張 亮，李玉婷，夏文靜，許曉風(fēng),2

（1.南京師范大學(xué)泰州學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，江蘇 泰州 225300；2.南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210023）

0 引言

【研究意義】土壤鹽漬化是影響作物生長發(fā)育的非生物逆境之一，嚴(yán)重制約了農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量和品質(zhì)的提升。據(jù)統(tǒng)計，全球鹽漬化土地面積已超過10 億hm2，由于不合理灌溉等原因，全球鹽漬化土地面積還在逐年增加；土壤鹽漬化不僅影響植物種子的發(fā)芽能力，而且還會影響到植物的產(chǎn)量和品質(zhì)[1-2]。高鹽環(huán)境中，植物細(xì)胞內(nèi)積累大量的Na+，高濃度的Na+會對機(jī)體產(chǎn)生鹽毒害和滲透傷害雙重效應(yīng)，進(jìn)而影響抗氧化酶的活性，導(dǎo)致活性氧（reactive oxygen species，ROS）代謝失衡，而植物體內(nèi)大量積累的ROS，可氧化攻擊細(xì)胞膜系統(tǒng)，引起質(zhì)膜局部損傷和非選擇透性增加，細(xì)胞內(nèi)容物大量外滲，植物生長受到阻礙，嚴(yán)重時影響植物的生存[3]。因此，通過施入外源物質(zhì)等措施來緩解土壤鹽漬化造成的危害，增強(qiáng)植物的抗鹽能力，將有利于提高作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，減少鹽脅迫給農(nóng)作物帶來的經(jīng)濟(jì)損失?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】植物種子發(fā)芽和幼苗生長期間對外界環(huán)境非常敏感，極易受到Na+的毒害[4]。近年來，許多植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)在植物的抗鹽脅迫中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，研究表明，赤霉素對較高濃度鹽脅迫下的紅砂種子發(fā)芽率降低有顯著的改善作用，同時可以提高種子的發(fā)芽速度和發(fā)芽指數(shù)[5]；用外源水楊酸浸種，可以提高蘿卜幼苗在鹽脅迫下葉片的葉綠素含量，促進(jìn)光合作用，提高植物的抗氧化酶活性，降低膜脂過氧化程度，調(diào)控Na+離子吸收與分布，以緩解離子毒害[6]；施加0.1 mmol·L-1精胺到小麥培養(yǎng)液中，可顯著提高小麥幼苗葉片超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）的活性，降低葉片MDA 含量，有效緩解小麥幼苗受到鹽脅迫的傷害[7]。此外，如6-芐氨基腺嘌呤、抗壞血酸、一氧化氮、硒元素等在植物受到鹽脅迫時，也能發(fā)揮較好的緩解作用[8]。目前，在這些植物生長調(diào)節(jié)劑的研究領(lǐng)域中，赤霉素類的應(yīng)用研究最為活躍[9]。異甜菊醇（isosteviol），又稱異斯特維醇，是一種具有貝葉烷骨架的四環(huán)二萜類化合物，由Mosetling 和Nes 在1955 年首次報道[10-11]。異甜菊醇由甜菊苷（stevioside）通過酸水解，或由甜菊醇（steviol）在酸性條件下官能團(tuán)重排制備獲得；而甜菊醇由甜菊苷經(jīng)高碘酸鈉氧化水解得到[12-13]。異甜菊醇和赤霉素均由乙酸板塊通過甲瓦龍酸、貝殼杉烯酸等中間體次生代謝而來，在母體結(jié)構(gòu)上兩者表現(xiàn)出相似性。劉秀芳等[14]指出，異甜菊醇和甜菊醇在促進(jìn)水稻種子發(fā)芽方面，活性優(yōu)于赤霉素?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】關(guān)于異甜菊醇緩解植物鹽毒害方面的研究幾乎是空白?！緮M解決的關(guān)鍵問題】秦油2 號屬甘藍(lán)型冬油菜冬性“三系”雜交油菜品種，具有早熟、適應(yīng)性廣、抗逆性強(qiáng)的特點(diǎn)。通過用異甜菊醇浸種，研究鹽脅迫下秦油2 號種子發(fā)芽情況及幼苗生理指標(biāo)的變化，探討異甜菊醇對鹽脅迫抑制油菜幼苗生長的緩解效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)材料為甘藍(lán)型油菜秦油2 號的種子，購于河南省博韜種業(yè)有限公司。異甜菊醇由東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院許德義教授提供，純度為99%。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計

1.2.1 鹽脅迫處理濃度的篩選 挑選大小均勻、籽粒飽滿的油菜種子，控制每50 粒種子質(zhì)量在0.15～0.20 g，用1∶500（m∶m）的高錳酸鉀溶液浸泡消毒30 min，消毒后用無菌水沖洗3～4 次后吸干水分。用37 ℃的溫水浸種24 h 后，將種子置于墊有雙層濾紙的培養(yǎng)皿（直徑15 cm）中，每皿50 粒，然后分別加入20 mL 濃度為40、80、100、120、140、160 mmol·L-1的NaCl 溶液，以等量去離子水浸種和發(fā)苗為對照1（CK1），每個處理設(shè)置5 次重復(fù)，置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，溫度25 ℃，光照時間12 h。每天記錄種子的發(fā)芽情況，以胚根長度2～3 mm 為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，連續(xù)3 d 無種子發(fā)芽即為發(fā)芽結(jié)束。培養(yǎng)7 d 后，統(tǒng)計發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)，測量幼苗苗高和根長[15]。

1.2.2 異甜菊醇浸種和鹽脅迫處理 依據(jù)鹽脅迫處理濃度試驗(yàn)的結(jié)果，確定使用140 mmol·L-1NaCl 溶液作為鹽脅迫處理。按照上述消毒方法進(jìn)行種子消毒。先用濃度梯度為1×10-10、1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6mol·L-1的異甜菊醇浸種24 h，以去離子水浸種為對照2（CK2）。然后置于雙層濾紙的培養(yǎng)皿中，每皿50 粒，分別加入20 mL 濃度為140 mmol·L-1的NaCl 溶液進(jìn)行鹽脅迫處理，以去離子水浸種和培養(yǎng)發(fā)芽作為對照1（CK1），5 次重復(fù)，每天更換培養(yǎng)液。置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，溫度25 ℃，每天光照時間12 h。每天記錄種子的發(fā)芽情況，以胚根長度2～3 mm 為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，連續(xù)3 d 無種子發(fā)芽即為發(fā)芽結(jié)束。培養(yǎng)7 d 后，統(tǒng)計發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)，測量幼苗的苗高和根長，取適量子葉和根系測定相關(guān)生理生化指標(biāo)。

1.3 指標(biāo)測定

取適量幼苗胚根和子葉測定相關(guān)指標(biāo)[16]。采用TTC 法測定根系活力（以單位時間、重量的四氮唑還原量來表示，μg·g-1·h-1）；采用丙酮提取法測定葉綠素含量；采用硫代巴比妥酸法測定丙二醛含量；采用氯化硝基四氮唑藍(lán)光化學(xué)還原反應(yīng)法測定SOD 活性；采用愈創(chuàng)木酚法測定POD 活性；采用紫外分光光度法測定CAT 活性。

發(fā)芽率=（發(fā)芽的種子總數(shù)/供試種子總數(shù)）×100%；發(fā)芽指數(shù)=ΣGt/Dt，Dt為發(fā)芽日數(shù)，Gt為在t日的發(fā)芽數(shù)；活力指數(shù)=GI×S，GI為發(fā)芽指數(shù)，S為單株幼苗長度（cm）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010 進(jìn)行基本計算和繪圖，采用SPSS 19.0 中的Duncan's 法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaCl 脅迫下油菜種子發(fā)芽和幼苗生長情況

由表1 可知，在鹽脅迫的各處理中，隨著NaCl濃度升高，油菜種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)，幼苗的苗高和根長均表現(xiàn)出不同程度的降低。其中，當(dāng)NaCl 濃度為40 mmol·L-1時，油菜幼苗苗高略有增加，但隨著NaCl 濃度升高，總體趨勢表現(xiàn)為下降。當(dāng)NaCl 濃度為120 mmol·L-1時，與CK1（去離子水浸種和發(fā)苗）相比，油菜種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、苗高和根長等指標(biāo)，均存在極顯著差異；但是，與100 mmol·L-1NaCl 處理相比，在發(fā)芽率、苗高和根長等指標(biāo)上均未達(dá)到極顯著差異（P＜0.01）。當(dāng)NaCl 濃度為140 mmol·L-1時，與CK1相比，油菜種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)分別下降20.86%、39.30%和78.39%，幼苗的苗高和根長分別下降47.06%和70.41%，差異均達(dá)極顯著水平（P＜0.01）。當(dāng)NaCl 濃度為160 mmol·L-1時，與CK1相比，油菜種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)分別下降46.77%、71.95%和94.47%，幼苗的苗高和根長分別下降64.71%和85.71%，除發(fā)芽率以外，其余指標(biāo)的下降率均超過了50%，各項指標(biāo)的差異均達(dá)極顯著水平（P＜0.01）。表明NaCl 濃度高于140 mmol·L-1會嚴(yán)重影響油菜種子的發(fā)芽和成苗過程。因此，選擇NaCl 濃度140 mmol·L-1作為感受鹽脅迫的敏感濃度，進(jìn)行后續(xù)的試驗(yàn)。

2.2 NaCl 脅迫下異甜菊醇浸種對油菜種子發(fā)芽及幼苗生長的影響

由表2 可知，與CK1相比，CK2（去離子水浸種、140 mmol·L-1NaCl 脅迫）的油菜種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、苗高和根長均顯著降低，分別降低19.24%、31.97%、75.59%、51.43%和68.75%。

與CK2相比，不同濃度的異甜菊醇浸種處理，各項指標(biāo)均表現(xiàn)出不同程度的升高，但均顯著低于無NaCl 脅迫的CK1。其中，1×10-9mol·L-1異甜菊醇浸種處理的發(fā)芽率比CK2提高14.08%；1×10-8mol·L-1異甜菊醇浸種處理的發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、苗高和根長分別比CK2提高33.02%、146.24%、70.59%和93.33%。表明用異甜菊醇浸種，可緩解鹽脅迫對油菜種子萌發(fā)和幼苗前期生長產(chǎn)生的抑制作用。

表1 NaCl 脅迫對油菜種子發(fā)芽指標(biāo)的影響Table 1 Effect of salt stress on seed germination of B.napus

表2 NaCl 脅迫下異甜菊醇浸種對油菜種子發(fā)芽及幼苗生長的影響Table 2 Effects of pre-soaking in isosteviol solution on seed germination and seedling growth of B.napus under salt stress

2.3 NaCl 脅迫下異甜菊醇浸種對油菜幼苗生理指標(biāo)的影響

2.3.1 根系活力 由圖1 可知，與CK1相比，CK2的油菜幼苗根系活力顯著降低25.05%。與CK2相比，不同濃度的異甜菊醇浸種處理，均顯著提高了幼苗根系活力，其中1×10-8mol·L-1異甜菊醇浸種處理的根系活力增加27.33%。表明鹽脅迫下，用異甜菊醇浸種可提高油菜幼苗根系活力。

2.3.2 葉綠素含量 由圖2 可知，與CK1相比，CK2的油菜幼苗子葉中葉綠素的合成受到顯著抑制，比CK1降低37.99%。與CK2相比，不同濃度的異甜菊醇浸種處理，均顯著提高了子葉中葉綠素含量，其中1×10-8mol·L-1異甜菊醇浸種處理的葉綠素含量提高36.94%。表明在鹽脅迫下，用異甜菊醇浸種有利于油菜幼苗光合色素的合成。

圖1 NaCl 脅迫下異甜菊醇浸種對油菜根系活力的影響Fig.1 Effect of pre-soaking seeds in isosteviol solution on root activity of B.napus seedlings under salt stress

圖2 NaCl 脅迫下異甜菊醇浸種對油菜幼苗（鮮樣）葉綠素含量的影響Fig.2 Effect of pre-soaking seeds in isosteviol solution on chlorophyll content of B.napus seedlings (fresh samples)under salt stress

2.3.3 MDA 含量 由圖3 可知，與CK1相比，CK2的油菜幼苗子葉中MDA 含量顯著升高65.98%。與CK2相比，不同濃度的異甜菊醇浸種處理，均顯著降低子葉中MDA 含量，其中1×10-8mol·L-1異甜菊醇浸種處理的MDA 含量降低32.11%。表明在鹽脅迫下，用異甜菊醇浸種可降低油菜幼苗子葉中MDA的含量，具有緩解活性氧對細(xì)胞造成的氧化損傷作用。

2.3.4 抗氧化酶活性 由圖4 可知，與CK1相比，CK2的油菜幼苗子葉中SOD、POD 和CAT 活性均略有增加，但未達(dá)到顯著水平。與CK2相比，不同濃度的異甜菊醇浸種處理，均顯著提高了油菜幼苗子葉的SOD、POD 和CAT 活性，其中：1×10-9mol·L-1異甜菊醇浸種處理，幼苗子葉的POD 和CAT 活性最高，分別比CK2增加140.80%和47.25%；1×10-8mol·L-1異甜菊醇浸種處理，幼苗子葉中SOD 活性最高，比CK2增加83.31%。表明在鹽脅迫下，用異甜菊醇浸種可增強(qiáng)油菜幼苗子葉中抗氧化酶的活性。

圖3 NaCl 脅迫下異甜菊醇浸種對油菜幼苗子葉（鮮樣）丙二醛含量的影響Fig.3 Effect of pre-soaking seeds in isosteviol solution on MDA content of B.napus seedlings (fresh samples) under salt stress

圖4 NaCl 脅迫下異甜菊醇浸種對油菜幼苗子葉（鮮樣）抗氧化酶活性的影響Fig.4 Effects of pre-soaking seeds in isosteviol solution on SOD, POD, CAT activities of B.napus seedlings (fresh samples) under salt stress

3 結(jié)論與討論

3.1 異甜菊醇浸種處理有助于鹽脅迫下油菜種子的萌發(fā)

植物種子在萌發(fā)階段和幼苗生長初期對外界環(huán)境的變化最為敏感，是整個生活史中最為關(guān)鍵的階段。一般認(rèn)為，植物種子發(fā)芽受低濃度的鹽處理影響不明顯，而較高濃度的鹽處理將會抑制植物種子發(fā)芽和幼苗生長[17]。有研究表明，在低濃度的鹽處理中對棉花種子發(fā)芽有促進(jìn)作用，而高濃度的鹽處理將顯著抑制種子的發(fā)芽[18]。另外，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，當(dāng)鹽濃度為0.40%時，對甜高粱種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢無顯著影響；當(dāng)鹽濃度高于0.80%時開始產(chǎn)生抑制作用[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)NaCl 濃度為40 mmol·L-1時，油菜幼苗苗高略有增加，種子最終的發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)與CK1處理相比無顯著變化；隨著NaCl 濃度的升高，種子發(fā)芽和幼苗生長情況均受到抑制，當(dāng)NaCl 濃度超過140 mmol·L-1時，嚴(yán)重抑制種子萌發(fā)和成苗的過程。

有研究發(fā)現(xiàn)，赤霉素能促進(jìn)植物種子在鹽脅迫條件下發(fā)芽，緩解鹽脅迫對幼苗生長產(chǎn)生的毒害作用[20]。由于異甜菊醇和赤霉素具有母體結(jié)構(gòu)上的相似性，同時也表現(xiàn)出促進(jìn)種子發(fā)芽和幼苗生長的能力[21]。Nevmerzhitskaya 等[22]研究發(fā)現(xiàn)，低溫和鎘脅迫下，用甜菊醇浸種，可以增加冬小麥幼苗的苗高和根長，提高冬小麥的抗逆性，緩解非生物脅迫條件對冬小麥產(chǎn)生的不利影響。本研究結(jié)果與之相似。本研究發(fā)現(xiàn)，在NaCl 脅迫條件下，加入1×10-10～1×10-6mol·L-1的異甜菊醇浸種處理與對照（CK2）相比，油菜種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)，幼苗的苗高和根長均顯著升高，其中以1×10-9～1×10-8mol·L-1異甜菊醇浸種處理效果最優(yōu)。表明用適宜濃度的異甜菊醇浸種，能有效緩解鹽脅迫對種子發(fā)芽和成苗過程產(chǎn)生的傷害。

3.2 異甜菊醇浸種處理有助于提高鹽脅迫下油菜幼苗根系活力和葉綠素含量

植物根系作為植物吸收水分和礦物質(zhì)質(zhì)元素的重要器官，也是最先感受土壤脅迫環(huán)境的部位，根部細(xì)胞通過離子平衡、拒鹽作用和Na+分隔等方式來響應(yīng)鹽脅迫環(huán)境[23]。根系活力主要反映根部氧化、還原、吸收和合成物質(zhì)的能力，其活力的大小對維持植物地上部的快速生長起到關(guān)鍵作用[24]。有研究表明，茉莉酸甲酯、氯化鈣和脯氨酸能促進(jìn)鹽脅迫下植物的根系活力，這可能與外源物質(zhì)參與調(diào)解根系細(xì)胞滲透壓、清除自由基和調(diào)控相關(guān)酶的活性有關(guān)[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，與CK1相比，CK2顯著減低油菜幼苗根系活力。而1×10-8mol·L-1異甜菊醇浸種處理與CK2相比，根系活力增加27.33%。表明在鹽脅迫下，異甜菊醇浸種可提高油菜幼苗根系活力，有利于根系對水分和礦物質(zhì)的吸收，提高幼苗的抗鹽能力。

在鹽脅迫下，由于植物根系活力減弱，吸收不到足夠的養(yǎng)分和水分，造成營養(yǎng)不良，致使葉片中葉綠素含量降低[26]。葉綠素含量的穩(wěn)定有助于維持植物在逆境中光合作用的正常運(yùn)轉(zhuǎn)，其含量的多少直接影響植物光合能量的收集、傳遞和轉(zhuǎn)化的效率，從而影響凈光合產(chǎn)物的積累，最終影響植物體的生物量[27]。有研究表明，鹽脅迫下甜高粱幼苗葉片中的葉綠素a、b 含量均有所下降，當(dāng)加入硝酸鉀后，葉片中光合色素含量顯著增加[28]。另外，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，赤霉素可提高鹽脅迫下水稻葉片葉綠素總量，增強(qiáng)植物的抗逆性[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，在鹽脅迫下，1×10-8mol·L-1異甜菊醇浸種處理與CK2相比，葉綠素總含量提高36.94%。表明異甜菊醇浸種，可緩解鹽脅迫對油菜幼苗光合色素合成產(chǎn)生的抑制作用，從而有利于保證幼苗正常進(jìn)行光合作用。

3.3 異甜菊醇浸種處理能調(diào)節(jié)鹽脅迫下油菜幼苗抗氧化酶系統(tǒng)

植物在正常生理作用下，體內(nèi)ROS 的清除與產(chǎn)生處于一種動態(tài)平衡。當(dāng)植物體處于生物或非生物脅迫環(huán)境下，這種動態(tài)平衡會被打破，體內(nèi)將會積累過量的ROS，進(jìn)而對植物細(xì)胞膜系統(tǒng)產(chǎn)生氧化損傷[30]。MDA 作為膜脂過氧化作用的產(chǎn)物之一，其含量的多少常被用于反映植物細(xì)胞的氧化損傷程度[31]。植物在長期進(jìn)化的過程中，抗氧化酶系統(tǒng)的形成有助于ROS 的平衡，其中植物細(xì)胞內(nèi)的SOD、POD、CAT 等抗氧化酶系統(tǒng)的主要成分在脅迫環(huán)境中將會被激活，能有效清除多余的過氧化物、羥基自由基、超氧化物陰離子等活性氧，減少細(xì)胞內(nèi)MDA 的產(chǎn)生[32]。有研究表明，在鹽脅迫下，水稻幼苗噴施25～100 mg·L-1赤霉素后，抗氧化酶活性顯著增加，可有效清除過量的ROS，減少膜脂過氧化作用，顯著降低葉片的MDA 含量，提高水稻的耐鹽能力[33]。Mikhailov 等[34]研究發(fā)現(xiàn)，在鎘和鋅的脅迫下，用濃度為1×10-8mol·L-1的甜菊苷浸種，可以提高冬小麥葉片中抗壞血酸過氧化物酶活性，有利于清除體內(nèi)多余的ROS，緩解重金屬對冬小麥幼苗的毒害。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在鹽脅迫下，用1×10-9mol·L-1的異甜菊醇浸種，油菜幼苗子葉的POD 和CAT 活性最高，分別比CK2提高140.80%和47.25%；用1×10-8mol·L-1的異甜菊醇浸種，幼苗子葉的SOD 活性比CK2提高83.31%，同時MDA 含量降低32.11%。由此表明，鹽脅迫下，用適宜濃度的異甜菊醇浸種，能有效調(diào)節(jié)植物體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)，清除多余的ROS，減少因ROS 積累對植物細(xì)胞造成的傷害，從而提高幼苗的抗鹽能力。

綜上所述，采用適宜濃度的異甜菊醇浸種，能有效緩解鹽脅迫對油菜種子發(fā)芽和幼苗生長產(chǎn)生的傷害。其中以1×10-9～1×10-8mol·L-1異甜菊醇浸種處理，油菜種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)最高，同時能顯著提高幼苗根長、苗高、葉綠素含量、抗氧化酶活性和根系活力，降低子葉的MDA 含量，提高油菜幼苗的抗鹽能力。