裴媛媛， 佟宇俊， 李慧珍， 符志友， 張 遠(yuǎn)， 游 靜*

1.暨南大學(xué)環(huán)境學(xué)院， 廣東省環(huán)境污染與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣東 廣州 510443

2.中國環(huán)境科學(xué)研究院， 環(huán)境基準(zhǔn)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100012

隨著工業(yè)化和城鎮(zhèn)化進(jìn)程的加快，來自工業(yè)生產(chǎn)、農(nóng)業(yè)活動(dòng)和居民生活的各類污染物被排入環(huán)境中，最終在受納水體和沉積物中呈現(xiàn)典型的復(fù)合污染狀況，直接威脅水生態(tài)健康. 目前，水環(huán)境生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估方法一般包括商值法、生物測試和野外生態(tài)調(diào)查三大類[1]：商值法通過獲取環(huán)境介質(zhì)中污染物濃度，然后將其與基準(zhǔn)值比較判斷風(fēng)險(xiǎn)；生物測試一般在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，將模式生物暴露在野外采集的水或沉積物樣品中獲取毒性效應(yīng)結(jié)果；野外生態(tài)調(diào)查主要針對(duì)本土魚類和大型底棲無脊椎動(dòng)物的種群豐度等進(jìn)行觀測統(tǒng)計(jì)，直接反映生態(tài)系統(tǒng)的受損狀況. 三類方法(單獨(dú)或聯(lián)合)已被廣泛應(yīng)用在水生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，但也各自存在一定的局限性. 商值法中基準(zhǔn)值的推導(dǎo)過程假定污染物為單一暴露，忽略了復(fù)合污染下污染物之間的交互作用[2]，而且傳統(tǒng)分析方法缺少考慮污染物的生物有效性，使得評(píng)估結(jié)果存在偏差. 實(shí)驗(yàn)室生物測試一方面在樣品采集過程中因人為操作可能會(huì)改變污染物形態(tài)[3]，而且瞬時(shí)采樣難以代表真實(shí)環(huán)境中污染物濃度隨時(shí)間的波動(dòng)[4]；另一方面，實(shí)驗(yàn)室中恒定的溫度、pH、溶解氧和光照等條件，難以真實(shí)模擬野外實(shí)際暴露情況[5-6]，這些都會(huì)造成風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果的偏差[7]. 野外生態(tài)調(diào)查針對(duì)本土物種，難以確定種別和生長階段，而且生物在長期污染壓力下可能產(chǎn)生適應(yīng)性，對(duì)污染物的敏感度改變，影響風(fēng)險(xiǎn)判斷[8]. 野外原位生物測試則可以有效降低上述問題對(duì)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果的影響，還能成為實(shí)驗(yàn)室生物測試和野外生態(tài)調(diào)查的橋梁[9]，有助于實(shí)驗(yàn)室個(gè)體水平的毒性結(jié)果向野外種群層面的外推. 因此，發(fā)展原位生物測試方法，獲取受試生物在復(fù)合污染脅迫下的真實(shí)毒性效應(yīng)和體內(nèi)積累濃度信息，對(duì)準(zhǔn)確評(píng)估水生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義.

原位生物測試是指將受試生物暴露于野外真實(shí)環(huán)境中，測定污染物在個(gè)體水平上的生物積累及毒性效應(yīng)[10]，其操作方式包括將生物放置于暴露室、移植到環(huán)境介質(zhì)、圈圍研究位點(diǎn)、搭建近岸微宇宙和在線自動(dòng)化生物測試[11]，其中將生物放置于暴露室來進(jìn)行原位測試的應(yīng)用研究最多，其具有設(shè)計(jì)靈活、操作簡便的優(yōu)勢. 原位生物測試在20世紀(jì)80年代初首次使用[3]，經(jīng)過近40年的發(fā)展，受試生物從魚類和雙殼貝類逐漸拓展到多種大型無脊椎動(dòng)物，從單一物種暴露發(fā)展為多物種同時(shí)暴露，而研究位點(diǎn)也涵蓋了淡水、海洋、河口和濕地等. 美國試驗(yàn)材料學(xué)會(huì)(American Society for Testing Material，ASTM)在2001年編訂了《雙殼貝類進(jìn)行原位生物測試的標(biāo)準(zhǔn)方法》，并分別在2002年、2007年和2013年進(jìn)行了修訂[12]，也為其他生物的原位暴露試驗(yàn)提供了參考. 2004年環(huán)境毒理與化學(xué)協(xié)會(huì)(Society of Environmental Toxicology and Chemistry，SETAC)召開圍繞原位生物測試的主題研討會(huì)并發(fā)表系列文章[8-9,11,13]，從方法論和應(yīng)用性等方面進(jìn)行系統(tǒng)闡述，此后，原位生物測試在水生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中的應(yīng)用得以顯著促進(jìn). 近年來，在北美和歐洲等國家進(jìn)行原位生物測試的研究應(yīng)用越來越多，形成了逐步標(biāo)準(zhǔn)化的暴露裝置和操作流程[10]，研究范圍也發(fā)展為整個(gè)流域和國家[14]，相對(duì)而言，中國在該方面的研究仍較為匱乏.

為了促進(jìn)我國水環(huán)境生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中原位生物測試方法的應(yīng)用，該研究通過介紹原位生物測試方法的實(shí)施三要素，即受試生物、暴露裝置和研究位點(diǎn)，重點(diǎn)闡述其選擇或設(shè)計(jì)原則，并舉例加以說明，為方法的具體實(shí)施提供指導(dǎo)，在此基礎(chǔ)上總結(jié)了原位生物測試方法在水生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中三類常見的應(yīng)用場景，包括基于原位生物效應(yīng)的評(píng)估，基于生物體內(nèi)濃度的評(píng)估，以及與環(huán)境濃度相結(jié)合的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，通過案例分析來梳理如何利用原位生物測試結(jié)果進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，最后討論了該方法的發(fā)展和應(yīng)用前景，以期為我國水環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供新思路.

1 原位生物測試方法的介紹

1.1 受試生物

選擇合適的受試生物對(duì)原位生物測試至關(guān)重要，受試生物可以是實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖的模式生物，也可以是經(jīng)過馴化的本土生物[15]. 模式生物的優(yōu)勢在于，一方面其具有豐富的生物學(xué)信息和毒性數(shù)據(jù)，而且生活史明確，同批次生物具有相同的生物學(xué)特征(大小、生長階段、性別等)；但另一方面需要考慮的是，所選物種需要在所研究的生態(tài)系統(tǒng)中具有代表性. 本土生物可以選擇研究區(qū)域的關(guān)鍵物種、指示物種或優(yōu)勢物種，其相關(guān)的生物學(xué)和毒理學(xué)研究較為充分，較容易實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室的馴養(yǎng)，馴養(yǎng)過程還需要根據(jù)該種生物的行為和攝食習(xí)慣等來判斷其是否適于放置在暴露室[13]. 因污染場地可能顯著改變本土生物的耐受性，所以需要采集自干凈區(qū)域的本土生物，并盡量使用相同生物學(xué)特征的受試生物.

考慮到具體實(shí)施過程對(duì)受試生物的影響，在選擇受試物種時(shí)還需要考慮生物對(duì)水質(zhì)參數(shù)的耐受范圍、個(gè)體大小和運(yùn)輸耐受性[10]. 生物對(duì)溫度、pH、電導(dǎo)率和溶解氧的耐受范圍廣，可以避免原位暴露時(shí)水質(zhì)參數(shù)波動(dòng)引起的個(gè)體死亡. 個(gè)體大小適中，既有利于暴露室的設(shè)計(jì)和投放，也能為測定生物體內(nèi)污染物濃度和毒性終點(diǎn)提供充足的樣品量. 個(gè)體小的受試生物活動(dòng)范圍也小，對(duì)應(yīng)小體積的暴露室，可以在保證生物放養(yǎng)密度和運(yùn)輸要求下，增加每個(gè)位點(diǎn)暴露室的平行樣，從而增加統(tǒng)計(jì)可信度. 此外，從實(shí)驗(yàn)室到野外位點(diǎn)的運(yùn)輸過程不可避免會(huì)對(duì)生物產(chǎn)生一定影響，太過敏感的生物容易在顛簸中造成機(jī)體損傷，干擾后續(xù)的原位測試結(jié)果.

目前原位生物測試研究中的受試生物有魚類(見表1)以及雙殼類、腹足類、甲殼類、多毛綱、寡毛綱等無脊椎動(dòng)物(見表2). 常見的魚類包括模式生物黑頭軟口鰷[16-20]和虹鱒魚[26]，以及本土物種鯽魚[22-23]、羅非魚[24-25]和鮭魚[26]等，常見的雙殼類包括菲律賓蛤仔[29-30]、河蜆[30-31]和貽貝[32-35]，腹足類有銅銹環(huán)棱螺[36]和泥螺[37]，甲殼類有模式生物鉤蝦[14,38-39]、大型溞[39]和模糊網(wǎng)紋溞[1]，其他用于生物暴露的底棲無脊椎動(dòng)物還有模式生物搖蚊幼蟲[39-42]、沙蠶[5,10]、水螅和蜉蝣幼蟲[1]. 研究位點(diǎn)的環(huán)境介質(zhì)可以細(xì)分為上層水體、底層水體、水-沉積物界面、表層沉積物、沉積物空隙水，目標(biāo)環(huán)境介質(zhì)一般和生物的棲息地相匹配，魚類和甲殼類暴露在水體，底棲無脊椎動(dòng)物暴露在沉積物中，而雙殼貝類由于既可以攝食沉積物顆粒還可以濾食水體中的浮游藻類和有機(jī)碎屑，在水體[30,32-33,35]和沉積物[29,31,33-34]中的應(yīng)用均較多.

受試生物的原位暴露時(shí)間往往結(jié)合效應(yīng)終點(diǎn)來確定，時(shí)長范圍從2 d的短期暴露到兩個(gè)月的長期暴露(見表1、2). 敏感效應(yīng)終點(diǎn)一般對(duì)應(yīng)短期暴露，生長、繁殖和體內(nèi)濃度的效應(yīng)終點(diǎn)對(duì)應(yīng)長期暴露，也有研究將處于較早生命周期的受試生物進(jìn)行短期原位暴露，之后將其收集后繼續(xù)在實(shí)驗(yàn)室長期喂養(yǎng)，以探究早期原位復(fù)合污染暴露對(duì)生物發(fā)育、攝食率和繁殖率的影響[10,43].

受試生物的效應(yīng)終點(diǎn)往往根據(jù)研究目標(biāo)和生物特征來選擇，涵蓋從基因水平到個(gè)體水平(見表1、2)，基因水平的效應(yīng)終點(diǎn)有與內(nèi)分泌[17]、細(xì)胞色素、金屬硫蛋白和卵黃蛋白原[26]相關(guān)的基因表達(dá)，以及卵巢轉(zhuǎn)錄組[16]、DNA損傷[27,29-31]等；分子水平的效應(yīng)終點(diǎn)有葡萄糖含量[20,25]、蛋白質(zhì)羰基含量[24,36]、代謝相關(guān)酶和抗氧化酶活性[22-25,27,30-31,36,44]、線粒體電子轉(zhuǎn)移[29]等；器官組織水平的效應(yīng)終點(diǎn)有組織病理[24,27,31]、肝體指數(shù)[22,28]、各組織器官污染物濃度[22]等；個(gè)體水平的效應(yīng)終點(diǎn)有存活率[1,5,10,19,21,35,37,39-41]、攝食率[1,5,10,38,43]、生長速率[19,41-42]、發(fā)育[10]、繁殖[19,37]等.

受試生物的物種、暴露時(shí)間和效應(yīng)終點(diǎn)是進(jìn)行原位生物測試的基礎(chǔ)，其選擇的合理性直接影響生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果. 與實(shí)驗(yàn)室生物測試通常采用模式生物相比，原位生物測試往往更靈活地選用本土生物，使其更具生態(tài)相關(guān)性，能夠更準(zhǔn)確地表征研究位點(diǎn)復(fù)合污染對(duì)本土生物的脅迫，但使用不同種類的本土生物也造成原位暴露方法難以嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)化. 為了促進(jìn)原位生物測試在環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和管理中的應(yīng)用，優(yōu)先推薦模式生物，利用國內(nèi)外已有的劑量-效應(yīng)數(shù)據(jù)，更好地闡釋暴露和原位效應(yīng)的因果關(guān)系.

1.2 暴露裝置

原位生物測試的暴露裝置是保證測試結(jié)果有效的關(guān)鍵要素，設(shè)計(jì)的基本要求是將受試生物限制在研究位點(diǎn)，同時(shí)生物又可與目標(biāo)環(huán)境介質(zhì)充分接觸，盡量減小裝置內(nèi)暴露條件與外界的差異，使受試生物盡可能暴露在自然真實(shí)的環(huán)境中[13]. 在此要求下，暴露裝置所用材質(zhì)要求無毒無害、物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，可以耐受目標(biāo)區(qū)域水質(zhì)參數(shù)的波動(dòng)，常見的材料為尼龍[26,32,36-37]、聚乙烯[1,22,27,34-35]、聚氯乙烯[29]、醋酸丁酸纖維素[1,39]和亞克力[43]等塑料和不銹鋼[19-20,33](見表1、2). 若裝置為圓筒形狀，考慮到透光性需要使用透明的塑料材質(zhì)[1,39]. 使用塑料材質(zhì)時(shí)，需要注意裝置可能對(duì)疏水性有機(jī)污染物有一定的吸附作用，這需要在實(shí)驗(yàn)室預(yù)先評(píng)估，裝置對(duì)污染物的吸附是否會(huì)對(duì)原位測試產(chǎn)生影響[1].

裝置一般通過網(wǎng)孔與外界環(huán)境介質(zhì)聯(lián)通，而裝置網(wǎng)孔大小的設(shè)計(jì)需要從多方面考慮. 對(duì)于受試生物來說，由于活動(dòng)范圍被限制在暴露裝置內(nèi)，溶解氧和營養(yǎng)物質(zhì)的獲取以及代謝廢物的排出需要依賴暴露裝置內(nèi)外的水流交換. 如果網(wǎng)孔較小會(huì)造成暴露室內(nèi)溶解氧降低、氨氮升高[10]，對(duì)受試生物產(chǎn)生較大的脅迫，而且小網(wǎng)孔更容易造成藻類等生物淤積產(chǎn)生堵塞；如果網(wǎng)孔過大，可能造成生物逃逸、增加本地捕食者入侵的可能性.

表1 魚類原位生物測試的應(yīng)用

裝置大小的設(shè)計(jì)，一方面兼顧運(yùn)輸和投放回收時(shí)的便捷性，減少對(duì)環(huán)境的擾動(dòng)；另一方面要保證合理的生物密度，不對(duì)受試生物造成壓力或造成非自然的空間、資源競爭[13]. 對(duì)于開展長期暴露但無法獲取足夠營養(yǎng)物質(zhì)的受試生物，還需要加裝食物投喂裝置[19,42]，避免因營養(yǎng)不足對(duì)生物產(chǎn)生壓力，造成不良效應(yīng).

表2 無脊椎動(dòng)物原位生物測試的應(yīng)用

續(xù)表2

注： 裝置A為適合魚類暴露的網(wǎng)框狀裝置；裝置B為適合雙殼貝類的網(wǎng)袋裝置；裝置C為適合底棲無脊椎動(dòng)物的圓筒裝置.

目前，研究中常用的暴露裝置依據(jù)受試生物的不同可分為3種類型，3種裝置示意如圖1所示. 由圖1可見：裝置A為適合魚類暴露的網(wǎng)框狀裝置[16,19-28]，下端系有磚石固定，上端系有浮球，通過調(diào)整浮球和網(wǎng)框的距離來決定受試生物在水體的暴露深度，網(wǎng)框形狀一般為圓柱體和立方體；裝置B為適合雙殼貝類的網(wǎng)袋裝置[30,32,34]，也是《雙殼貝類進(jìn)行原位生物測試的標(biāo)準(zhǔn)方法》中推薦使用的，將貝類放入網(wǎng)袋，豎直排列，每個(gè)貝之間用束帶隔開，每串豎直掛在方形框架上以保證水流的充分交換，該裝置操作簡單，可以同時(shí)進(jìn)行大量貝類的原位測試；裝置C為適合底棲無脊椎動(dòng)物的圓筒裝置[1,14,39,43]，透明的塑料圓筒兩端封上蓋子，側(cè)邊開窗覆尼龍網(wǎng)進(jìn)行水流交換. 如果受試生物為鉤蝦和大型溞等棲息在沉積物表面的，圓筒直接放置在沉積物上；如果受試生物為帶絲蚓和搖蚊幼蟲等棲息在表層沉積物中的底棲動(dòng)物，圓筒需要插入沉積物，使沉積物通過網(wǎng)窗進(jìn)入暴露室，保證受試生物與沉積物直接接觸.

在上述三類暴露裝置的基礎(chǔ)上，研究者們加入了自動(dòng)取樣器[4]、在線水質(zhì)傳感器和被動(dòng)采樣器[10,37]，可以同步獲取環(huán)境水質(zhì)信息和污染物環(huán)境濃度，并實(shí)現(xiàn)了多物種同時(shí)暴露[5]，獲取更全面的效應(yīng)信息. 其中以Burton等[10]設(shè)計(jì)的沉積物生態(tài)毒性評(píng)估環(huán)〔Sediment Ecotoxicity Assessment (SEA) Ring〕最具代表性，其集多暴露室、水質(zhì)監(jiān)測和被動(dòng)采樣于一體，同步進(jìn)行沉積物上覆水(底層水體)、水-沉積物界面和表層沉積物的生物測試，實(shí)時(shí)監(jiān)測暴露室內(nèi)的溫度、溶解氧、pH、電導(dǎo)率、鹽度和氧化還原電位；同時(shí)利用被動(dòng)采樣器獲取有機(jī)污染物和重金屬的生物有效濃度，為評(píng)估沉積物的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)提供較全面的原位暴露和效應(yīng)證據(jù).

暴露裝置是原位生物測試區(qū)別于實(shí)驗(yàn)室生物測試的特色所在，但需要將受試生物從實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)移到野外暴露室，操作更為復(fù)雜，因此在設(shè)計(jì)和實(shí)施中應(yīng)盡可能減少對(duì)受試生物的影響，從而提高測試結(jié)果的可靠性. 在保證測試效果的前提下，設(shè)計(jì)簡單、操作方便和成本適中的暴露裝置具有更大的應(yīng)用前景，有助于原位生物測試方法的推廣. 布設(shè)底棲生物的暴露室需要將裝置壓入沉積物，若水體較深，一般需要潛水員操作，但會(huì)增加應(yīng)用難度和成本，因此建議使用傳送桿壓入的方式，方便操作者在船上布設(shè)暴露裝置. 目前，研究中使用的暴露裝置向多物種、多環(huán)境介質(zhì)和結(jié)合被動(dòng)采樣的方向發(fā)展，旨在通過一次野外暴露同時(shí)獲取盡可能多的關(guān)于污染物濃度水平和受試生物毒性效應(yīng)的數(shù)據(jù).

1.3 研究位點(diǎn)

為了保證試驗(yàn)的順利開展和數(shù)據(jù)有效性，在進(jìn)行原位生物測試前，需要先獲取研究位點(diǎn)的水文信息、水質(zhì)參數(shù)和棲息地條件[13]. 水文信息包括水深、流速等，決定了生物的原位暴露深度和裝置的設(shè)計(jì)；水質(zhì)參數(shù)包括溫度、溶解氧、pH、電導(dǎo)率和氨氮等，需要與受試生物的耐受范圍進(jìn)行比對(duì)，若超出耐受范圍造成受試生物全部致死，則在該位點(diǎn)進(jìn)行的生物測試便失去意義；棲息地條件主要指沉積物的情況，特別對(duì)需要在沉積物中筑巢的底棲生物會(huì)產(chǎn)生較大影響.

研究位點(diǎn)的水溫和實(shí)驗(yàn)室的喂養(yǎng)水溫往往存在差異，為了避免溫度差異造成的應(yīng)激壓力，受試生物在投放前需要慢慢調(diào)整至研究位點(diǎn)的水溫，確保生物適應(yīng)測試溫度[45]. 在投放時(shí)暴露裝置會(huì)對(duì)水體和沉積物造成擾動(dòng)，為了減少影響，有的研究中會(huì)留出裝置平衡時(shí)間，待平衡后再利用生物傳送設(shè)備將受試生物放置于暴露室[42,46].

由于原位生物測試在實(shí)施過程中涉及大量人為操作步驟，如運(yùn)輸、投放、喂食和回收，這些人為影響都可能對(duì)結(jié)果產(chǎn)生干擾[10]. 為了進(jìn)行質(zhì)量保證和質(zhì)量控制，需要設(shè)置實(shí)驗(yàn)室控制組和野外參照位點(diǎn)，要求受試生物存活率在80%以上[1]. 實(shí)驗(yàn)室對(duì)照組的生物需要運(yùn)至野外現(xiàn)場，但不投放到水環(huán)境中，之后再運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行相同時(shí)間的喂養(yǎng)，用來排除運(yùn)輸過程對(duì)生物的影響. 野外參照位點(diǎn)一般選擇與研究位點(diǎn)水文和棲息地條件比較接近的潔凈區(qū)域，如河流上游或較少受到人類活動(dòng)影響的湖泊或海灣位點(diǎn)，用來排除運(yùn)輸、投放過程和野外其他環(huán)境因素的干擾.

2 原位生物測試方法在水環(huán)境生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中的應(yīng)用

2.1 基于原位生物效應(yīng)的評(píng)估

將原位生物效應(yīng)結(jié)果應(yīng)用在水環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中，可以直接獲取混合污染物對(duì)生物體的不良效應(yīng)，提升評(píng)估環(huán)境的真實(shí)性和準(zhǔn)確度. Burton等[1]嘗試將黑頭軟口鰷、大型溞、模糊網(wǎng)紋溞、鉤蝦、搖蚊幼蟲、夾雜帶絲蚓、水螅和蜉蝣幼蟲用于美國河流和小溪的原位生物測試，根據(jù)生物棲息地對(duì)應(yīng)的水體或沉積物暴露，使用包括存活率、攝食率和生長等效應(yīng)終點(diǎn)來判斷復(fù)合環(huán)境壓力對(duì)水生生物的風(fēng)險(xiǎn)；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，在大部分研究位點(diǎn)，原位與實(shí)驗(yàn)室的效應(yīng)結(jié)果存在明顯不同，主要是暴露動(dòng)力學(xué)的差異和樣品處理過程的人為偏差造成的.

隨著測定技術(shù)的發(fā)展，受試生物在分子和基因水平上的效應(yīng)終點(diǎn)可以更靈敏地表征環(huán)境中各類痕量污染物共同暴露引起的損傷. 對(duì)比參照位點(diǎn)，暴露于污水處理廠受納海灣沉積物中14 d的菲律賓蛤仔[29]雖然沒有死亡，但重金屬、多環(huán)芳烴、藥物和表面活性劑等多種類污染物導(dǎo)致分子水平上生物標(biāo)志物的顯著改變，包括Ⅰ相代謝酶7-乙氧基異吩唑酮-O-脫乙基酶(EROD)，Ⅱ相代謝酶谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)，抗氧化系統(tǒng)的谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)和還原性谷胱甘肽(GR)，表征神經(jīng)毒性的乙酰膽堿酯酶(AChE)，表征氧化壓力的溶酶體膜穩(wěn)定性(LMS)、脂質(zhì)過氧化(LPO)和DNA損傷，以及表征個(gè)體能量狀態(tài)的總脂肪含量和線粒體電子轉(zhuǎn)移，這些原位生物效應(yīng)表明污水排放對(duì)海洋沉積物中的底棲生物造成了風(fēng)險(xiǎn). 在基因水平上，污水處理廠排水導(dǎo)致黑頭軟口鰷肝臟代謝組學(xué)圖譜產(chǎn)生差異[18]，農(nóng)田徑流的季節(jié)性間歇農(nóng)藥暴露會(huì)顯著影響黑頭軟口鰷體內(nèi)與內(nèi)分泌相關(guān)基因的表達(dá)[17]，說明水體中這些外源污染物對(duì)魚類造成了代謝和生長發(fā)育的負(fù)面影響.

原位生物效應(yīng)可以直接表征復(fù)合污染對(duì)水生生物的危害，根據(jù)與參考位點(diǎn)的對(duì)比來判斷是否存在風(fēng)險(xiǎn)，根據(jù)不同位點(diǎn)間效應(yīng)的差異來判別風(fēng)險(xiǎn)高低. 從近期的研究來看，原位生物效應(yīng)的測試呈多層次、多元化的發(fā)展趨勢，除了傳統(tǒng)的致死、生長發(fā)育和攝食率的測定[1,5]，分子和基因水平的效應(yīng)測定也較為成熟并得到大量應(yīng)用[27,29-30]；同時(shí)出現(xiàn)了代謝組學(xué)[18]和轉(zhuǎn)錄組學(xué)[16]等新技術(shù)，其可以識(shí)別出各類污染物在低劑量共同暴露下引起的不良生物效應(yīng). 針對(duì)我國水環(huán)境污染區(qū)域差異大的現(xiàn)狀，同一區(qū)域既有部分可引起短期急性毒性的位點(diǎn)，也有主要是痕量污染物引起長期慢性毒性的位點(diǎn)，因此更適合采用多層次毒性終點(diǎn)的原位生物效應(yīng)來表征不同區(qū)域的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn).

2.2 基于原位生物體內(nèi)濃度的評(píng)估

原位受試生物的體內(nèi)污染物積累是對(duì)環(huán)境中污染物生物可利用性的直接度量，也與生物的毒性效應(yīng)直接相關(guān)，是水生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中的有力證據(jù). 法國研究團(tuán)隊(duì)[14,47-48]利用鉤蝦作為原位受試生物，通過分析7 d原位暴露后污染物在鉤蝦體內(nèi)的濃度，表征河流中污染物的生物有效性. 首先選取了代表不同物理化學(xué)特征和人類活動(dòng)影響程度的27個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行初步篩查，控制性別、體重和食物供給條件以保證原位結(jié)果的準(zhǔn)確性和可對(duì)比性，定量分析了鉤蝦體內(nèi)11種重金屬和38種疏水性有機(jī)污染物的濃度(多環(huán)芳烴、多氯聯(lián)苯、多溴聯(lián)苯醚和有機(jī)氯農(nóng)藥)[48]；然后利用統(tǒng)計(jì)方法和模型建立了基于鉤蝦體內(nèi)濃度的生物可利用污染閾值，高于該閾值的位點(diǎn)意味著存在污染；隨后將該方法在流域尺度上的94個(gè)位點(diǎn)推廣應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)隨著鉤蝦體內(nèi)重金屬Cd、Ni和Pb濃度的升高，本土鉤蝦種群豐度顯著下降，據(jù)此推算出基于鉤蝦體內(nèi)濃度的生物可利用生態(tài)評(píng)估濃度[47]. 近期研究[14]覆蓋了法國的218個(gè)位點(diǎn)，通過原位鉤蝦體內(nèi)18種重金屬和43種持久性有機(jī)污染物濃度進(jìn)行了更大空間尺度的污染篩查，并與前期建立的污染閾值對(duì)比，構(gòu)建了綜合生物可利用污染指數(shù)(IBC)，用以定量不同位點(diǎn)的污染風(fēng)險(xiǎn)，發(fā)現(xiàn)IBC值的增高會(huì)造成大型底棲無脊椎動(dòng)物種群的退化. 已有研究[14]的開展有效聯(lián)系了原位生物測試中個(gè)體水平效應(yīng)與野外種群水平效應(yīng)，進(jìn)一步提升了原位生物測試在環(huán)境管理中應(yīng)用的前景.

原位暴露生物體內(nèi)濃度越高說明研究位點(diǎn)的目標(biāo)污染物在生物體富集的風(fēng)險(xiǎn)越大，更容易進(jìn)入水生生物食物鏈進(jìn)行傳遞. 在進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估時(shí)，如上述對(duì)鉤蝦的研究[14,47-48]，加入體內(nèi)濃度閾值可以將風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行定量化判斷，但需要大范圍研究位點(diǎn)的數(shù)據(jù)支撐. 因此，布設(shè)在小范圍研究位點(diǎn)獲取的原位生物測試結(jié)果往往難以推算出閾值，一般通過與環(huán)境濃度相結(jié)合來計(jì)算生物富集因子(Bioconcentration Factor，BCF)和生物沉積物積累因子(Biota-Sediment Accumulation Factor，BSAF)，從而來表征污染物的生物積累潛力.

2.3 結(jié)合環(huán)境濃度的評(píng)估

將原位生物效應(yīng)和體內(nèi)濃度與環(huán)境濃度相結(jié)合，可以更清楚地探明污染物暴露與效應(yīng)之間的關(guān)系，識(shí)別水環(huán)境生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)來源. Perkins等[16]將黑頭軟口鰷原位暴露于污水處理廠下游河流8 d，并通過暴露裝置上的自動(dòng)取樣器連續(xù)收集水樣，定量檢出水體中固醇類、阻燃劑、藥物、烷基酚、個(gè)人護(hù)理品、增塑劑、殺蟲劑等53種污染物，結(jié)合卵巢轉(zhuǎn)錄組方法和污染物-基因相關(guān)性分析，篩查出優(yōu)控污染物. 為了更加準(zhǔn)確地定量環(huán)境介質(zhì)中各類污染物的生物有效性，將被動(dòng)采樣方法與原位生物測試結(jié)合[5,10,32,37]. 為了評(píng)估城市污水處理廠的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，Zounkova等[37]利用泥螺進(jìn)行了56 d的長期原位生物測試，并同時(shí)進(jìn)行原位被動(dòng)采樣，利用極性有機(jī)物整合采樣器(Polar Organic Chemical Integrative Sampler, POCIS)和半滲透膜裝置(Semipermeable Membrane Device, SPMD)定量多種有機(jī)污染物，包括多環(huán)芳烴、多氯聯(lián)苯、有機(jī)氯農(nóng)藥、多溴聯(lián)苯醚、極性農(nóng)藥、藥物、全氟有機(jī)化合物和烷基酚，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在復(fù)合污染脅迫下泥螺的存活率和繁殖均受到顯著抑制，而沉積物中的重金屬是引起生物致死的主要污染物.

環(huán)境濃度作為外暴露水平，體內(nèi)濃度作為內(nèi)暴露水平，通過對(duì)內(nèi)外暴露水平和生物效應(yīng)進(jìn)行多證據(jù)鏈的分析可以實(shí)現(xiàn)更加全面、準(zhǔn)確的水生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估. 將原位生物暴露裝置和被動(dòng)采樣器進(jìn)行有機(jī)結(jié)合，可同步獲取原位污染物內(nèi)外暴露水平和生物效應(yīng)信息，這也是未來原位生物測試方法的發(fā)展趨勢.

3 結(jié)論與展望

a) 針對(duì)我國目前流域水環(huán)境的污染現(xiàn)狀，原位生物測試能夠提供在真實(shí)復(fù)合污染脅迫下的毒性效應(yīng)和污染物生物積累信息，有助于實(shí)現(xiàn)更有針對(duì)性和環(huán)境相關(guān)性的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估. 該方法近年來在國際上已得到廣泛的應(yīng)用，在廢水排放生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和污染場地修復(fù)評(píng)估中的應(yīng)用案例較多，也應(yīng)用于大范圍的區(qū)域篩查和流域評(píng)估項(xiàng)目. 相對(duì)于傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室生物測試，原位生物測試的優(yōu)勢是可以綜合復(fù)雜的環(huán)境條件對(duì)受試生物的影響，但這也增加了解釋脅迫因子與生物效應(yīng)關(guān)聯(lián)的難度. 為了更好地識(shí)別引起原位生物效應(yīng)的污染物，目前有研究者將原位生物測試和污染物分離相結(jié)合，開發(fā)原位毒性鑒別評(píng)價(jià)技術(shù)(insituToxicity Identification Evaluation，iTIE)[49-50]，在生物暴露室前端串聯(lián)上吸附劑室，通過泵使水通過吸附劑凈化后再進(jìn)入暴露室，不同吸附劑可以對(duì)應(yīng)除去不同類型有機(jī)污染物、重金屬和氨氮，通過對(duì)比有無吸附劑處理造成的原位生物效應(yīng)差異，鑒別上層水、沉積物孔隙水和排放廢水中引起毒性的化合物種類.

b) 相較于已經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)室生物測試，原位生物測試方法仍缺少標(biāo)準(zhǔn)化，從而限制了其在環(huán)境管理中推廣應(yīng)用. 因此，在未來發(fā)展中有必要建立統(tǒng)一、規(guī)范化的操作流程，明晰實(shí)施過程中受試生物、暴露裝置和研究位點(diǎn)的選擇或設(shè)計(jì)原則，提高質(zhì)量控制和質(zhì)量保證，有利于原位生物測試成為水生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的有力支撐.

c) 作為生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，暴露評(píng)估和效應(yīng)評(píng)估可以通過原位被動(dòng)采樣和生物測試在線同步實(shí)現(xiàn). 將兩種方法進(jìn)行聯(lián)用，通過證據(jù)權(quán)重法匯總暴露和效應(yīng)結(jié)果，對(duì)研究位點(diǎn)的污染水平和毒性進(jìn)行綜合分析，在水生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中有很好的應(yīng)用前景.