徐帥帥， 李 碩， 李 浩， 葉龍?jiān)疲?劉 亮， 虞先濬， 徐華祥

復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院胰腺外科，上海市胰腺腫瘤研究所，上海 200032

胰腺癌是惡性度極高的消化道腫瘤之一。根治性手術(shù)是胰腺癌患者獲得長(zhǎng)期生存的唯一手段，但其術(shù)后5年生存率僅20%，其中術(shù)后高復(fù)發(fā)率是胰腺癌患者術(shù)后預(yù)后不良的主要因素[1-2]。因此，探尋新的指標(biāo)監(jiān)測(cè)胰腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)狀態(tài)顯得尤為重要。單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(monocarboxylate transporter，MCT)屬于溶質(zhì)運(yùn)載蛋白家族(solute carrier family，SLC)16A 亞家族的成員。MCTs主要通過調(diào)控糖酵解過程中產(chǎn)生的乳酸、丙酮酸、丁酸、脂肪酸等一元羧酸類物質(zhì)在細(xì)胞膜上的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，實(shí)現(xiàn)提高腫瘤細(xì)胞的糖酵解能力和維持腫瘤周圍的酸性微環(huán)境的功能[3]。MCT4在胃癌、前列腺癌和宮頸癌中均有顯著表達(dá)，并參與了腫瘤惡性進(jìn)展的過程[4]。本研究通過分析MCT4在胰腺癌組織中的表達(dá)分布與水平，以及其與臨床病理特征之間的關(guān)系，為胰腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)高風(fēng)險(xiǎn)人群的篩選和術(shù)后治療策略的制定提供潛在方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性收集2010年2月至2014年6月在復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院胰腺外科(上海市胰腺腫瘤研究所)接受根治性切除的441例胰腺癌患者的臨床資料，依據(jù)以下排除標(biāo)準(zhǔn)納入379例。(1)臨床病理資料和隨訪資料不全(n=9)；(2)術(shù)前接受抗腫瘤治療 (n=41)；(3)既往其他惡性腫瘤史 (n=12)。本研究所的數(shù)據(jù)庫登記了所有入組患者的臨床病理特征、治療方式及隨訪數(shù)據(jù)。本研究經(jīng)由復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者簽署了知情同意書。

1.2 患者隨訪 依據(jù)本研究所胰腺癌術(shù)后隨訪的標(biāo)準(zhǔn)流程，每例患者在術(shù)后均接受常規(guī)隨訪至腫瘤復(fù)發(fā)或死亡[5]。患者術(shù)后至少每2個(gè)月來院例行體格檢查和實(shí)驗(yàn)室檢查。如果懷疑存在腫瘤復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，就建議患者行影像學(xué)檢查(上腹部增強(qiáng)計(jì)算機(jī)輔助影像、上腹部增強(qiáng)磁共振、骨掃描和正電子計(jì)算輔助影像)。總體生存(overall survival，OS)時(shí)間定義為從患者手術(shù)日至術(shù)后死亡或最后1次隨訪之間的時(shí)間段；無復(fù)發(fā)生存(recurrence-free survival，RFS)時(shí)間定義為從患者手術(shù)日至術(shù)后復(fù)發(fā)或最后1次隨訪之間的時(shí)間段。本組胰腺癌患者術(shù)后的中位生存時(shí)間約為17個(gè)月，術(shù)后最后1次隨訪時(shí)間超過17個(gè)月。

1.3 免疫組化 在由甲醛固定和石蠟包埋的組織切片上，采用二甲苯逐級(jí)脫蠟和梯度乙醇逐級(jí)水化，運(yùn)用檸檬酸進(jìn)行抗原修復(fù)，并采用MCT4抗體(ab244385，1∶100稀釋，Abcam公司)孵育和生物素標(biāo)記的二抗進(jìn)行顯色。應(yīng)用萊卡攝像機(jī)攝取免疫組化染色切片圖片，并用與此攝像機(jī)連接的萊卡DM IRE2顯微鏡(萊卡顯微圖片拍攝系統(tǒng)，英國)，將每個(gè)病例的免疫組化染色切片在200倍鏡下分別選取3個(gè)代表性區(qū)域 (主要由腫瘤實(shí)質(zhì)細(xì)胞組成，避開壞死組織區(qū)域)，判斷組織染色情況。陽性判定標(biāo)準(zhǔn)：>10%的腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)胞質(zhì)或質(zhì)膜褐色染色。免疫組化染色結(jié)果由2名臨床醫(yī)師獨(dú)立綜合判斷；若判定結(jié)果存在分歧，由2名臨床醫(yī)師商定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件錄入數(shù)據(jù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)經(jīng)過正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)后，使用非配對(duì)t檢驗(yàn)(雙側(cè))和卡方檢驗(yàn)驗(yàn)證統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。采用log-rank檢驗(yàn)對(duì)比MCT4陽性表達(dá)與陰性表達(dá)組患者之間的生存差異。將Cox單因素分析中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)納入多因素Cox回歸分析模型，分析OS和RFS時(shí)間的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。檢驗(yàn)水準(zhǔn)(α)為0.05。

2 結(jié) 果

2.1 379例胰腺癌臨床病理特征與預(yù)后情況 379例患者中，男性218例，年齡33～84歲(中位61歲)，222例腫瘤位于胰頭，腫瘤最大徑0.5～11.5 cm (中位4.0 cm)。176例腫瘤存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，141例腫瘤病理分級(jí)為低分化，72例腫瘤存在脈管侵犯，321例腫瘤存在神經(jīng)侵犯，300例患者術(shù)前血清糖類抗原19-9(CA19-9)水平異常升高。截至最后1次隨訪，325例患者復(fù)發(fā)，其中294例死于腫瘤復(fù)發(fā)。中位OS和RFS時(shí)間分別為17.0個(gè)月和9.5個(gè)月；1年和3年OS率分別為61.4%和24.8%，1年和3年RFS率分別為37.1%和13.8%。

2.2 MCT4在胰腺癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系 MCT4主要在胰腺癌細(xì)胞的胞質(zhì)和質(zhì)膜上表達(dá)，在癌細(xì)胞周圍的間質(zhì)細(xì)胞中也有散在表達(dá)，在正常胰腺組織中為陰性表達(dá)(圖1)。MCT4在208例患者的胰腺癌組織中呈現(xiàn)陽性染色。結(jié)果(表1)表明，MCT4陽性表達(dá)患者的腫瘤最大徑更大(P=0.004)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率更高(P=0.005)、TNM分期更高(P=0.011)。

圖1 MCT4在胰腺癌及正常胰腺組織中的表達(dá)

表1 胰腺癌組織中MCT4表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 n(%)

2.3 生存時(shí)間的影響因素 單因素Cox回歸分析(表2，表3)表明，CA19-9水平升高、較大的腫瘤最大徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、高TNM分期和MCT4陽性表達(dá)是胰腺癌患者OS和RFS的危險(xiǎn)因子(P<0.05)。MCT4陽性患者的中位OS (12.4個(gè)月)和RFS(7.3個(gè)月)時(shí)間顯著短于MCT4陰性患者(21.3個(gè)月，P<0.001；11.4個(gè)月,P<0.001)。多因素Cox回歸分析(表2，表3)顯示，MCT4陽性表達(dá)是胰腺癌患者OS和RFS的獨(dú)立危險(xiǎn)因子之一(P<0.001)。

表2 胰腺癌患者OS時(shí)間的影響因素分析

表3 胰腺癌患者RFS時(shí)間的影響因素分析

3 討 論

代謝重編程是腫瘤細(xì)胞的重要生物學(xué)特征之一。腫瘤細(xì)胞通過代謝重編程方式提高糖酵解代謝的能力并分泌大量的乳酸。MCTs參與各種單羧酸物質(zhì)在細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)，包括乳酸、丙酮酸和酮。腫瘤細(xì)胞通過MCTs將細(xì)胞內(nèi)的大量乳酸跨膜轉(zhuǎn)移至細(xì)胞外，從而避免細(xì)胞內(nèi)酸化導(dǎo)致的凋亡[6]。MCTs家族共包括14個(gè)成員，其中MCT1～4主要參與乳酸的轉(zhuǎn)運(yùn)[7]。MCT4主要在糖酵解代謝中通過pH梯度參與乳酸的跨膜轉(zhuǎn)移[4]。本研究發(fā)現(xiàn)，MCT4在胰腺癌細(xì)胞上顯著異常表達(dá)，且與腫瘤最大徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期相關(guān)，是胰腺癌患者術(shù)后OS和PFS的獨(dú)立危險(xiǎn)因子之一。

本研究中，MCT4在54.9%(208/379)的胰腺癌患者中呈現(xiàn)異常高表達(dá)，并且明顯高于周圍正常胰腺組織。缺氧是腫瘤細(xì)胞上調(diào)MCT4表達(dá)的主要機(jī)制，而胰腺癌是典型的乏氧性惡性腫瘤[8]，并且惡性程度隨著腫瘤最大徑的增加而加劇。本研究結(jié)果支持這一結(jié)論。既往研究證實(shí)，在多種惡性腫瘤中，MCT4異常表達(dá)后參與糖酵解代謝。例如，在肝癌細(xì)胞中，下調(diào)MCT4表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞的糖酵解代謝[9]。MCT4在存在糖酵解代謝負(fù)荷的胰腺癌(常較大或有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)中更易異常表達(dá)。因此，MCT4可能是一些惡性腫瘤糖酵解代謝的特征指標(biāo)之一。此外，MCT4異常表達(dá)還可通過導(dǎo)致癌細(xì)胞周圍酸性環(huán)境和誘導(dǎo)促炎分子釋放，參與形成促癌轉(zhuǎn)移的腫瘤微環(huán)境[10]。

綜上所述，MCT4異常表達(dá)可預(yù)測(cè)乳腺癌、肺癌和食管癌等多種惡性腫瘤患者的不良預(yù)后。本研究證實(shí)，MCT4異常表達(dá)的胰腺癌患者根治性切除術(shù)后復(fù)發(fā)時(shí)間和生存時(shí)間均較短。在肺癌細(xì)胞中，靶向MCT4的抑制劑可顯著下調(diào)乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)和糖酵解代謝水平，阻止細(xì)胞增殖與侵襲轉(zhuǎn)移[11]。同樣，MCT4表達(dá)的調(diào)控可促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移[12]。因此，MCT4可作為監(jiān)測(cè)胰腺癌患者術(shù)后預(yù)后的指標(biāo)，同時(shí)可作為潛在的治療靶點(diǎn)，但還需要進(jìn)一步證實(shí)。