王 妍，張超林，王 娟，鄧 躍，蘇曉蕊，譚菲菲 ，田克恭,

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450046；2.國(guó)家獸用藥品工程技術(shù)研究中心，河南 洛陽(yáng) 471003）

0 引言

【研究意義】中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（Chinese hamsters Ovary, CHO）細(xì)胞由于表達(dá)的目的蛋白具有正確的翻譯后修飾，與天然產(chǎn)物的生物學(xué)特性十分相近[1]，常用作研究重組蛋白質(zhì)的首選宿主細(xì)胞[2]。CHO 瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)中目的基因以質(zhì)粒DNA 的形式存在于細(xì)胞中[3]，具有時(shí)間短、高通量、操作簡(jiǎn)單、可放大等優(yōu)勢(shì)，能夠在短時(shí)間內(nèi)獲得不同的候選重組蛋白，為藥物開發(fā)或疫苗研究節(jié)省大量時(shí)間和成本[4]。許多因素會(huì)影響CHO 系統(tǒng)的表達(dá)水平，例如表達(dá)載體和宿主細(xì)胞的選擇，DNA 質(zhì)量和轉(zhuǎn)染方法以及培養(yǎng)工藝優(yōu)化等[5]，蛋白表達(dá)量的高低主要取決于基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平，轉(zhuǎn)錄調(diào)控主要依賴于順式作用元件和反式作用因子，分別由表達(dá)載體和宿主細(xì)胞提供，表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)及相關(guān)元件組成是影響外源基因轉(zhuǎn)錄的重要因素。因此，表達(dá)載體的選擇對(duì)ExpiCHO表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源蛋白至關(guān)重要[6]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】基本的真核表達(dá)組件包括啟動(dòng)子元件、增強(qiáng)子元件、加poly（A）信號(hào)以及用于復(fù)制和選擇的元件。不同的真核表達(dá)載體由不同的啟動(dòng)子進(jìn)行驅(qū)動(dòng)，啟動(dòng)子在整合和轉(zhuǎn)錄信號(hào)加工過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[7]。高效的啟動(dòng)子是CHO 細(xì)胞表達(dá)重組蛋白質(zhì)所必需的[8]。研究表明，CHO 細(xì)胞常用的啟動(dòng)子有病毒啟動(dòng)子、異源啟動(dòng)子、內(nèi)源性和誘導(dǎo)性啟動(dòng)子等[9]，如常用的人巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子（Cytomegalovirus promoter, CMV 啟動(dòng)子）是公認(rèn)的最強(qiáng)真核啟動(dòng)子，猿猴病毒40（Simian virus 40, SV40）啟動(dòng)子具有組織/細(xì)胞的選擇特異性[10-13]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】表達(dá)載體的選擇成為制約CHO 細(xì)胞瞬時(shí)生產(chǎn)蛋白的重要因素之一，篩選出表達(dá)量較高的載體，能為篩選有效的重組蛋白節(jié)省大量的時(shí)間。目前已有研究單獨(dú)CMV和SV40 啟動(dòng)子，但未研究表達(dá)載體同時(shí)含有CMV和SV40 啟動(dòng)子的表達(dá)量。本研究使用的載體均含有CMV 和SV40 啟動(dòng)子，通過(guò)對(duì)比蛋白表達(dá)量可篩選出合適的表達(dá)載體?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究以常用的標(biāo)記蛋白GFP 作為目的基因，通過(guò)構(gòu)建不同載體的GFP重組表達(dá)質(zhì)粒，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染ExpiCHOS 細(xì)胞，通過(guò)熒光強(qiáng)度及細(xì)胞裂解產(chǎn)物的SDS-PAGE鑒定，篩選出表達(dá)量較高的表達(dá)載體，為重組蛋白瞬時(shí)表達(dá)載體的選擇提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種、質(zhì)粒及細(xì)胞

TOP10 感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；真核表達(dá)載體pCHO1.0、pCDNA3.1、pCDNA3.4、pCIneo、pCMVHA、pAcGFP 由國(guó)家獸用藥品工程技術(shù)研究中心保存，ExpiCHO-S 細(xì)胞由國(guó)家獸用藥品工程技術(shù)研究中心保存。

1.2 主要試劑

快速質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；Endo-free Plasmid Midi Kit、Gel Extraction Kit 均購(gòu)自O(shè)MEGA 公司；T4 DNA 連接酶、NheI、XbaI、XhoI、HindIII、EcoRI、AvrⅡ和Bstz17I 限 制 性 內(nèi)切酶、ExpiCHOTMExpression Medium、ExpiFectamineTMCHO 試 劑、OptiPROTMSFM、ExpiCHOTM增 強(qiáng) 劑、ExpiCHOTM輔料、細(xì)胞裂解液、GFP 單克隆抗體、HRP 標(biāo)記羊抗鼠的抗體均購(gòu)自Thermo 公司；His Trap FF 親和層析柱購(gòu)自GE 公司。

1.3 GFP 片段的擴(kuò)增

根據(jù) GenBank 中登錄的GFP基因全長(zhǎng)序列（LN515608.1），利用DNAStar5.0 針對(duì)不同載體設(shè)計(jì)擴(kuò)增GFP 基因的引物，如表1 所示。以pAcGFP質(zhì)粒為模板擴(kuò)增GFP 片段，片段大小約為735 bp。PCR 反應(yīng)程序：95 ℃ 3 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，共30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

1.4 GFP 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將GFP片段和表達(dá)載體分別用對(duì)應(yīng)的限制性內(nèi)切酶雙酶切，根據(jù)目的片段和載體大?。ū?），回收相應(yīng)的目的基因片段和載體片段，T4 DNA 連接酶于22 ℃連接1 h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOP10 感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)應(yīng)抗性LB 平板篩選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒送金唯智生物科技有限公司測(cè)序。將測(cè)序正確質(zhì)粒的菌液擴(kuò)大培養(yǎng)后用Endo-free Plasmid Midi Kit 提取質(zhì)粒，測(cè)定濃度，以備轉(zhuǎn)染使用。

1.5 ExpiCHO-S 細(xì)胞表達(dá)GFP 蛋白

取出凍存的ExpiCHO-S 細(xì)胞，37 ℃水浴復(fù)蘇后培養(yǎng)，當(dāng)密度達(dá)到每毫升4×106～6×106個(gè)活細(xì)胞時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代，細(xì)胞至少傳兩代后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前細(xì)胞計(jì)數(shù)，用ExpiCHOTMExpression Medium 將細(xì)胞稀釋至每毫升6×106個(gè)活細(xì)胞，轉(zhuǎn)染所用體積為25 mL。

按照ExpiFectamineTMCHO 轉(zhuǎn)染試劑的操作步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染，簡(jiǎn)要操作如下：將20 μg 重組質(zhì)粒加入1 mL OptiPROTMSFM 中進(jìn)行稀釋，取80 μL ExpiFectamineTMCHO 試劑加入1 mL OptiPROTMSFM 中進(jìn)行稀釋，將稀釋的ExpiFectamineTMCHO 試劑加入稀釋的重組質(zhì)粒中，混勻后室溫孵育5 min，然后將溶液慢慢轉(zhuǎn)移至稀釋好的細(xì)胞中，添加過(guò)程中輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶，置 于37 ℃ 8% CO2120 r·min-1軌 道 搖 床 培 養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后18～22 h 加入150 μL ExpiCHOTM增強(qiáng)劑和6 mL ExpiCHOTM輔料。

表1 不同載體的酶切位點(diǎn)及引物序列Table 1 Digestion sites and primer sequences on different vectors

表2 不同載體片段大小Table 2 Fragment sizes of different vectors

轉(zhuǎn)染后4 d，無(wú)菌打開培養(yǎng)瓶蓋子，移液槍吸取200 μL 細(xì)胞培養(yǎng)物，混勻后取50 μL 進(jìn)行計(jì)數(shù)。根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果在細(xì)胞計(jì)數(shù)板中加入相同數(shù)量的細(xì)胞，在熒光顯微鏡下觀察含熒光的細(xì)胞數(shù)量及熒光強(qiáng)弱，使用ImageJ 軟件計(jì)數(shù)相同區(qū)域的熒光細(xì)胞數(shù)目。

1.6 GFP 蛋白的純化

當(dāng)培養(yǎng)至第7 d，細(xì)胞活率降為80%左右時(shí)，將細(xì)胞培養(yǎng)物全部轉(zhuǎn)移至50 mL 離心管中，4 ℃ 5 000 r·min-1離心20 min，收獲細(xì)胞培養(yǎng)物沉淀。取等體積的沉淀，加入相同體積的裂解液，冰上孵育20 min，4 ℃ 5 000 r·min-1離心20 min，收獲裂解上清，裂解上清進(jìn)行SDS-PAGE。裂解上清中加入9 倍體積的 BufferA 進(jìn)行稀釋，0.45 μm 濾器過(guò)濾，按照His Trap FF 親和層析柱使用說(shuō)明書進(jìn)行純化，純化后蛋白洗脫體積均為每管1 mL，使用GFP 單抗對(duì)相同體積的純化產(chǎn)物進(jìn)行Western Blot 分析。將pCMVHAGFP 重組質(zhì)粒表達(dá)后純化到的蛋白作為對(duì)照，使用ImageJ 軟件分析其他4 個(gè)純化后的GFP 蛋白與對(duì)照的灰度比值。

2 結(jié)果與分析

2.1 GFP 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將擴(kuò)增出的GFP片段和表達(dá)載體分別用對(duì)應(yīng)的內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，回收GFP片段與載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化后提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果重組質(zhì)粒均可切出約735 bp 的片段及大小分別為12 988、5 333、6 010、5 747、3 782 bp 的載體片段（圖1），與預(yù)期結(jié)果符合，測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步表明GFP基因序列全部正確，未發(fā)生突變或移碼，表明不同載體的GFP 重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 不同載體構(gòu)建GFP 重組質(zhì)粒雙酶切結(jié)果Fig.1 Restriction map of GFP recombinant plasmids carried by different vectors

2.2 GFP 蛋白的表達(dá)

用Endo-free Plasmid Midi Kit 提取5 種重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染ExpiCHO-S 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后4 d 收取細(xì)胞培養(yǎng)物，在熒光顯微鏡下均可觀察到特異的綠色熒光，如圖2所示，pCDNA3.1-GFP、pCDNA3.4-GFP 載體表達(dá)的熒光數(shù)量最多，pCIneo-GFP 載體表達(dá)的熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，pCMVHA 載體表達(dá)的熒光數(shù)量最少，熒光強(qiáng)度最弱。使用ImageJ 軟件計(jì)數(shù)相同區(qū)域的熒光細(xì)胞數(shù)目，結(jié)果如表3 所示，pCDNA3.1-GFP、pCDNA3.4-GFP 載體表達(dá)的熒光細(xì)胞數(shù)量較多，pCMVHA 載體表達(dá)的熒光細(xì)胞數(shù)量最少。表明這5 種表達(dá)載體都能夠在CHO 細(xì)胞中正常表達(dá)GFP 蛋白，但是表達(dá)量有差異。

圖2 不同載體表達(dá)GFP 蛋白的熒光反應(yīng)Fig.2 Fluorescence of GFP expressed by different vectors

表3 不同載體表達(dá)GFP 蛋白的熒光細(xì)胞數(shù)Table 3 Number of fluorescent cells expressing GFP by different vectors

2.3 GFP 蛋白的SDS-PAGE 及Western blot 鑒定

細(xì)胞活率降至80%左右時(shí)收獲細(xì)胞培養(yǎng)物，離心后將細(xì)胞沉淀進(jìn)行裂解，細(xì)胞裂解上清進(jìn)行SDSPAGE 鑒定，結(jié)果如圖3 所示。與ExpiCHO 細(xì)胞裂解上清相比，pCDNA3.1-GFP、pCDNA3.4-GFP、pCINeo-GFP 重組質(zhì)粒表達(dá)的細(xì)胞裂解上清在約30 kD 處均出現(xiàn)清晰的特異條帶，但pCHO-GFP、pCMVHA-GFP重組質(zhì)粒表達(dá)的細(xì)胞裂解上清特異條帶不明顯。SDSPAGE 與熒光結(jié)果基本一致，表明pCDNA3.1-GFP、pCDNA3.4-GFP、pCIneo-GFP 重組質(zhì)粒的蛋白表達(dá)量高于pCHO-GFP、pCMVHA-GFP 重組質(zhì)粒的蛋白表達(dá)量。

圖3 SDS-PAGE 分析轉(zhuǎn)染后4 d GFP 蛋白的表達(dá)Fig.3 SDS-PAGE on GFP expression 4 d after transfection

收獲的細(xì)胞裂解上清利用His Trap FF 親和層析柱純化后，GFP 單抗對(duì)相同體積的純化產(chǎn)物進(jìn)行Western Blot 分析，如圖4 所示，ExpiCHO 細(xì)胞裂解上清無(wú)特異條帶出現(xiàn)，其他5 個(gè)表達(dá)載體在約30 kD處均有特異條帶出現(xiàn)。將pCMVHA-GFP 重組質(zhì)粒表達(dá)后純化到的蛋白作為對(duì)照，使用ImageJ 軟件分析其他4 個(gè)純化后的GFP 蛋白，結(jié)果如表4 所示，pCDNA3.1-GFP、pCDNA3.4-GFP 重組質(zhì)粒表達(dá)純化后的蛋白灰度比值較高，4 個(gè)純化后的GFP 蛋白灰度比值均大于1。表明純化獲得不同載體表達(dá)的GFP蛋白，pCDNA3.1-GFP、pCDNA3.4-GFP 重組質(zhì)粒的蛋白表達(dá)量較高，pCMVHA-GFP 重組質(zhì)粒的蛋白表達(dá)量最低。

圖4 Western Blot 分析純化后的GFP 蛋白Fig.4 Western blot on purified GFP protein

表4 不同載體表達(dá)GFP 蛋白的灰度比值Table 4 Gray ratio of vectors expressing GFP

3 討論

哺乳動(dòng)物細(xì)胞是表達(dá)外源蛋白的最佳宿主細(xì)胞，其具有穩(wěn)定遺傳、接近于天然的正確翻譯后修飾功能、分泌到細(xì)胞外以利于純化等優(yōu)點(diǎn)[14]。CHO細(xì)胞已成為抗體類藥物生產(chǎn)的首選哺乳動(dòng)物細(xì)胞[15]，尋求高效穩(wěn)定的CHO 細(xì)胞表達(dá)載體是重組蛋白穩(wěn)定高水平表達(dá)的重要步驟。

本研究選擇GFP 標(biāo)簽蛋白為目的蛋白，構(gòu)建了5 種不同的真核表達(dá)質(zhì)粒，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CHO 細(xì)胞后鑒定表明pCDNA3.4、pCDNA3.1、pCIneo 載體的表達(dá)量處于較高水平，而pCHO 和pCMVHA 載體的表達(dá)量處于較低水平。pcDNA3.4 是組成型高量表達(dá)載體，相比pCDNA3.1 載體，使用了全長(zhǎng)的人巨細(xì)胞即刻早期增強(qiáng)子/啟動(dòng)子，并且在多克隆位點(diǎn)后插入了一個(gè)土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件（Woodchuck posttranscriptional regulatory element, WPRE），能夠增強(qiáng)目的基因的轉(zhuǎn)錄水平，研究結(jié)果中pCDNA3.4 載體的表達(dá)量略高于pCDNA3.1 載體，也間接證明了改造后的pCDNA3.4 載體可以提高目的基因表達(dá)量。pCIneo 載體使用和pCDNA3.4 載體相同的人巨細(xì)胞即刻早期增強(qiáng)子/啟動(dòng)子，同時(shí)在多克隆位點(diǎn)前面加入了提高mRNA 穩(wěn)定性的嵌合內(nèi)含子序列，表達(dá)水平略低于pCDNA3.4。pCHO 載體為Thermo 公司開發(fā)的用于穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建的載體，在本研究中用于瞬時(shí)表達(dá)未體現(xiàn)出優(yōu)勢(shì)。pCMVHA 同樣使用了人巨細(xì)胞即刻早期增強(qiáng)子/啟動(dòng)子，在多克隆位點(diǎn)的5′端含有HA 標(biāo)簽，便于使用抗HA 的抗體進(jìn)行目的蛋白檢測(cè)和分離純化，在本研究中GFP 蛋白的表達(dá)上也未體現(xiàn)出優(yōu)勢(shì)。推測(cè)載體的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子序列在蛋白表達(dá)量中也存在影響。

對(duì)于不同理化特性的目的蛋白，影響其表達(dá)量的因素很多，但是表達(dá)載體的選擇具有一定程度的通用性，本研究為用CHO 細(xì)胞進(jìn)行其他蛋白的瞬時(shí)表達(dá)載體選擇提供了參考，可以在一定程度上節(jié)省載體篩選時(shí)間。