陸珉成， 李英華， 費文超， 徐天元， 徐 可， 童文卿， 洪 洋

復旦大學附屬上海市第五人民醫(yī)院骨科，上海 200240

藍光是一種波長為400～500 nm的可見光，常被應用于臨床[1-2]。藍光光子可被皮膚中的膽紅素吸收，進而通過光化學反應將膽紅素轉換為可被腎臟和肝臟排泄的異構體，產生類似于藥物劑量反應的效應，常被用于治療新生兒黃疸[3]。藍光可誘導活性氧的產生，活化丙酸桿菌中的卟啉，促使丙酸桿菌死亡，從而抑制痤瘡的發(fā)生[4]；也可用于治療幽門螺桿菌感染[2]和念珠菌陰道炎[5]。藍光可聯合5-氨基酮戊酸或其甲酯化產物，治療光線性角化病患者的皮膚損害[6]。藍光照射傷口可誘導細胞色素氧化酶和線粒體血紅蛋白釋放NO，有效激活NO抑制的線粒體[7]，同時藍光被血紅蛋白吸收后會引起局部溫度升高，誘發(fā)凝血效應，從而促進傷口愈合[8]。此外，藍光可通過調整人體生物鐘的晝夜節(jié)律，抑制體內褪黑素的產生，改善帕金森患者的情緒和睡眠障礙[9]，降低季節(jié)性情感障礙的發(fā)病率[10]。

藍光與骨代謝的關系一直是骨科領域的關注熱點[11-13]。Yuan等[11]的實驗結果顯示，藍光會抑制骨髓間充質干細胞增殖，促使凋亡，抑制成骨分化。Notomi等[12]的研究顯示，藍光刺激可提高RAW264.7細胞的抗酒石酸鹽酸性磷酸酶活性及促進破骨分化。Dereci等[13]利用藍光照射顱骨缺損大鼠模型的骨膜，發(fā)現LED藍光能促進骨生成。然而目前關于藍光對骨的影響在細胞層面的研究結果不一致。因此，本研究從動物水平研究藍光干預對維甲酸致骨質疏松模型骨代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 9月齡SPF級健康雌性SD大鼠24只，體質量(370±37)g，由華東師范大學動物實驗中心提供[動物質量許可證號：SYXK(滬)2016-0010]。將大鼠隨機分為正常組、模型組、藍光1組和藍光2組，每組6只，每籠3只，分籠飼養(yǎng)在室溫20～28℃、相對濕度60%～80%、通風良好的清潔環(huán)境中，自由飲水，用專用鼠糧喂養(yǎng)。本研究通過復旦大學動物倫理委員會批準(2019五院JS-043)。

1.2 主要試劑與儀器 維甲酸(98%，上海善然生物科技有限公司)，大鼠ALP ELISA(96T)試劑盒、大鼠β-CTX ELISA(96T)試劑盒、大鼠P1NP ELISA(96T)試劑盒均購自武漢貝萊茵生物科技有限公司，水合氯醛、無水乙醇(化學純)購自中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑有限公司。鈣檢測試劑盒、磷檢測試劑盒均購自貝克曼庫爾特中國有限公司。其他包括全自動生化分析儀(CX5，Beckman公司，美國)，酶標儀(Epoch，BioTek公司，美國)，MicroCT儀(SKYSCAN 1275，Bruker公司，德國)，恒溫水浴箱(ST-RT-V50，上海一恒科技有限公司)，冰箱(-86℃，DW-86L828型，海爾集團)，低溫離心機(5920R，Eppendorf公司，德國)，460 nm LED藍光燈(復旦大學信息學院光源與照明工程系定制)。

1.3 給藥和干預方法 維甲酸用超純水超聲溶解。模型組和藍光組大鼠每天用100 mg/kg維甲酸連續(xù)灌胃14 d，正常組大鼠給予同體積的蒸餾水灌胃14 d。14 d后停止藥物干預，恢復正常的飲食、飲水。造模過程中，各組均采用正常的日光燈照明。造模結束后，正常組和模型組采用正常光照，日光燈控制晝夜(12 h∶12 h )；藍光組采用460 nm的LED藍光燈控制晝夜(12 h∶12 h )，光照強度(30 000±2 000)Lux。藍光1組(藍光干預14 d)造模結束后第1周采用日光燈光照，第2～3周用LED藍光燈照明；藍光2組(藍光干預21 d)造模后第1～3周均采用藍光光照。非藍光照射時日光燈照射補齊至總照射天數(35 d)。采用干預開始時間不同、截止時間相同的方法來控制實驗結束時實驗大鼠的條件一致性。

1.4 血清學指標測定 光照結束時，所有大鼠按0.5 mL/100 g腹腔注射4%水合氯醛麻醉后，稱質量，用促凝管采眼眶靜脈血1.5 mL，3 500r/min，4℃離心10 min，取血清，按照試劑盒說明書檢測血清鈣、磷、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、β-膠聯降解物(β-bonded degradation products，β-CTX)和Ⅰ型前膠原氨基端肽(amino terminal peptide of procollagen type 1，P1NP)等指標。鈣、磷檢測采用化學發(fā)光法，ALP、β-CTX和P1NP檢測采用ELISA法。

1.5 骨密度及骨微結構測定 所有大鼠用CO2麻醉處死后取股骨，去除筋膜，0.9%氯化鈉液沖洗凈后采用濾紙吸干表面水分，將樣本置于microCT掃描儀樣本室，設置掃描參數為60 kV、166 μA，掃描精度為18 μm，掃描時間為30～40 min。掃描完成后，利用掃描儀自帶軟件對掃描數據進行3D重建，選定股骨樣本靠近膝關節(jié)段的區(qū)域，進行數據分析與統(tǒng)計，獲取骨密度、骨小梁數量、骨小梁厚度和骨小梁分離度。每個樣本平均掃描3次，取平均值。

2 結 果

2.1 ALP、β-CTX和P1NP工作曲線的建立 根據ALP、β-CTX和P1NP的試劑盒說明，以標準品濃度為橫坐標、對應D值為縱坐標得到各工作曲線。ALP的計算公式：y=0.0279x+0.0342；β-CTX的計算公式：y=0.0092x-0.0609；P1NP的計算公式：y=0.0296x+0.0616。將測定的大鼠血清各指標的D值帶入上述相應的工作曲線公式，得到各骨代謝指標的濃度。

2.2 體質量 結果(表1)顯示：造模前所有大鼠體質量差異無統(tǒng)計學意義。造模后，與正常組相比，藍光組和模型組大鼠的體質量顯著降低(P<0.01)。光照結束時，藍光1組、藍光2組體質量與模型組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；正常組和模型組大鼠體質量顯著增加，而藍光1組和藍光2組體質量持續(xù)下降。

表1 各組大鼠造模前后及光照結束時體質量對比 n=6；，g

2.2 鈣、磷水平 結果(表2)顯示：模型組血鈣低于正常組，血磷高于正常組(P<0.01)。與模型組相比，藍光組的血鈣水平降低、血磷水平升高(P<0.01)。藍光1組和藍光2組的血鈣、血磷的水平差異無統(tǒng)計學意義。

2.3 骨代謝標志物水平 結果(表2)顯示：模型組ALP、β-CTX、P1NP均高于正常組(P<0.01)。與模型組相比，藍光1組ALP、β-CTX和P1NP下降(P<0.05)，藍光2組ALP、P1NP、β-CTX也均下降(P<0.01)。藍光1組和藍光2組ALP和P1NP水平差異均無統(tǒng)計學意義(P=0.193、P=0.264)，藍光2組β-CTX水平較藍光1組下降(P=0.024)。

表2 各組大鼠鈣、磷水平和骨代謝標志物水平比較 n=6，

2.4 骨密度和骨微結構比較 結果(表3)顯示：與模型組相比，正常組骨密度較高(P<0.01)，藍光1組骨密度無明顯改變(P=0.083)，藍光2組骨密度下降(P=0.023)；藍光1組和藍光2組骨密度差異無統(tǒng)計學意義(P=0.548)。模型組的骨小梁數量少于正常組(P<0.01)；藍光1組和藍光2組骨小梁數量均少于模型組(P<0.01)；藍光1組骨小梁數量少于藍光2組(P<0.01)。模型組骨小梁厚度小于正常組(P<0.01)；藍光1組、藍光2組骨小梁厚度均小于模型組(P<0.01)；藍光1組和藍光2組骨小梁厚度差異無統(tǒng)計學意義(P=0.275)。模型組骨小梁分離度大于正常組(P<0.01)；藍光1組骨小梁分離度大于模型組(P<0.01)；藍光2組骨小梁分離度較藍光1組增加(P<0.01)。結果(圖1)顯示：藍光2組的骨微結構破壞程度大于模型組，模型組的骨微結構破壞程度大于正常組。

表3 各組大鼠骨密度及骨微結構比較 n=6，

圖1 各組大鼠模型的股骨圖對比

3 討 論

體質量指數與骨質疏松強度相關[14]。本研究發(fā)現，在光照期間正常組大鼠體質量平均增加12.50 g，模型組平均增加13.41 g，藍光組平均減少5.39 g，說明藍光干預能降低骨質疏松模型大鼠的體質量，而通過影響體質量促進骨質疏松可能是藍光影響骨密度的原因之一。Yuan等[11]的實驗結果顯示，藍光可抑制骨髓間充質干細胞增殖，促使其凋亡。因此推測藍光影響體質量可能與其抑制骨髓間充質干細胞的增殖進而使其成脂分化受到影響有關，這有待于進一步深入研究。

低鈣和高磷水平能抑制成骨細胞活性、促進破骨細胞活化[15]。本研究中，藍光干預能降低血清鈣、增加血清磷的水平，且這種改變在干預14 d時已經發(fā)生變化，14 d和21 d的變化差異無統(tǒng)計學意義，說明藍光干預影響鈣磷代謝水平發(fā)生在骨質疏松早期，骨代謝失衡到一定程度后發(fā)生骨代償性補償，即通過動員骨骼中的鈣磷來維持血液中的鈣磷代謝平衡，這與后期的骨密度下降現象相符合，推測藍光對骨密度的影響和鈣磷代謝水平失衡有一定的相關性。

ALP和P1NP是臨床和基礎研究中常用的反映成骨活性的骨標志物，β-CTX是常見的破骨細胞活性標志物[16]。本研究中，ALP、β-CTX和P1NP均在藍光干預14 d發(fā)生變化，且藍光干預早期對ALP和P1NP產生的影響比β-CTX顯著，提示藍光干預抑制成骨的作用要早于抑制破骨的作用。藍光干預早期骨小梁數量、骨小梁厚度和骨小梁分離度發(fā)生變化，而骨密度的變化晚于骨小梁的變化，這與臨床上骨質疏松人群在早期先發(fā)生骨小梁減少和骨分離度增加的現象[17]相符合。本研究中藍光干預降低ALP和P1NP水平與Yuan等[11]的體外實驗中藍光抑制成骨分化相一致，但降低β-CTX與Notomi等[12]的實驗中藍光刺激可提升RAW264.7細胞抗酒石酸鹽酸性磷酸酶活性及促進破骨分化相反。因此，后期需對藍光降低β-CTX的作用機制進行進一步探索。

藍光對正常大鼠與低轉換型骨質疏松模型作用是否相同還需進一步探索。460 nm是目前LED燈常用的波長，本研究采用的光照強度根據細胞實驗結果換算到動物得來，而現實生活中暴露在多大強度、多少時長的藍光環(huán)境才會影響機體的骨代謝還有待于進一步觀察。

綜上所述，本研究初步探索了藍光對維甲酸誘導骨質疏松模型的影響，發(fā)現藍光能在早期降低骨質疏松大鼠的體質量、引起鈣磷代謝失衡、降低骨密度、破壞骨微結構，加速骨質疏松進展，提示骨質疏松患者在日常生活中須減少藍光環(huán)境暴露。