陳錦富 朱天飛 常崇斐 耿倚云 熊建義 王大平** 王滿宜 朱偉民**

（1.深圳大學第一附屬醫(yī)院（深圳市第二人民醫(yī)院）運動醫(yī)學科，廣東深圳 518035；2.廣東省運動醫(yī)學工程研究中心，廣東深圳 518035）

凍結(jié)肩是肩關(guān)節(jié)的一種進行性疾病，以疼痛和活動范圍受限為特征。其中最顯著的臨床特征是肩關(guān)節(jié)在各個方向的主動和被動運動受限[1-3]。引起這些臨床癥狀的主要原因是肩關(guān)節(jié)囊的纖維化改變及炎癥反應，但目前對其病理改變的研究較少，也沒有一種統(tǒng)一有效的治療方案。為了解凍結(jié)肩的臨床癥狀，有必要對其病理改變進行進一步研究。

轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）是一種多功能細胞因子，已被證明導致纖維化，可以促進細胞外基質(zhì)的形成[4-7]。成纖維細胞合成的細胞外基質(zhì)蛋白特異性表面膜受體[8-10]的高表達可引起肩關(guān)節(jié)攣縮、粘連，是凍結(jié)肩的主要發(fā)病機制。有研究發(fā)現(xiàn)在原發(fā)性及繼發(fā)性凍結(jié)肩患者的肩關(guān)節(jié)囊中TGF-β 及其受體的表達增加，表明TGF-β也可引起關(guān)節(jié)囊纖維化，并且可能在凍結(jié)肩的起源和發(fā)展中有重要作用[11]?；谶@些研究發(fā)現(xiàn)，我們向SD 大鼠的肩關(guān)節(jié)腔注射TGF-β1 過表達的腺病毒成功構(gòu)建大鼠凍結(jié)肩模型，并可用于凍結(jié)肩的動物實驗研究。除此之外，凍結(jié)肩往往存在炎癥反應，已有研究報道，炎癥介質(zhì)在凍結(jié)肩的炎癥和膠原分解代謝過程中發(fā)揮重要作用[12-14]。近年來的研究表明，關(guān)節(jié)囊炎性細胞因子的過度表達在凍結(jié)肩的發(fā)病過程中起著重要作用[15-17]。研究表明，PPAR-γ 激動劑可抑制TGF-β1所引起的細胞外基質(zhì)表達上調(diào)（包括Ⅰ型膠原形成），從而發(fā)揮其抗纖維化作用。還有研究表明，PPAR-γ 激動劑對預防包括皮膚、腎臟和角膜在內(nèi)的各種器官纖維化有效[18-20]。本研究將會使用羅格列酮作為治療大鼠凍結(jié)肩模型藥物，這是一種高度活躍的PPAR-γ激動劑，常被用作治療糖尿病的胰島素增敏劑。近年來發(fā)現(xiàn)羅格列酮在炎癥反應、免疫調(diào)節(jié)和纖維化抑制中發(fā)揮重要作用[20,21]。因為目前沒有羅格列酮的實驗試劑，所以，本研究采用另一種PPAR-γ激動劑——CDDO-IM 進行細胞實驗。本研究目的是探究PPAR-γ 激動劑的抗纖維化和抗炎作用，以及羅格列酮在大鼠凍結(jié)肩模型中的治療效果，為臨床治療凍結(jié)肩提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗細胞：人皮膚成纖維細胞（human skin fibroblasts,HSF）

實驗動物：SD（Sprague Dawley）大鼠18 只，20 月齡，體重約450 g，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供。實驗內(nèi)容、方法及小動物福利等均已獲得深圳市第二人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核批準。

實驗試劑：DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）均購自美國Invitrogen公司，TGF-β1過表達的腺病毒（滴度為1×1011PFU/ml）購自上海漢恒生物有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 水溶性甲臢化合物（MTS）法檢測細胞增殖：消化細胞后吹打散細胞，計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為1×105個/ml，分到96孔板，每孔100 μl，即每孔細胞為1×104個。待細胞貼壁后，收集各個時間點的細胞（0 h、24 h、48 h、72 h）加入cellTiter96AQ單溶液細胞增殖檢測試劑（Promega，Cat.No.G3582），比例為1/10。即100 μl 培養(yǎng)液加入10 μl 檢測液。在孵育4 h 后，酶標儀讀板，MTS檢測讀取OD490數(shù)據(jù)。

1.2.2 細胞遷移實驗（劃痕檢測）：先用記號筆在6孔板背后，用直尺比著，均勻得劃橫線，大約每隔0.5～1.0 cm一道，橫穿過孔。每孔至少穿過3條線。于超凈工作臺內(nèi)無菌操作下在6 孔板中的每孔加入濃度為10 μg/ml 的纖維連接蛋白（fibronectin,FN）50 μl，置于4℃冰箱過夜，次日加含10%FBS 的RPMI-1640 培養(yǎng)液于紫外線下滅菌2 h備用。將處于對數(shù)生長期的濃度約為1×106/ml細胞，制成懸液均勻接種于6孔培養(yǎng)板中，置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察細胞長成單層后予以換液，用絲裂霉素處理1 h，抑制細胞的分裂。用10 μl無菌微量移液槍頭在細胞板上劃痕，用槍頭比著直尺，盡量垂直于背后的橫線劃痕，保持槍頭垂直。PBS液沖洗2～3次以去除被刮下的細胞，加入無血清培養(yǎng)基。對照組用無血清RPMI-1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)，實驗組分別用含藥的無血清RPMI-1640培養(yǎng)基進行干預。置入37℃5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，分別于劃痕后0、6、12、24 h取樣，拍照。在倒置顯微鏡下觀察劃痕愈合情況。Image Pro-Plus 6.0 軟件測量各組細胞相同時間點任意8 個部位劃痕寬度，計算細胞遷移率=（0 h-其他時間點）/0 h，以反映各組HSF運動遷移能力，數(shù)據(jù)統(tǒng)計。

1.2.3 大鼠凍結(jié)肩模型的制備:動物實驗分為正常組、TGF-β1誘導模型組（肩關(guān)節(jié)腔注射Ad-TGF-β1）、羅格列酮治療組（肩關(guān)節(jié)腔注射Ad-TGF-β1 后使用羅格列酮灌胃治療），每組6 只。取20 月齡的SD 大鼠12 只制備凍結(jié)肩模型。大鼠先腹腔注射水合氯醛（400 mg/kg）進行麻醉，肩關(guān)節(jié)剃毛，標記進針點，消毒。無菌條件下，用1 ml注射器抽取TGF-β1過表達的腺病毒（滴度為1×1011PFU/ml）30 μl，稀釋至100 μl，在進針點上向肩關(guān)節(jié)腔注射。注射病毒后繼續(xù)飼養(yǎng)2周，其中一半大鼠用羅格列酮（2 mg/kg/d）灌胃飼養(yǎng)2周，作為羅格列酮治療組。

1.2.4 組織學觀察：動物模型制備完成后處死動物，取肩關(guān)節(jié)囊組織，4%多聚甲醛固定，流水沖洗過夜，去除多余的固定液，再進行脫水、浸蠟，常規(guī)方法包埋后，切片厚度7 μm并轉(zhuǎn)移到45°C水浴鍋中。用載玻片撈起切片，37°C 過夜烤干。組織切片標本制作完成后進行HE染色及免疫組織化學檢測，觀察大鼠肩關(guān)節(jié)囊組織的變化。

1.3 統(tǒng)計學方法

所有實驗至少重復3 次。采用SPSS 17.0 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示。不同組間對比用one-way ANOVA。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 PPAR-γ激動劑抑制TGF-β1 誘導的HSF增殖

利用cellTiter96AQ 單溶液細胞增殖檢測試劑（Promega，Cat.No.G3582）檢測HSF 組、TGF-β1 組（加入TGF-β1共培養(yǎng)）、CDDO-IM 組（加入CDDO-IM 共培養(yǎng)），TGF-β1+CDDO-IM 組（加入10 ng/ml TGF-β1和20 nmol/L CDDO-IM 共培養(yǎng)）不同時間點的細胞（0 h、24 h、48 h、72 h）增殖情況。培養(yǎng)至72 h，TGF-β 1組的增殖率為83.6%，TGF-β1+CDDO-IM組增殖率為19.3%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），可見TGF-β促進HSF的增殖；CDDO-IM（PPAR-γ激動劑）能夠抑制TGF-β1的促增殖作用（圖1）。

2.2 PPAR-γ激動劑抑制TGF-β1 誘導的HSF遷移

利用劃痕實驗檢測各組不同時間點的細胞（0 h、6 h、12 h、24 h）增殖情況，計算各組細胞遷移率并進行比較。在24 h，TGF-β1組的遷移率為84.9%，TGFβ1+CDDO-IM組遷移率為44.1%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)果顯示TGF-β1 促進HSF 的遷移；CDDO-IM抑制TGF-β1對HSF遷移的促進作用（圖2）。

2.3 PPAR-γ 激動劑抑制TGF-β1 誘導的HSF 異常纖維化

利用實時熒光定量qRT-PCR 及蛋白質(zhì)印跡Western blot 檢測細胞外基質(zhì)波形蛋白、α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）、Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白的表達情況。qRT-PCR 結(jié)果顯示TGF-β1 促進HSFⅠ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白的RNA 表達；CDDO-IM 抑制TGF-β誘導的HSFⅠ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白的RNA水平高表達。TGF-β1能夠明顯促進α-SMA、波形蛋白的RNA 表達；CDDO-IM 抑制TGF-β1 誘導的HSF 中α-SMA、波形蛋白的RNA水平高表達（圖3）。

圖1 細胞活性檢測

Western blot 結(jié)果顯示，TGF-β1能夠明顯促進Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白、波形蛋白、α-SMA 的蛋白表達；CDDO-IM 抑制TGF-β1 誘導的HSF 中Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白、波形蛋白、α-SMA 蛋白水平高表達（圖4）。

2.4 PPAR-γ 激動劑緩解TGF-β1 誘導的大鼠凍結(jié)肩的肩關(guān)節(jié)僵硬

在麻醉狀態(tài)下，應用大鼠肩關(guān)節(jié)的扭矩測試裝置（圖5）被動活動大鼠肩關(guān)節(jié)進行外旋和內(nèi)旋，外旋相同角度時，TGF-β1誘導模型組比正常組需要更大的力矩，而羅格列酮治療組需要的力矩最小，最大外旋角度約45°；而內(nèi)旋20°之后也有同樣趨勢，最大內(nèi)旋角度約45°；說明PPAR-γ 激動劑緩解TGF-β1 誘導的大鼠凍結(jié)肩的肩關(guān)節(jié)僵硬（圖6）。

2.5 PPAR-γ激動劑抑制大鼠凍結(jié)肩的炎癥反應

在麻醉狀態(tài)下，用1 ml注射器收集各組大鼠肩關(guān)節(jié)液體至少0.3 ml 進行ELISA 試驗檢測環(huán)氧化酶-1（cyclooxygenase-1,COX-1）、白細胞介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor,TNF-α）的表達情況。在TGF-β1 誘導模型組中，COX-1、IL-1β、TNF-α 的平均濃度分別為93.38 U/L、56.21 pg/ml、92.46 pg/ml；在羅格列酮治療組中，COX-1、IL-1β、TNF-α的平均濃度分別為47.95 U/L、14.75 pg/ml、41.15 pg/ml，差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)果顯示TGF-β1 過表達能引起大鼠肩關(guān)節(jié)液中炎癥因子升高，而羅格列酮治療能夠減少炎癥因子產(chǎn)生（圖7）。

圖2 細胞遷移檢測

2.6 PPAR-γ 激動劑抑制大鼠凍結(jié)肩的成纖維細胞異常纖維化

應用HE染色、免疫組織化學法對大鼠肩關(guān)節(jié)囊組織α-SMA、波形蛋白、Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白進行觀察。在正常組中，纖維細胞未見增生，纖維結(jié)構(gòu)排列較整齊，未見α-SMA、波形蛋白表達；TGF-β1誘導模型組可見纖維細胞大量增生，新生血管形成，炎癥細胞增加，纖維結(jié)構(gòu)紊亂，α-SMA、波形蛋白、Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白較正常組表達增加；羅格列酮治療組中纖維結(jié)構(gòu)較TGF-β1誘導模型組排列整齊，炎癥反應減弱，α-SMA、波形蛋白、Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白表達減少。TGF-β1過表達誘導大鼠肩關(guān)節(jié)囊炎癥形成，基質(zhì)蛋白增加，纖維組織排列紊亂，成纖維細胞增生；而羅格列酮治療將抑制凍結(jié)肩的炎癥形成，減少基質(zhì)蛋白生成，重塑纖維組織結(jié)構(gòu)（圖8）。

3 討論

肩關(guān)節(jié)囊的炎癥和纖維化是凍結(jié)肩疼痛和活動受限的主要原因，這已被普遍接受。盡管有大量相關(guān)的研究，但導致凍結(jié)肩發(fā)展的病因和病理機制仍知之甚少，對最佳治療方法也沒有一致意見，因此了解肩關(guān)節(jié)凍結(jié)過程中關(guān)節(jié)囊的病理變化對治療有重要意義。目前認為凍結(jié)肩的病理變化是肩關(guān)節(jié)囊組織纖維化改變、攣縮、增厚，并且存在非感染性炎癥反應。肩關(guān)節(jié)囊組織攣縮是凍結(jié)肩的主要病理改變，其基質(zhì)主要由致密的Ⅲ型膠原纖維組成，富含成纖維細胞和肌成纖維細胞，手術(shù)解除肩關(guān)節(jié)囊攣縮可減輕疼痛，改善肩關(guān)節(jié)運動[22-24]。同時，我們認為凍結(jié)肩的發(fā)生與纖維化和炎癥密切相關(guān)。凍結(jié)肩的形成包括一個由纖維化引起的組織硬化的過程，而纖維化是由炎癥引起的。

圖3 qRT-PCR檢測Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白、波形蛋白、α-SMA基因表達情況，TGF-β1組和TGF-β1+CDDO-IM組比較，△P＜0.05

圖4 Western blot檢測Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白、波形蛋白、α-SMA蛋白表達情況

近年來的研究表明，細胞因子和炎癥因子在肩周炎的發(fā)病機制中起著重要作用。細胞因子調(diào)節(jié)結(jié)締組織的成纖維細胞生長和功能，也可以調(diào)節(jié)成纖維細胞合成膠原蛋白。凍結(jié)肩的細胞外基質(zhì)中Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白異常增加，主要由成纖維細胞和肌成纖維細胞合成，這表明這種情況可能受到細胞因子的異常調(diào)節(jié)。TGF-β是強有力的促纖維化和促炎癥反應的細胞因子，在各種組織的纖維化中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在本實驗中，利用TGF-β誘導HSF增殖，除此之外，通過qRT-PCR 及Western blot 實驗證明TGF-β可以引起細胞外基質(zhì)中Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白過度表達。同時，成纖維化的標志蛋白α-SMA，波形蛋白的RNA及蛋白水平比正常組升高，這表明TGFβ能夠促進HSF增殖的同時引起細胞纖維化。因此，利用TGF-β1過表達腺病毒注射在大鼠的肩關(guān)節(jié)中，成功誘導大鼠凍結(jié)肩模型。然后通過檢測大鼠肩關(guān)節(jié)活動度發(fā)現(xiàn)，TGF-β1誘導模型組的肩關(guān)節(jié)活動明顯受限。同時，收集大鼠肩關(guān)節(jié)液進行ELISA 實驗，檢測結(jié)果證明TGF-β1 過表達能引起大鼠肩關(guān)節(jié)液中炎癥因子升高。通過免疫組織化學實驗進一步證明在TGF-β1誘導模型組中纖維細胞大量增生，纖維結(jié)構(gòu)紊亂，同時新生血管形成，炎癥細胞增加，細胞外基質(zhì)中α-SMA、波形蛋白、Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白較正常組表達增加。

圖5 大鼠肩關(guān)節(jié)的扭矩測試裝置

圖6 被動活動大鼠肩關(guān)節(jié)進行外旋（A）和內(nèi)旋（B）檢測肩關(guān)節(jié)活動度

圖7 ELISA檢測COX-1、IL-1β、TNF-α的表達情況

圖8 大鼠肩關(guān)節(jié)囊HE染色及免疫組織化學檢測（×200，標尺：100 μm）

近年來的研究表明，PPAR-γ活化是一種重要的細胞抗纖維化、抗炎機制，在結(jié)締組織細胞外基質(zhì)的生理和病理重建過程中的負調(diào)控發(fā)揮重要作用[25,26]。因此，證實PPAR-γ激動劑能否治療慢性纖維化疾病成為研究熱點[27-29]。目前，有相關(guān)研究表明PPAR-γ激動劑是抗角膜纖維化的有效藥物[30]。然而，PPARγ 激動劑對由TGF-β 過表達引起的凍結(jié)肩纖維化是否有治療尚未有相關(guān)研究報道。本研究表明，PPAR-γ激動劑可抑制HSF和大鼠肩關(guān)節(jié)囊纖維化，對以纖維化為主要特征的凍結(jié)肩有積極的治療作用。本研究結(jié)果表明，凍結(jié)肩的關(guān)節(jié)腔中存在炎癥反應，并伴有纖維化。PPAR-γ激動劑顯著抑制纖維細胞增生、炎癥因子釋放及纖維化相關(guān)蛋白的表達，說明PPAR-γ 激動劑抑制了炎癥和纖維化過程。在動物實驗中，2 周的藥物治療也增加了關(guān)節(jié)活動度，與TGF-β1誘導模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義。這說明PPAR-γ 激動劑可延緩或逆轉(zhuǎn)肩關(guān)節(jié)凍結(jié)引起的關(guān)節(jié)活動受限。因此，PPAR-γ激動劑可能是治療凍結(jié)肩的一個有希望的基因靶點，但其作用機制尚需進一步研究。與目前使用的治療方法相比，PPAR-γ激動劑治療的非細胞毒性和抗增殖作用（細胞增殖實驗及劃痕實驗顯示）也是一個額外的優(yōu)勢。除此之外，與捆綁固定、冷凍刺激等傳統(tǒng)的建模方法，我們的建模方法更方便易行。但是，本研究的實驗動物樣本量較少，活動度測量時的固定方法仍需改善。從長遠來看，將假設PPAR-γ激動劑是治療凍結(jié)肩的靶點，這需要更多的研究證明其治療機制，如Smad 通路，這是凍結(jié)肩的另一個調(diào)節(jié)通路。我們還將改進基因傳遞方法，使其更安全、更有效?？偟膩碚f，通過細胞實驗證實了TGF-β1能夠引起人纖維細胞異常纖維化，并且利用大鼠凍結(jié)肩模型進一步探究凍結(jié)肩的病理改變主要是纖維細胞異常增生，炎癥細胞浸潤，纖維結(jié)構(gòu)紊亂，而PPAR-γ 激動劑可以緩解大鼠凍結(jié)肩關(guān)節(jié)僵硬，減弱炎癥反應，抑制異常纖維化。