.5 mm，蒸發(fā)量 1 635 mm；土壤類型為蘇打鹽堿土，pH在8.5以上，鹽土和堿土呈斑狀分布.

1.2 土壤樣品采集與處理

對(duì)大慶油田工作區(qū)進(jìn)行踏查，發(fā)現(xiàn)油田采油、貯存、運(yùn)輸及其他生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量落地石油，由于土壤對(duì)石油類有機(jī)污染物具有較強(qiáng)的吸附截留能力，導(dǎo)致大部分污染物被截留在土壤表層，因此土壤表面逐漸形成不同深淺程度的石油污斑. 油田作業(yè)區(qū)有關(guān)部門已選取有代表性的草地，通過(guò)選用抗旱、耐鹽堿的羊草對(duì)鹽堿草地土壤石油污染進(jìn)行了治理改良. 根據(jù)踏查情況，將石油工作區(qū)作為中心，分別在直徑為1、5、15 km的同心圓上確定采樣區(qū)域，采樣區(qū)域中包括自然草地和羊草修復(fù)草地. 于2016年10月在不同距離的裸地(自然草地中)和羊草修復(fù)草地中進(jìn)行6個(gè)樣地的土壤樣品采集工作. 6個(gè)樣地均利用S型取樣法，每個(gè)樣地隨機(jī)選取5個(gè)樣點(diǎn)，各樣點(diǎn)隨機(jī)選取3個(gè)“亞樣點(diǎn)”，再混合成一個(gè)“復(fù)合樣點(diǎn)”，共30個(gè)“復(fù)合樣點(diǎn)”，除去土壤表層植被，取0～15 cm土層土樣，帶回實(shí)驗(yàn)室剔除根系等雜物后，自然風(fēng)干后過(guò)2 mm篩，用于土壤理化性質(zhì)及土壤酶活性測(cè)定. 研究樣地基本性質(zhì)見(jiàn)表1.

1.3 土壤酶活性測(cè)定方法

土壤多酚氧化酶活采用鄰苯三酚比色法測(cè)定[23]，最適底物濃度為80 mmolL，最適溫度為30 ℃. 設(shè)置濃度梯度為20、40、80、160 mmolL，設(shè)置溫度梯度為10、20、30、40 ℃.

1.4 土壤酶動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)參數(shù)的計(jì)算方法

1.4.1土壤多酚氧化酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)計(jì)算

酶促反應(yīng)可用Michaelis-Menten方程[24]來(lái)描述：

(1)

表1 研究樣地土壤基本理化性質(zhì)

式中：υ0為酶反應(yīng)初速度，mg(g·h)；S為底物濃度，mmolL；Vmax為酶促反應(yīng)最大速度，mg(g·h)；Km為米氏常數(shù)，mmolL.

采用Eadie-Hofstee法將Michaelis-Menten方程中分子、分母同時(shí)除以S，得到式(2)，以υ0S為橫坐標(biāo)、υ0為縱坐標(biāo)，做圖得到的斜率和截距即分別對(duì)應(yīng)Km和Vmax.

(2)

1.4.2土壤多酚氧化酶熱力學(xué)參數(shù)計(jì)算

活化能Ea(kJmol)、溫度系數(shù)Q10、活化自由能ΔG(kJmol)、活化焓ΔH(kJmol)、活化熵ΔS〔J(mol·K)〕的計(jì)算方法如式(3)～(7)所示.

活化能(Ea)由Arrhenius速度方程的積分式求得，以1T為橫坐標(biāo)、lnk(k為酶促反應(yīng)速度常數(shù))為縱坐標(biāo)，做圖得到斜率為-EaR，求得Ea.

(3)

Q10=e10EaRT(T+10)

(4)

(5)

ΔH=Ea-RT

(6)

(7)

式中：k為酶促反應(yīng)速度常數(shù)；A為指前因子；T為熱力學(xué)溫度，K；R為氣體常數(shù)，8.314 J(mol·K)；N為阿伏加德羅常數(shù)，6.023×1023個(gè)mol；h為普朗克常數(shù)，6.626×10-34Js[24].

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，采用SAS 9.2軟件進(jìn)行單因素方差分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤多酚氧化酶活性的變化

距石油污染地不同距離的裸地和羊草修復(fù)地土壤多酚氧化酶活性變化情況如表2所示. 由表2可見(jiàn)，隨著溫度的升高和底物濃度的增加，各樣地土壤多酚氧化酶活性逐漸增加(P<0.05)，在30 ℃或40 ℃、底物濃度為80 mmolL或160 mmolL時(shí)達(dá)到最大值. 同一溫度下，裸地土壤多酚氧化酶活性高于羊草修復(fù)地(P<0.05)，其中以距油田工作區(qū)5 km處裸地(BMP)的酶活性最大；羊草修復(fù)地在10 ℃和20 ℃時(shí)，表現(xiàn)為距油田工作區(qū)15 km處(LRP)的酶活性最大，30 ℃和40 ℃時(shí)表現(xiàn)為距油田工作區(qū)1 km處(LVP)的酶活性最大.

2.2 土壤多酚氧化酶動(dòng)力學(xué)特征的變化

2.2.1土壤多酚氧化酶酶促反應(yīng)的Km

Km為米氏常數(shù)，是反映酶與底物結(jié)合能力的指標(biāo)，其值越小，表明酶與底物的親和力越高，酶與底物越容易結(jié)合. 由圖1(a)可知，隨溫度升高，距油田工作區(qū)5 km處(BMP)、15 km處裸地(BRP)的Km逐漸降低，而距油田工作區(qū)1 km處裸地(BVP)的Km先降低(20 ℃時(shí))后升高；距油田工作區(qū)不同距離羊草修復(fù)地的Km均隨溫度升高呈先升高后降低的趨勢(shì)，在30 ℃時(shí)達(dá)到最大值. 在10 ℃時(shí)，羊草修復(fù)地Km小于同距離裸地，而在20、30、40 ℃時(shí),同距離樣地間Km的變化沒(méi)有規(guī)律.

2.2.2土壤多酚氧化酶酶促反應(yīng)的Vmax

Vmax為酶促反應(yīng)最大速度，用來(lái)表征酶-底物復(fù)合體分解為產(chǎn)物和酶分子的能力，同時(shí)也能反映酶的總量，其值越大，表明酶促反應(yīng)速度越快. 由圖1(b)可知，隨溫度升高，土壤多酚氧化酶的Vmax逐漸增大(P<0.05)，在30 ℃或40 ℃時(shí)達(dá)到最大值；各溫度下，土壤多酚氧化酶的Vmax均表現(xiàn)為距油田工作區(qū)5 km 處裸地(BMP)最大、距油田工作區(qū)5 km處羊草修復(fù)地(LMP)最小(P<0.05).

2.2.3土壤多酚氧化酶酶促反應(yīng)的VmaxKm

VmaxKm用于表征酶的催化性能，反映酶催化反應(yīng)的速率，其值越大，表明酶促反應(yīng)速度越快. 由圖1(c)可知，隨溫度升高，土壤多酚氧化酶的VmaxKm呈逐漸增加趨勢(shì)(P<0.05)，在40 ℃時(shí)達(dá)到最大值，但距油田工作區(qū)1 km處裸地(BVP)土壤多酚氧化酶的VmaxKm先增后降，在20 ℃時(shí)達(dá)到最大值. 在10 ℃和20 ℃時(shí)，距油田工作區(qū)1 km處(LVP)、15 km處羊草修復(fù)地(LRP)和裸地(BVP、BRP)的VmaxKm高于5 km 處的樣地(LMP、BMP)(P<0.05)；在30 ℃和40 ℃時(shí)，距油田工作區(qū)5 km處裸地(BMP)的VmaxKm最大，顯著大于其他樣地(P<0.05).

表2 不同溫度、不同底物濃度下土壤多酚氧化酶活性的變化情況

注： 不同大寫字母表示同一溫度不同樣地間土壤多酚氧化酶的Km、Vmax、VmaxKm差異顯著(P<0.05)；不同小寫字母表示同一樣地不同溫度間土壤多酚氧化酶的Km、Vmax、VmaxKm差異顯著(P<0.05).

2.3 土壤多酚氧化酶熱力學(xué)特征的變化

2.3.1土壤多酚氧化酶酶促反應(yīng)的Ea和Q10

Ea是土壤酶促反應(yīng)活化能，用來(lái)表征酶促反應(yīng)進(jìn)行所需要的反應(yīng)能障，Ea越大，表明發(fā)生反應(yīng)所需的能障越大，反應(yīng)速度越慢；Q10為溫度每變化10 ℃時(shí)酶活性的變化值. 由表3可知，土壤多酚氧化酶的Q10在距油田工作區(qū)1 km處裸地(BVP)、1 km處羊草修復(fù)地(LVP)隨溫度升高而逐漸降低(P<0.05)，而在其他樣地隨溫度變化的差異不顯著. 在不同距離裸地和羊草修復(fù)地下，Q10和Ea均表現(xiàn)為距石油工作區(qū)1 km處裸地(BVP)最高，5 km處(BMP)、15 km處(BRP)較1km處(BVP)降低(P<0.05)，而距石油工作區(qū)1 km處羊草修復(fù)地最低(LVP)，5 km處(LMP)、15 km處(LRP)羊草修復(fù)地較1 km處(LVP)增加(P<0.05).

表3 不同溫度下各樣地土壤多酚氧化酶熱力學(xué)參數(shù)

2.3.2土壤多酚氧化酶酶促反應(yīng)的ΔG、ΔH、ΔS

ΔG是酶促反應(yīng)活化自由能，用來(lái)反映反應(yīng)物達(dá)到過(guò)渡態(tài)時(shí)所需要的自由能；ΔH是酶促反應(yīng)活化焓，通常用以表征使酶的活性部位與反應(yīng)物發(fā)生互補(bǔ)時(shí)需要從外界所獲取的能量；ΔS是酶促反應(yīng)活化熵，能反映體系無(wú)序性量度復(fù)合物形成過(guò)程中的結(jié)構(gòu)變化特征及程度. 土壤多酚氧化酶的ΔG、ΔH、ΔS如表3所示，由表3可知，隨溫度升高，土壤多酚氧化酶的ΔG逐漸增大(P<0.05)，而ΔH、ΔS隨溫度變化沒(méi)有顯著差異. 同一溫度下，ΔG在各樣地間的變化沒(méi)有規(guī)律性；ΔH、ΔS與Q10和Ea的變化規(guī)律相一致.

3 討論

3.1 石油污染對(duì)土壤多酚氧化酶動(dòng)力學(xué)及熱力學(xué)特征的影響

土壤多酚氧化酶活性對(duì)石油污染的響應(yīng)大多表現(xiàn)為激活效應(yīng)[25-26]，該研究發(fā)現(xiàn)，石油污染裸地土壤多酚氧化酶活性高于羊草修復(fù)地，說(shuō)明石油污染在一定程度上促進(jìn)了土壤多酚氧化酶活性，同時(shí)在裸地中距油田工作區(qū)5 km處(BMP)酶活性最大，即隨石油污染程度的降低，酶活性表現(xiàn)為先升高后降低，這與以往研究結(jié)果[26]基本一致. 究其原因：由于距油田工作區(qū)5 km處裸地(BMP)多酚氧化酶的Vmax、VmaxKm大于1 km(BVP)和15 km處裸地(BRP)，Vmax、VmaxKm增加，土壤多酚氧化酶與底物結(jié)合能力較強(qiáng)，酶含量增多，酶催化反應(yīng)中酶-底物復(fù)合體的分解比形成更容易進(jìn)行，酶促反應(yīng)的潛勢(shì)較高，酶促反應(yīng)速度加快，酶催化性能較好，酶與石油污染物充分反應(yīng)，從而加快石油的降解過(guò)程，石油降解后的物質(zhì)又被土壤微生物利用，作為微生物繁殖的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源和多酚氧化酶反應(yīng)的基質(zhì)，提高多酚氧化酶總量[9,17]，進(jìn)一步增強(qiáng)了酶活性. 但當(dāng)靠近石油工作區(qū)(石油烴含量為5.3%～7.5%)[27]時(shí)，石油污染加重，表現(xiàn)為距石油區(qū)1 km處(BVP)的多酚氧化酶活性、Vmax、VmaxKm降低，這是因?yàn)槭椭械挠卸疚镔|(zhì)抑制了微生物的合成與分泌，土壤多酚氧化酶與底物結(jié)合能力下降，酶催化反應(yīng)中酶-底物復(fù)合體的形成強(qiáng)度較大，酶促反應(yīng)的潛勢(shì)較低，酶促反應(yīng)速度減慢，從而降低了酶的活性[28]. 因此通過(guò)動(dòng)力學(xué)特征的變化(酶促反應(yīng)作用機(jī)制)研究可以解釋土壤多酚氧化酶在中度石油污染土壤(石油烴含量為5%左右)中的變化規(guī)律[27].

該研究還發(fā)現(xiàn)，熱力學(xué)參數(shù)Q10、Ea、ΔH、ΔS的最大值均出現(xiàn)在距石油工作區(qū)1 km處裸地(BVP)，5 km 處(BMP)、15 km處(BRP)降低，說(shuō)明隨石油污染程度的降低，土壤中多酚氧化酶酶促反應(yīng)發(fā)生的能障較低，所需吸收外界能量較小，反應(yīng)進(jìn)行的方向性和強(qiáng)度較大，酶底物復(fù)合物形成過(guò)程中的有序性較高，能夠促進(jìn)土壤多酚氧化酶與底物復(fù)合體的快速合成，增加土壤多酚氧化酶量，加速裸地中土壤多酚氧化酶酶促反應(yīng)速度及催化效率，從而使酶活性增大，這也從酶促反應(yīng)過(guò)程中能量變化的角度解釋了石油污染對(duì)土壤多酚氧化酶的影響. 綜合來(lái)看，石油污染后，鹽堿土壤多酚氧化酶活性的增加是通過(guò)動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)特征的變化來(lái)調(diào)控的，但其調(diào)控與石油污染濃度的關(guān)系有待做進(jìn)一步深入探討.

3.2 升溫和植物修復(fù)對(duì)土壤多酚氧化酶動(dòng)力學(xué)及熱力學(xué)特征的影響

溫度對(duì)土壤酶活性具有直接作用，是影響土壤酶活性的重要環(huán)境因子. 一般而言，在一定溫度范圍內(nèi)土壤酶活性隨著溫度的升高而增加[29]，劉霜等[30]研究發(fā)現(xiàn)，隨溫度升高，長(zhǎng)白山土壤中β-1,4-葡萄糖苷酶和β-1,4-N-乙酰葡糖氨糖苷酶的Km降低，VmaxKm增加；鼎湖山土壤中β-1,4-葡萄糖苷酶和β-1,4-N-乙酰葡糖氨糖苷酶的Vmax、VmaxKm增加. ZHANG等[31]發(fā)現(xiàn)，溫度升高會(huì)促進(jìn)東北地區(qū)4種土壤中脲酶、磷酸酶、芳基硫酸酯酶的動(dòng)力學(xué)特征，降低土壤酶熱力學(xué)特征. 該研究發(fā)現(xiàn)，隨溫度升高，石油污染土壤中多酚氧化酶的Km逐漸減小，Vmax、VmaxKm逐漸增大，ΔH、ΔS呈逐漸減小的變化趨勢(shì)，這與以往的研究結(jié)果[30-31]基本一致，說(shuō)明溫度升高(30 ℃、40 ℃)能加快石油污染土壤中多酚氧化酶分子運(yùn)動(dòng)，促使酶與底物進(jìn)一步結(jié)合，降低土壤多酚氧化酶酶促反應(yīng)在石油污染土壤中的反應(yīng)能量，增大酶活性，促進(jìn)酶反應(yīng)的催化作用，提高酶-底物過(guò)渡態(tài)的有序性，利于向生成產(chǎn)物的方向轉(zhuǎn)化，使土壤多酚氧化酶在石油污染土壤中更容易與酚類物質(zhì)結(jié)合進(jìn)行催化反應(yīng)及物質(zhì)循環(huán)過(guò)程. 另外，土壤多酚氧化酶的Q10在距油田工作區(qū)1 km 處裸地(BVP)和羊草修復(fù)地(LVP)隨溫度升高而逐漸降低，說(shuō)明土壤多酚氧化酶酶促反應(yīng)在低溫時(shí)對(duì)溫度的敏感性較大，而隨溫度升高，酶促反應(yīng)速度對(duì)溫度的敏感性下降，升溫提供的熱量在酶的熱變性過(guò)程中消耗較少，酶活性相應(yīng)增加較多，這與German等[32]研究土壤β-酶葡萄糖苷酶活性的Q10與年均溫呈負(fù)相關(guān)的結(jié)果相互印證.

同時(shí)該研究還發(fā)現(xiàn)，從低溫(10 ℃和20 ℃)到最適溫度(30 ℃)或高溫(40 ℃)的變化過(guò)程中，羊草修復(fù)地土壤多酚氧化酶活性、Vmax、VmaxKm都有升高趨勢(shì)，Ea、ΔG呈降低趨勢(shì)，這可以認(rèn)為是羊草修復(fù)后升溫加速了石油污染土壤中多酚氧化酶酶促反應(yīng)的進(jìn)行，提高了多酚氧化酶的生物反應(yīng)速率，反應(yīng)所需的活化能和自由能降低，酶促反應(yīng)過(guò)程中的能障減小，反應(yīng)自發(fā)程度提高，促進(jìn)了土壤多酚氧化酶在石油污染鹽堿草地中發(fā)揮其作用. 但羊草修復(fù)地土壤多酚氧化酶活性、Vmax、VmaxKm大都小于裸地，這可能是因?yàn)檠虿萦幸欢ǖ奈绞偷淖饔茫梢栽谝欢ǔ潭壬稀把a(bǔ)償”多酚氧化酶的作用；而羊草修復(fù)后的Ea、ΔG、ΔH、ΔS均在距石油工作區(qū)1 km處(LVP)最低，低于裸地，說(shuō)明石油污染羊草修復(fù)后反應(yīng)發(fā)生的能障較低，反應(yīng)過(guò)程中分子構(gòu)型變化所需的力減少，易于構(gòu)型的改變，所需吸收外界能量較小，酶-底物復(fù)合體過(guò)渡態(tài)有序性較高，能夠促進(jìn)土壤多酚氧化酶與底物復(fù)合體的快速合成，增加土壤多酚氧化酶量，加速裸地中土壤多酚氧化酶促反應(yīng)速度及催化效率，從而使酶活性增大，這對(duì)提高植物修復(fù)石油污染物的研究有一定積極意義[33].

4 結(jié)論

a) 不同含油量石油污染裸地和羊草修復(fù)地的土壤多酚氧化酶活性及動(dòng)力學(xué)參數(shù)Vmax和VmaxKm在10～40 ℃溫度范圍內(nèi)隨溫度升高而逐漸增大，在30 ℃或40 ℃時(shí)達(dá)到最大；在同一溫度下，石油污染裸地土壤多酚氧化酶活性高于羊草修復(fù)地，且在含油量為5%左右的中等石油污染裸地土壤中酶活性最高，Km和VmaxKm在各樣地間無(wú)規(guī)律性變化，Vmax表現(xiàn)為距石油工作區(qū)5 km處裸地最大、羊草修復(fù)地最小.

b) 不同含油量石油污染裸地和羊草修復(fù)地多酚氧化酶的熱力學(xué)參數(shù)Q10、ΔH、ΔS在10～40 ℃溫度范圍內(nèi)隨溫度升高的差異不顯著，ΔG呈逐漸增加趨勢(shì)；在同一溫度下，Q10、Ea、ΔH、ΔS均表現(xiàn)為距石油工作區(qū)1 km處裸地最大、羊草修復(fù)地最小.