閻曉菲，劉明軍

（1.石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆 石河子 832000；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)科學(xué)技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；3.新疆畜牧科學(xué)院生物技術(shù)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草食家畜遺傳育種與繁殖重點實驗室/新疆動物生物技術(shù)重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830011）

0 引言

綿羊消化道線蟲病主要是由毛圓科（Trichostrongylidae）、 毛 線 科（Trichonematidae）、圓線科（Strongylidae）、鉤口科（Ancylostomatidae）的多種線蟲混合寄生于皺胃、小腸、大腸所引起的慢性消耗性疾病。該病以消化道炎癥、胃腸組織完整性受到損害、營養(yǎng)障礙為主要特征，從而使綿羊漸進(jìn)性消瘦、貧血、生長發(fā)育受阻、增重減緩、飼料利用率降低、甚至衰竭死亡，由此造成養(yǎng)殖費用增加及經(jīng)濟(jì)效益下降，嚴(yán)重制約養(yǎng)羊業(yè)健康發(fā)展[1-3]。目前防治該病以藥物治療為主，每年全世界用于治療的費用達(dá)到數(shù)十億美元[4]。然而，新藥的研制是一個長期的過程，而寄生蟲對長期使用的藥物很快會產(chǎn)生耐藥性。早在1980-1990 年間就有養(yǎng)殖戶發(fā)現(xiàn)，需要使用更昂貴的驅(qū)蟲藥才能達(dá)到有效治療[5]，因此尋找控制消化道線蟲病的替代方法極為迫切。篩選綿羊消化道線蟲的抗性基因進(jìn)行抗病育種，從遺傳本質(zhì)上提高綿羊的抗性，已成為控制和減少消化道線蟲病發(fā)生的可持續(xù)策略，是提高養(yǎng)羊業(yè)生產(chǎn)水平的重要途徑[6]。抗病育種技術(shù)現(xiàn)已從傳統(tǒng)表型選擇逐步發(fā)展出了標(biāo)記輔助選擇、全基因組關(guān)聯(lián)分析等多種方法，并篩選了多種動物的抗病相關(guān)基因[6-9]。本文對已報道的綿羊消化道線蟲抗性相關(guān)候選基因位點的篩選技術(shù)進(jìn)行了全面綜述，旨為今后綿羊消化道線蟲病的抗病育種研究提供借鑒。

1 抗病育種技術(shù)

從基因水平上增強綿羊?qū)ο谰€蟲抗性的育種方法主要包括對消化道線蟲抗性個體的直接選擇和主要由環(huán)境導(dǎo)致宿主基因變異的間接選擇。

1.1 抗病育種直接選擇

綿羊?qū)ο谰€蟲的抗性受遺傳控制。由于個體間遺傳變異，不感染或感染強度小的個體通常具有抗性遺傳基因，將其選育出進(jìn)行世代繁殖，可使抗性個體增多，抗性基因頻率提高。這種方式直觀簡便，可顧及所有抗性或易感性的遺傳基因。利用這個方法，在自然感染或人工感染條件下，綿羊?qū)ο谰€蟲的抗性個體的選育有較為廣泛的研究報道（見表1）[10-25]。前人研究證明綿羊品種間對消化道線蟲的抗性能力存在很大差異，在不同綿羊群體中也證明了存在品種內(nèi)遺傳變異。這些品種在高寄生蟲感染和不使用驅(qū)蟲藥的環(huán)境條件下，經(jīng)過長期自然選擇，具抗性個體存活、繁衍形成了對寄生蟲的較強抵抗力。 因此越是在持續(xù)強的疾病感染環(huán)境下形成的羊的品種，相對于引進(jìn)品種對疾病的抵抗力和耐受力越強[26]。傳統(tǒng)的育種策略是基于指標(biāo)性狀的使用，其中糞便蟲卵數(shù)（Faecal egg counts, FEC）可以推算寄生蟲的感染強度，是綿羊?qū)ο谰€蟲抗性的主要指標(biāo)。用FEC 評價的抗線蟲性在小型反芻動物中具有遺傳力，遺傳力在0.01～0.65[27]。但高抗病性狀的形成需要花費幾千年的持續(xù)表型選擇，遺傳進(jìn)展緩慢，耗時長，費用高。盡管對綿羊和山羊進(jìn)行抗病性選擇是可能的和有效的，但由于在收集表型和系譜信息方面的復(fù)雜性以及與管理育種計劃所涉費用相關(guān)的限制，大多數(shù)發(fā)展中國家尚未完全采用這一方法，而僅限于研究群體。此外，還有其他因素需要考慮。例如，與技術(shù)和基礎(chǔ)設(shè)施有關(guān)的問題是大多數(shù)綿羊和山羊養(yǎng)殖系統(tǒng)基因改良方案的最大瓶頸：羊群規(guī)模小、缺乏明確的育種目標(biāo)、缺乏或較差的基礎(chǔ)設(shè)施；尤其是一些小的養(yǎng)殖戶沒有準(zhǔn)確的系譜。這些都是導(dǎo)致農(nóng)民在育種計劃中參與率低的所有因素，使得實現(xiàn)品種內(nèi)遺傳改良具有很大的挑戰(zhàn)性[27]。

1.2 抗病育種間接選擇

1.2.1 分子遺傳標(biāo)記輔助選擇 分子遺傳標(biāo)記輔助選擇就是在基因水平上，利用控制性狀的DNA 分子標(biāo)記選擇來代替以表型為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)選擇方法，特別是用以選擇抗病性狀和中低等遺傳力性狀的個體，可以克服直接選擇的弊端，實現(xiàn)種羊提早選育，縮短世代間隔，提高育種的準(zhǔn)確性，有效減少育種費用。很多疾病是由多基因控制，其標(biāo)記物較為復(fù)雜，但采用數(shù)量性狀位點（Quantitative trait locus,QTL），可以將影響數(shù)量性狀的多基因分為幾個不連續(xù)的遺傳因子，使其定位于特定的染色體上，分析它們與其他基因的聯(lián)系，最終獲得其DNA 序列。目前，使用家系研究和連鎖分析、串連重復(fù)序列數(shù)（Variable-number tandem repeat, VNTR）多態(tài)性、原位雜交等技術(shù)，可以快捷方便地進(jìn)行QTL 定位，從而開展畜禽抗病性及其他重要經(jīng)濟(jì)性狀的分子遺傳標(biāo)記選擇[28]。通過識別候選基因組區(qū)域，繪制QTL 有助于理解寄生蟲抗性的復(fù)雜性。研究微衛(wèi)星標(biāo)記的使用旨在揭示寄生蟲抗性機制。目前在尋找綿羊消化道線蟲抗性QTL 標(biāo)記的報道較多（見表2）[29-37]。在綿羊數(shù)量性狀位點數(shù)據(jù)庫中[Sheep Quantitative Trait Locus （QTL） Database, Sheep QTLdb]包含了 107 個與寄生蟲抗性相關(guān)的 QTL，這些 QTL涵蓋了幾乎所有的染色體。與傳統(tǒng)的選擇方法相比，標(biāo)記輔助選擇可以利用已識別的QTL 加速選擇，即使在低頻率下也可以找到適合該性狀的等位基因[27,38]。盡管利用QTL 可以加快遺傳進(jìn)展，但是由于目前沒有發(fā)現(xiàn)與胃腸道線蟲（Gastrointestinal nematode, GIN）抗性相關(guān)的主要QTL，因此使用遺傳標(biāo)記仍然存在一些實際問題，如抗性似乎是多基因性狀，在基因組中有許多影響較小的基因座[27]。

表1 綿羊抗消化道線蟲病品種的相關(guān)研究Table 1 Studies relating to GIN disease in sheep

1.2.2 全基因組關(guān)聯(lián)分析（Genome wide association,GWA） 通過GWA 研究可揭示抗病性狀的遺傳基礎(chǔ)和遺傳機理，是發(fā)現(xiàn)影響綿羊復(fù)雜性狀的基因變異的新策略。傳統(tǒng)的QTL 定位僅是對已知的抗性基因進(jìn)行分析研究，而GWA 是對全基因組范圍內(nèi)的所有位點進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，擁有更全的關(guān)聯(lián)信息，相比傳統(tǒng)遺傳標(biāo)記選擇，GWA 更有可能找到與性狀真正關(guān)聯(lián)的候選基因，因此不再受到預(yù)先假設(shè)的候選基因的限制。對于GWA 在分析不同的復(fù)雜性狀之前，不再像以前一樣盲目地預(yù)設(shè)一些假定條件，而是在病理和對照組中，有目的地比較全基因組范圍內(nèi)所有單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism,SNP）的等位基因頻率或者通過家系進(jìn)行傳遞不平衡檢驗，從而找出與復(fù)雜性狀顯著相關(guān)的序列變異。

Benavides M V 等（2015）[39]利用基于GWA 的方法分析了紅馬賽和杜泊羊的雙回交群體中的SNP，鑒定與宿主的消化道線蟲抗性密切相關(guān)的多態(tài)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在7 號染色體上檢測到一種關(guān)聯(lián)，為相似遺傳背景的雙回交群體綿羊的消化道線蟲抗性標(biāo)記，提供了額外的SNP 標(biāo)記信息。Riggio V 等（2013）[40]通過比較GWA 和區(qū)域遺傳力作圖（Regional heritability mapping, RHM）方法，分析了蘇格蘭黑面羔羊線蟲抗性和體重的遺傳結(jié)構(gòu)，對FEC 和抗環(huán)紋背帶線蟲3 期幼蟲的IgA 活性進(jìn)行性狀分析，作為線蟲抗性指標(biāo)，2 種方法都證明了14 號染色體與綿羊感染細(xì)頸屬線蟲的相關(guān)性，6 號染色體與圓線蟲FEC 的相關(guān)性。整個數(shù)據(jù)表明，RHM 方法識別出的區(qū)域比GWA更多，這表明RHM能夠捕獲一些GWA分析未檢測到的變化。Kemper K E等（2011）[41]人工感染蛇形毛圓線蟲和捻轉(zhuǎn)血矛線蟲，并測定FEC。通過SNP50串珠芯片和48 640 SNP 標(biāo)記進(jìn)行基因分型分析，發(fā)現(xiàn)雖然單個標(biāo)記的影響很小，但可以成功預(yù)測綿羊?qū)€蟲的抗性。

表2 綿羊消化道線蟲病抗性QTL 標(biāo)記的相關(guān)研究Table 2 Studies on GIN-resistant QTL markers in sheep

到現(xiàn)在為止，采用GWA 分析及SNP 標(biāo)記已經(jīng)挖掘出很多與消化道線蟲抗性相關(guān)聯(lián)的基因和染色體區(qū)域，鑒定出的基因位點和染色體區(qū)域中，只有很少的部分是位于之前報道的染色體區(qū)域之中或者附近，大部分是位于之前從未被報道過的染色體區(qū)域，而這些未報道的區(qū)域可能對綿羊的消化道線蟲抗性形成非常重要。

1.2.3 轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù) 轉(zhuǎn)錄組測序，也稱為RNA測序 （RNA-Sequencing, RNA-Seq），是這幾年新興的一種高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，可在單核苷酸水平上對細(xì)胞的全部轉(zhuǎn)錄活動進(jìn)行檢測，提供更多的生物體轉(zhuǎn)錄信息，辨別一些未知的轉(zhuǎn)錄本，定量分析基因的表達(dá)水平，識別SNP，研究基因結(jié)構(gòu)變異，能夠為全面揭示生物體生命活動中相關(guān)基因功能、系統(tǒng)發(fā)生與進(jìn)化及與其他生物相互作用等奠定基礎(chǔ)，為進(jìn)一步提高基因結(jié)構(gòu)信息、挖掘新的基因和新基因的功能及育種和治療疾病的研究提供重要信息[42]。

RNA-Seq 技術(shù)已報道應(yīng)用于綿羊?qū)ο谰€蟲感染的抗性基因篩選，已鑒定出多個未曾報道的基因，可作為研究成年羊感染線蟲引起免疫應(yīng)答的分子機制的平臺。Chitneedi P K 等（2018）[43]通過抗性和易感成年羊皺胃黏膜和皺胃淋巴結(jié)轉(zhuǎn)錄組分析，研究了綿羊感染環(huán)紋背帶線蟲的抗性機制。用2 種軟件（Deseq 和EdgeR）進(jìn)行特異性表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)皺胃黏膜和皺胃淋巴結(jié)共有106 個共同的特異性表達(dá)基因，可能具有綿羊?qū)ο谰€蟲抗性活性。與前人的研究結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)性的比較，發(fā)現(xiàn)了一些已報道的綿羊抗性基因，如內(nèi)凝集蛋白2（ITLN2）、氯離子通道輔助蛋白1（CLCA1）和半乳糖等，同時也發(fā)現(xiàn)了一些未報道的基因，如過氧化物酶體增殖物激活受體γ 輔助激活因子（PGC）、肺表面活性蛋白D（SFTPD）、微 管 蛋 白α-4A 鏈（TUBA4A）等12 個。Guo Z 等（2016）[44]通過RNA-Seq 技術(shù)，研究了加那利群島的兩個品種綿羊?qū)δ磙D(zhuǎn)血矛線蟲抗性的分子機制，發(fā)現(xiàn)在感染后，抗性品種有711 個基因的轉(zhuǎn)錄豐度受到顯著影響，易感品種有50 個基因的轉(zhuǎn)錄豐度受到顯著影響，結(jié)果表明，抗性品種易于誘導(dǎo)急性炎癥反應(yīng)、補體激活、加速細(xì)胞增殖和隨后的組織修復(fù)，以及具有針對寄生蟲繁殖力的免疫，這些都有助于宿主對寄生蟲感染的抵抗力的形成。Mcrae K M 等（2016）[45]為確定抗性和易感羔羊差異表達(dá)的生物進(jìn)程，對消化道線蟲抗性和易感蘇格蘭黑面羔羊的皺胃淋巴結(jié)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在抗性和易感羔羊感染消化道線蟲（人工感染3 000 個環(huán)紋背帶線蟲）后，皺胃淋巴結(jié)有大量基因表達(dá)差異，抗性羔羊比易感羔羊較早出現(xiàn)免疫反應(yīng)，其中2 個差異表達(dá)基因中的SNP 與FEC 有相關(guān)性，表明差異表達(dá)基因可能是線蟲抗性的候選位點。

綿羊?qū)€蟲的抗性在品種內(nèi)和品種間都不同，具有一定的遺傳性。為了幫助未來的育種策略和有效、可持續(xù)的線蟲防治方法的發(fā)展，需要詳細(xì)了解保護(hù)免疫所涉及的基因和機制，以及調(diào)節(jié)這種反應(yīng)的因素。而芯片只能檢測到已知的RNA 轉(zhuǎn)錄本的相對豐度，無法獲得極微小的基因表達(dá)水平改變，這對于了解抗性反應(yīng)至關(guān)重要。因此RNA-Seq 技術(shù)可具有更準(zhǔn)確的定量、更高的重復(fù)性、更廣的檢測范圍、更可靠的分析等特點，使以前從未研究過的新基因得以鑒定，而無需背景知識[46]。

2 綿羊抗消化道線蟲感染育種的主要候選基因

目前，已發(fā)現(xiàn)的綿羊抗消化道線蟲感染相關(guān)的免疫候選基因較多，有主要組織相容性復(fù)合物（Major histocompatibility complex，MHC）基因、干擾素γ 基因（Interferon Gamma，IFNG）、白介素基因（Interleukin，IL）、半乳凝素基因（Galectin，GAL）、內(nèi)凝集素基因（Intelectin，ITLN）等。其中MHC和IFNG基因是報道最多的與綿羊消化道線蟲感染相關(guān)的標(biāo)記物[47]。

2.1 MHC 基因和IFNG 基因

現(xiàn)已報道的綿羊抗消化道線蟲候選基因的遺傳標(biāo)記中，使用最多的是位于20 號染色體的MHC區(qū)域[22,31,35,37]。MHC基因具有很高的多態(tài)性[48]，在向宿主T 淋巴細(xì)胞提供經(jīng)過處理的抗原，引起T 細(xì)胞活化和在建立宿主的免疫級聯(lián)反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。僅次于MHC區(qū)域的是位于20 號染色體的IFNG基因[32-33,49]。小鼠模型顯示，高水平的IFNG可能會刺激Th2 應(yīng)答拮抗，對消化道線蟲產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)[50]。因此MHC和IFNG可以增加綿羊?qū)ο谰€蟲的抵抗力。

2.2 ITLN 基因

凝集素具有糖專一性、可促使細(xì)胞凝集蛋白質(zhì)或糖蛋白，由于它對糖的特異結(jié)合性決定了它在動物體內(nèi)具有重要而特殊的生物學(xué)功能，使其在獸醫(yī)臨床疾病防治、機體生理活動調(diào)控以及生物工程等方面展示出了十分廣闊的應(yīng)用前景[51]。Banwell J G（1993）等[52]首先發(fā)現(xiàn)凝集素能促進(jìn)小腸發(fā)育。French AT 等（2008、2009）[53-54]在蘇格蘭黑臉與萊斯特雜交F1 羔羊感染環(huán)紋背帶線蟲后的淋巴結(jié)組織中發(fā)現(xiàn)ITLN1和ITLN3的表達(dá)，及在皺胃中發(fā)現(xiàn)ITLN2表達(dá)，研究表明內(nèi)凝集素基因（ITLN1、ITLN2、ITLN3）與分泌黏液細(xì)胞相關(guān)，ITLN的早期表達(dá)對寄生蟲的感染有防御作用，可以改變黏液的特性，能截留線蟲。Chitneedi P K 等（2018）[43]在具有對消化道線蟲抗性的成年羊皺胃淋巴結(jié)轉(zhuǎn)錄組分析中，發(fā)現(xiàn)ITLN2呈上調(diào)表達(dá)。因此推測綿羊的內(nèi)凝集素基因（ITLN1、ITLN2、ITLN3）在消化道線蟲感染中發(fā)揮著重要作用。

2.3 IL 基因

白介素是人和動物分泌最多和最常見的細(xì)胞因子，其主要作用是激活T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞等及在炎癥反應(yīng)中起重要作用，因此具有很強的抗寄生蟲感染作用。Gossner A 等（2013）[55]在對感染環(huán)紋背帶線蟲具有抗性的蘇格蘭黑臉羔羊研究中，發(fā)現(xiàn)綿羊?qū)€蟲抗性與體液免疫反應(yīng)、蛋白質(zhì)合成、炎癥反應(yīng)、血液系統(tǒng)發(fā)育和功能的關(guān)系最為密切，其中的IL4RA、IL5RA、IL13RA，特別是IL13RA的活性對抗性表型至關(guān)重要。Pease J E 等[56]發(fā)現(xiàn)IL5RA是IL5發(fā)揮生物學(xué)活性所必需的，可促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞介導(dǎo)活性作用和在嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)中補充到組織。嗜酸性粒細(xì)胞水平的增加與綿羊?qū)γ珗A線蟲感染的抗性相關(guān)聯(lián)，也作為綿羊?qū)Νh(huán)紋背帶線蟲的抗性標(biāo)記[57]。Chitneedi P K 等[43]的研究中發(fā)現(xiàn)IL5RA是綿羊?qū)ο兰纳x抗性的重要基因。Zaros L G 等（2014）[58]研究發(fā)現(xiàn)自然感染消化道線蟲后，具有抗性的巴西索馬里綿羊皺胃淋巴結(jié)IL4、IL13呈上調(diào)表達(dá)。Gossner A G 等（2012）[59]在研究對環(huán)紋背帶線蟲感染具有抗性的羔羊中發(fā)現(xiàn)，其皺胃淋巴結(jié)組織的IL6 轉(zhuǎn)錄水平與抗性呈正相關(guān)，IL21和IL23A轉(zhuǎn)錄水平與成蟲數(shù)量、FEC、IgA 抗體水平呈負(fù)相關(guān)。

3 結(jié)語

傳統(tǒng)表型選擇、遺傳標(biāo)記輔助選擇等技術(shù)都可以使綿羊抗消化道線蟲感染選擇取得一定進(jìn)展，但不管采用哪種方法開展抗病力選擇，都存在不足之處?？共×ν瑫r受遺傳和環(huán)境的影響，而抗病力遺傳力低，傳統(tǒng)表型選擇雖然性狀選擇面寬，但遺傳進(jìn)展緩慢，且準(zhǔn)確性差；分子標(biāo)記確定性高，但抗性性狀由微效多基因控制，基因間又存在互作，單獨用分子標(biāo)記輔助選擇全面性不足。因此，單純采用一種技術(shù)進(jìn)行選擇都有很多局限性，應(yīng)充分將傳統(tǒng)表型選擇和標(biāo)記輔助選擇相結(jié)合，優(yōu)勢互補。

目前，國外報道的綿羊?qū)ο谰€蟲的抗性基因及遺傳標(biāo)記不少，但應(yīng)用于育種實踐的報道甚少，一些候選基因抗病作用機制復(fù)雜，尚處于試驗研究狀態(tài)。此外，抗性性狀與生產(chǎn)性狀之間以及對不同疾病的抗性之間常存在一定程度的負(fù)相關(guān)，且抗性性狀和生產(chǎn)性狀之間關(guān)聯(lián)的試驗證據(jù)還很缺乏，抗病基因?qū)ιa(chǎn)性狀的效應(yīng)還不是十分清楚。這些問題都在某種程度上制約了綿羊抗消化道線蟲感染的育種進(jìn)展。但隨著免疫學(xué)與分子遺傳學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，抗病育種技術(shù)將進(jìn)一步完善，建立持久的抗病力，這將是今后控制綿羊消化道線蟲感染的可持續(xù)的補充控制策略。