許前進 楊景峰 國 擎

乳腺癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，該病多見于中成年女性。隨著檢測技術的提高，乳腺癌在我國呈現發(fā)病率增高及年輕化的趨勢[1]。手術為該病的首選治療方法，但是中晚期乳腺癌的臨床預后比較差，基本失去了手術指征，導致5年生存率低[2-3]。因此進一步研究乳腺癌的發(fā)病機制，尋找治療乳腺癌新的治療靶點具有重要價值。現代研究表明腫瘤的發(fā)生與發(fā)展是1個復雜的分子調控失控過程，涉及到細胞信號傳導異常、細胞基質間黏附障礙、癌基因激活、抑癌基因失活等[4-5]。miRNAs是1組內源性小的非編碼RNA，廣泛存在于真核生物中，可通過轉錄后抑制基因表達或通過結合特定目標基因的3’末端非翻譯區(qū)域來發(fā)揮癌基因或抑癌基因的作用[6]。當前也有研究表明，miRNAs表達在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要的作用[7]。miR-543作為miRNAs家族的一員，在結腸癌、膠質瘤中表達上調發(fā)揮致癌基因作用[8-9]。乳腺癌組織miR-543的表達較正常子宮內膜組織明顯降低，可發(fā)揮抑癌基因作用[10]，但是具體的作用機制還不明確。B細胞特異性小鼠白血病病毒插入位點1(B-cell-specific Moloney murine leukemia virus insertion site 1，Bmi-1)屬于多梳基因單位，可直接調節(jié)細胞生長、增殖，也可通過調控染色質結構的變化來調節(jié)基因活性[11]。具體探討了miR-543對乳腺癌細胞的增殖和侵襲的影響，并明確了其作用機制，希望為乳腺癌的靶向治療提供新的方向?，F總結報告如下。

1 材料與方法

1.1 研究材料

人乳腺癌細胞(MDA-MB-468)購自于上海中科院細胞庫，0.25%胰蛋白酶Invitrogen公司，RPMI1640培養(yǎng)基購自Gibco公司，胎牛血清購自Sciencell公司，miR-543 mimics與mimics NC購自上海吉瑪制藥技術有限公司。

1.2 細胞分組與轉染

MDA-MB-468細胞與Hela細胞均采用RPMI-1640培養(yǎng)基，添加10%胎牛血清，含100 U/ml青霉素+0.1 mg/ml鏈霉素的混合液進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱，每1～2天傳代一次。取對數生長期的MDA-MB-468細胞分為三組-對照組、miR-543組與空白組。對照組、miR-543組分別轉染mimics NC與miR-543 mimics，轉染濃度為50 nM；空白組以等體積的磷酸鹽緩沖液進行轉染。轉染前24 h，將處于對數生長期的細胞接種于6孔培養(yǎng)板。用250 μl RPMI1640培養(yǎng)基稀釋5 μl轉染試劑Lipo-2000，室溫下靜置5 min。然后用25 μl RPMI1640培養(yǎng)基稀釋5 μl mimics NC與miR-543 mimics，孵育5 min進行混勻，形成復合物，滴入RPMI1640培養(yǎng)基中，轉染后6 h換液1次，然后進行常規(guī)培養(yǎng)。

1.3 MTT法檢測細胞增殖指數

MDA-MB-468細胞接種密度為3×105細胞/孔，接種于無菌的96孔板中，轉染后繼續(xù)培養(yǎng)，然后每孔加入20 μl MTT試劑(5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清培養(yǎng)基，加入200 μl的DMSO，避光振蕩溶解10 min，采用測定吸光度值。細胞增殖指數=(實驗組吸光度值-空白組吸光度值)/(對照組吸光度值-空白組吸光度值)×100%。

1.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡

收集1.3中轉染后的細胞，繼續(xù)進行常規(guī)培養(yǎng)，采用凋亡試劑盒(Annexin-V/PI)進行避光染色1 h，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡指數。

1.5 Transwell小室檢測細胞轉移與侵襲

收集1.3中轉染后的細胞，繼續(xù)培養(yǎng)后進行消化，按1×105細胞/孔接種在小室的上室中，體積為200 μl。Transwell小室下室加入750 μl含20%胎牛血清的RPIM 1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取出Tranawell小室，棄去小室液體，清洗2次后將小室置于甲醛溶液中固定15 min，再次洗滌后將小室放入0.1%結晶紫染色30 min，顯微鏡下觀察拍照，計算細胞轉移。在侵襲實驗中，實驗前1天將-20 ℃凍存的基質膠置于室溫下溶解，Transwell小室經消毒后放置在無菌24孔板中，小室內加入基質膠100 μl，常規(guī)進行培養(yǎng)，后續(xù)處理同細胞轉移實驗，計算細胞侵襲指數。

1.6 qRT-PCR檢測mRNA表達水平

收集1.3中轉染后的細胞，加入Trizol后提取細胞總RNA，采用Real-time quantitative PCR檢測miR-543表達水平，以U6作為內對照組，在ABI 7500熒光定量PCR儀上，PCR反應條件：95 ℃30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40個循環(huán)，計算miR-543相對表達水平。

1.7 Western Blotting檢測蛋白表達水平

收集1.3中轉染后的細胞，提取細胞總蛋白，跑SDS-PAGE膠，轉膜后采用Western Blotting法檢測Bmi-1表達水平，以β-actin作為內對照組，采用ImageJ軟件測量蛋白灰度值并分析各組細胞目的蛋白相對表達量。

1.8 統(tǒng)計方法

2 結果

2.1 miR-543相對表達水平對比

轉染后24 h與36 h，miR-543組miR-543相對表達水平顯著高于空白組與對照組(P<0.05)，空白組與對照組對比無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

2.2 細胞增殖指數與凋亡指數對比

轉染后24 h與36 h，miR-543組的細胞增殖指數顯著低于空白組與對照組(P<0.05)，細胞凋亡指數顯著高于空白組與對照組(P<0.05)，空白組與對照組對比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

表1 三組轉染后不同時間點的miR-543相對表達水平對比

表2 三組轉染后不同時間點細胞增殖指數與凋亡指數對比

2.3 細胞轉移與侵襲指數對比

轉染后24 h與36 h，miR-543組的細胞轉移與侵襲指數都顯著低于空白組與對照組(P<0.05)，空白組與對照組對比無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 三組轉染后不同時間點細胞轉移與侵襲指數對比

2.4 Bmi-1蛋白相對表達水平

轉染后24 h與36 h，miR-543組的Bmi-1蛋白相對表達水平顯著低于空白組與對照組(P<0.05)，空白組與對照組對比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表4。

表4 三組轉染后不同時間點Bmi-1蛋白相對表達水平

3 討論

近年來乳腺癌的發(fā)病率逐年增高，多數患者可在早期診斷，預后較好，5年生存率在80%以上。然而晚期與復發(fā)性乳腺癌的預后則比較差，5年生存率約為20%[12]。根治性手術是早期乳腺癌的1種有效治療方法，但是也有30%左右患者在術后可發(fā)生轉移，為此早期發(fā)現乳腺癌增殖和侵襲的分子和信號通路具有重要價值[13-14]。

miRNAs是1種非編碼小RNA，通過抑制靶基因的表達，進而調節(jié)腫瘤細胞的生物學行為[15]。有研究顯示控制乳腺癌發(fā)生的miRNAs靶基因能調節(jié)乳腺癌的早期發(fā)展，且與腫瘤組織的血管生成、細胞周期、細胞凋亡、細胞增殖和侵襲等明顯相關[16-17]。miR-543位于染色質19q13.42上，在乳腺癌、T細胞淋巴瘤、食管癌等組織中呈現異常表達情況，影響腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移[18-19]。本研究顯示轉染后24 h與36 h，miR-543組的細胞增殖指數、細胞轉移與侵襲指數顯著低于空白組與對照組，細胞凋亡指數顯著高于空白組與對照組，空白組與對照組對比差異無統(tǒng)計學意義，表明miR-543的過表達能抑制細胞增殖、轉移與侵襲，促進細胞凋亡。而轉移與侵襲是乳腺癌預后不良的主要因素，也表明miR-543可為乳腺癌的診斷和治療提供了新的靶標[20]。

腫瘤細胞的增殖和侵襲是惡性腫瘤的主要標志及體現，子宮基底層的侵襲程度是乳腺癌預后的主要因素之一，也是腫瘤患者發(fā)生癌變的主要因素之一[21]。miRNAs是約由22個核苷酸組成的短鏈非編碼RNAs，通過與靶向基因的mRNA序列互補結合來影響多種生物過程。既往研究發(fā)現miRNAs在子宮內膜分泌期、增殖期、月經期以及乳腺癌的發(fā)展過程中都可參與調控細胞的增生[22]。已有研究發(fā)現miR-543家族有抑癌作用，包括調節(jié)細胞分裂和凋亡、逆轉化療、抑制腫瘤干細胞的自我更新和分化等[23]。特別是miR-543能通過上調PTEN基因的表達，促進乳腺癌細胞的增殖、轉移及侵襲，miR-543也能經PETN-PI3K/AKT等信號通路在胃癌中抑制細胞增殖。miR-543在乳腺癌細胞中呈現低表達，上調miR-543 表達可顯著抑制細胞增殖、促進細胞凋亡[24]。

早期研究顯示miRNAs可通過靶向轉錄因子Bmi-1實現對惡性腫瘤細胞增殖及凋亡的調控[25-26]，但是在乳腺癌細胞中的作用還不明確。本研究顯示轉染后24 h與36 h，miR-543組的Bmi-1蛋白相對表達水平顯著低于空白組與對照組，空白組與對照組對比差異無統(tǒng)計學意義，表明隨著miR-543 表達的上調，Bmi-1蛋白表達水平明顯降低，提示miR-543在乳腺癌細胞對Bmi-1 蛋白表達具有一定調控作用。不過miR-543 是否還可通過調控其他下游基因發(fā)揮作用仍有待進一步研究證實。

總之，miR-543在乳腺癌細胞中可抑制Bmi-1基因的表達，促進細胞凋亡，發(fā)揮抑制細胞增殖和侵襲的作用。