陳建軍 焦宏偉 張敬

1.海南省干部療養(yǎng)院(海南省老年病醫(yī)院)中西醫(yī)結(jié)合內(nèi)科，海南 ?？?571100 2.海南省干部療養(yǎng)院(海南省老年病醫(yī)院)內(nèi)分泌科，海南 ?？?571100 3.海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，海南 ?？?570311

隨著我國(guó)人口老齡化的增加，骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)已成為最常見的慢性病之一[1]。OP是一種以骨量減少、骨密度降低、骨結(jié)構(gòu)退化為特征的代謝性骨科疾病。OP多見于老年和絕經(jīng)后婦女，女性發(fā)病率高于男性[2]。OP患者體內(nèi)骨代謝平衡被打破，骨吸收遠(yuǎn)大于骨形成；引起骨痛、脊柱后凸、身高縮小、呼吸功能下降和骨折等嚴(yán)重?fù)p害全身的癥狀[3]。目前，鈣、體育鍛煉和骨吸收抑制劑被廣泛用于OP的治療，但這些藥物只能緩解患者的癥狀，不能預(yù)防疾病的發(fā)生[4]。紅豆杉分布在我國(guó)云南省，以其抗癌化學(xué)成分紫杉醇而聞名。在當(dāng)?shù)?，這種樹由于壽命長(zhǎng)并且對(duì)老年人的慢性疾病如腎功能不全和糖尿病具有改善作用，因此被稱為不老樹。異紫杉脂素(Isotaxiresinol，IXO)是從紅豆杉提取一種芳基四氫萘型木脂素[5]，具有良好的抗炎、抗癌及調(diào)節(jié)免疫的功效，且具有類雌激素的作用[6]。因此，本研究假設(shè)異紫杉脂素對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥有保護(hù)作用，使用去卵巢切除(OVX)大鼠模型評(píng)估IXO的抗骨質(zhì)疏松活性并探索可能的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 模型建立和藥物治療

從上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心獲得雌性SD雌鼠(3月齡，230～260 g)，并在可控溫度和濕度的房間中保持12 h的明暗循環(huán)。在實(shí)驗(yàn)期間，允許實(shí)驗(yàn)大鼠自由進(jìn)食實(shí)驗(yàn)室顆粒飼料和水。適應(yīng)飼養(yǎng)7 d后，使用水合氯醛(40 mg/kg)腹膜內(nèi)麻醉大鼠，并暴露其兩個(gè)卵巢，立即結(jié)扎卵巢并切除；假手術(shù)組僅通過暴露卵巢進(jìn)行假手術(shù)。隨后大鼠隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組(Sham)、去卵巢組(OVX)及異紫杉脂素組(IXO)；IXO組大鼠在去卵巢大鼠手術(shù)1周后每天給予劑量為100 mg/kg異紫杉脂素(上海莼試生物技術(shù)有限公司購(gòu)買，批號(hào)：322123，純度>98%)進(jìn)行灌胃治療，為期12周，其余幾組同時(shí)給予生理鹽水灌胃治療。治療12周后，通過腹膜內(nèi)注射水合氯醛麻醉所有動(dòng)物，從主動(dòng)脈靜脈收集血液，并將血清保持在-70℃以下。然后，處死大鼠收集雙側(cè)股骨進(jìn)行下一步檢測(cè)。

1.2 Micro-CT檢測(cè)

使用CANCOuCT80(Micro Computed Tomography，Micro-CT)對(duì)左股骨遠(yuǎn)端進(jìn)行微計(jì)算機(jī)斷層掃描。體素大小為0.08 mm，切片厚度為0.5 mm，皮質(zhì)閾值為464 mg/cm3。使用測(cè)量模式將整個(gè)骨骼分為皮層或松質(zhì)骨作為剝離模式。此模式可以自動(dòng)檢測(cè)內(nèi)部閾值。獲得偵察掃描并確定生長(zhǎng)板后，在生長(zhǎng)線以下的左股骨遠(yuǎn)端1～5 mm區(qū)域掃描100個(gè)橫截面切片的橫向圖像集。骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)包括骨密度(BMD)、骨小梁數(shù)目(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨體積/總體積(BV/TV)、骨小梁分離度(TBSp)，通過使用內(nèi)置軟件進(jìn)行定量分析來確定微觀參數(shù)。

1.3 骨代謝指標(biāo)檢測(cè)

通過使用免疫測(cè)定試劑盒(GuYan Biotech Co.,Ltd. Shanghai，China)測(cè)量血清Ⅰ型前膠原N端前肽(P1NP)水平來評(píng)估骨形成。通過使用免疫測(cè)定試劑盒(Fubo Biotechnology Co., Ltd., Beijing, China)測(cè)量Ⅰ型膠原羧基端肽β特殊序列(β-CTX)的血清濃度來評(píng)估骨吸收。

1.4 HE組織切片分析

Micro-CT檢測(cè)完畢后，使用10%EDTA脫鈣4～6周，每周換液一次；脫鈣完畢后在10%福爾馬林中固定過夜，然后包埋在石蠟中。用蘇木精和曙紅(H&E)對(duì)包埋標(biāo)本的連續(xù)切片進(jìn)行染色，光學(xué)顯微鏡觀察并選取合適部位進(jìn)行觀察。

1.5 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)

將裂解緩沖液添加到裂解的骨組織中行冰浴1 h。然后，將組織放入離心機(jī)中以14 000 g離心10 min，并使用BCA方法對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量。接下來通過微讀數(shù)器獲得蛋白質(zhì)的吸光度和標(biāo)準(zhǔn)曲線，將其用于計(jì)算組織中的蛋白質(zhì)濃度。隨后，對(duì)組織樣本中的蛋白質(zhì)進(jìn)行變性和十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離。當(dāng)標(biāo)記蛋白以直線到達(dá)玻璃板的底部時(shí)，觀察到標(biāo)記蛋白的位置并停止電泳。然后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Millipore，Billerica，MA，美國(guó))上，并與封閉緩沖液反應(yīng)1.5 h。之后，依次添加抗PI3K一抗(1∶1000)，抗Akt一抗(1∶1000)，抗RUNX-2一抗和二抗(1∶1000)；β-actin作為內(nèi)參蛋白。漂洗后在黑暗中用化學(xué)發(fā)光試劑對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行足夠的顯色，持續(xù)1 min。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用單向方差分析及事后檢驗(yàn)對(duì)多組之間差異進(jìn)行比較。P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Micro-CT檢測(cè)結(jié)果分析

股骨的干骺端骨小梁三維重建如圖1A所示，股骨的微觀參數(shù)如圖1B～F所示。OVX組左側(cè)股骨BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th較Sham組明顯降低(P<0.05)，而Tb.Sp較Sham組明顯升高。IXO組左側(cè)股骨BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th均明顯高于OVX組(P<0.05)，而Tb.Sp較OVX組明顯降低(P<0.05)。

圖1 各組大鼠股骨干骺端骨小梁形態(tài)學(xué)檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Morphological test results of the femoral metaphyseal trabeculae in each group of rats注：和Sham組比較，*P<0.05；和OVX組比較，#P<0.05。

2.2 組織切片結(jié)果分析

各組大鼠治療12周時(shí)股骨干骺端進(jìn)行H&E染色結(jié)果，如圖2所示。在OVX組中，組織學(xué)檢查顯示出大量的骨小梁已經(jīng)消失和少量不規(guī)則排列的骨小梁。而使用IXO治療后的骨小梁相比；骨小梁的數(shù)量和之間的連接在一定程度上得到了改善。

圖2 三組大鼠股骨的組織病理學(xué) A：Sham，B：OVX，C：IXO，蘇木精-伊紅染色(放大倍數(shù)，×10)。Fig.2 Histopathology of femurs in the three groups. A：Sham，B：OVX，C：IXO，Hematoxylin eosin staining (Magnification，×10)

2.3 骨代謝指標(biāo)分析

三組大鼠治療12周后血清骨代謝指標(biāo)水平如圖3中。與Sham組大鼠相比，OVX組大鼠血清中P1NP和β-CTX水平顯著升高(P<0.05)。然而，使用IXO治療顯著降低P1NP和β-CTX顯著降低(P<0.05)。

圖3 各組大鼠血清骨代謝指標(biāo)的水平Fig.3 Serum bone metabolism index levels in each group of rats注：Sham組比較，*P<0.05；和OVX組比較，#P<0.05。

2.4 治療對(duì)PI3K、Akt和RUNX-2表達(dá)的影響

IOX治療對(duì)PI3K、Akt和RUNX-2表達(dá)的影響如圖4所示。圖4顯示了OVX組大鼠的PI3K、Akt和RUNX-2水平較Sham組顯著降低(P<0.05)。與OVX組相比，IOX治療后的股骨組織中PI3K、Akt和RUNX-2水平表達(dá)上調(diào)(P<0.05)。

圖4 使用WB檢測(cè)PI3K、Akt和RUNX-2相對(duì)表達(dá)Fig.4 Relative expression of PI3K, Akt, and RUNX-2 using Western blotting注：Sham組比較，*P<0.05；和OVX組比較，#P<0.05。

3 討論

骨質(zhì)疏松癥是嚴(yán)重威脅老年人健康和生活質(zhì)量的疾病，隨著社會(huì)人口老齡化的發(fā)展，其發(fā)病率逐年上升。特別是絕經(jīng)后的老年婦女中骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生率極高，并且由此引起的并發(fā)癥，例如疼痛和骨質(zhì)疏松性骨折，嚴(yán)重影響患者的身心健康以及生活質(zhì)量。此外，全社會(huì)已在預(yù)防和治療該疾病方面投入了大量的人力、物力和財(cái)力[7]。因此，預(yù)防骨質(zhì)疏松相關(guān)并發(fā)癥對(duì)臨床治療骨質(zhì)疏松癥具有重要意義。

目前的研究認(rèn)為骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生與破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞在體內(nèi)的功能紊亂和比例失調(diào)引起的骨代謝紊亂密切相關(guān)。有研究報(bào)導(dǎo)[8-9]顯示，絕經(jīng)后婦女的雌激素含量急劇下降，這導(dǎo)致破骨細(xì)胞功能亢進(jìn)和體內(nèi)成骨細(xì)胞抑制，從而使破骨細(xì)胞誘導(dǎo)的骨破壞明顯超過成骨細(xì)胞誘導(dǎo)的骨形成并導(dǎo)致去骨質(zhì)疏松癥。同時(shí)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是體內(nèi)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞分化的主要來源，而在刺激雌激素減少的情況下，分化為成骨細(xì)胞的大量骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的比例降低，從而進(jìn)一步影響了骨骼形成并導(dǎo)致骨質(zhì)減少。在本研究中，采用雌性大鼠去卵巢，從而引起雌激素的突然減少。12周后，檢測(cè)大鼠股骨骨密度，去卵巢大鼠骨密度顯著下降，說明本研究去卵巢誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松大鼠模型制備成功。異紫杉脂素被腸細(xì)菌轉(zhuǎn)化為激素樣哺乳動(dòng)物衍生物腸二醇，然后被結(jié)腸菌群氧化為腸內(nèi)酯。腸二醇和腸內(nèi)酯通過與雌激素受體(ER)結(jié)合而發(fā)揮其雌激素作用，或通過與內(nèi)雌激素競(jìng)爭(zhēng)ER表現(xiàn)出抗雌激素作用[10]。因此，異紫杉脂素在雌激素依賴性疾病如乳腺癌、結(jié)腸癌、肝癌和前列腺癌以及更年期癥狀的治療中表現(xiàn)出作用[10]。異紫杉脂素可認(rèn)為是一種具有雌激素活性的植物雌激素。本研究使用異紫杉脂素治療12周發(fā)現(xiàn)去卵巢大鼠骨密度、骨量較OVX組顯著改善，再次證實(shí)了異紫杉脂素有抗絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的效果。

骨轉(zhuǎn)換包括兩個(gè)連續(xù)的過程：舊骨的去除和新骨的形成。在本研究中，使用Micro-CT發(fā)現(xiàn)OVX組大鼠股骨的骨密度顯著下降，用異紫杉脂素治療后，BMD、BV/TV，Tb.N和Tb.Th與OVX組相比顯著改善，表明骨小梁的微觀結(jié)構(gòu)得到改善。血清β-CTX是骨骼中I型膠原的降解產(chǎn)物。檢測(cè)血清β-CTX含量可以特異性地反映破骨細(xì)胞的吸收活性。成骨細(xì)胞可以分泌骨特異性P1NP，P1NP可以反映骨形成的狀態(tài)。血清學(xué)指標(biāo)顯示OVX組的β-CTX和P1NP較Sham組明顯升高，而異紫杉脂素治療后大鼠的骨轉(zhuǎn)換速度較OVX組明顯下降。本研究表明異紫杉脂素可降低骨代謝速度來促進(jìn)OVX大鼠的骨形成來保護(hù)骨組織。

PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)途徑是至關(guān)重要的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，已被證實(shí)在諸如細(xì)胞增殖，分化，凋亡和壞死等生理和病理過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。研究[11]報(bào)道，PI3K/Akt細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑可以激活β-catenin及其磷酸化，而且它可以促進(jìn)下游信號(hào)通路中靶基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)的翻譯。同時(shí)，由PI3K/Akt信號(hào)通路中的Akt磷酸化產(chǎn)生的p-Akt能夠促進(jìn)β-catenin的磷酸化并觸發(fā)細(xì)胞增殖[12]。簡(jiǎn)而言之，細(xì)胞中的PI3K和P85可以通過各種刺激來激活，從而募集并激活細(xì)胞周圍的P110，從而對(duì)細(xì)胞膜表面的磷脂酰肌醇二磷酸起作用并激活，從而形成大量的磷脂酰肌醇三磷酸[13]。作為第二信使，磷脂酰肌醇三磷酸可以進(jìn)一步激活A(yù)kt的磷酸化以生成p-Akt，從而在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮作用，通過下游GSK3β和Wnt途徑發(fā)揮協(xié)同作用，并調(diào)節(jié)細(xì)胞分化的發(fā)生[14]。本研究結(jié)果表明，在去卵巢大鼠的PI3K/Akt信號(hào)通路較Sham組的大鼠明顯被抑制，PI3K、Akt及RUNX-2蛋白的表達(dá)水平顯著降低，而在經(jīng)過IXO治療后，PI3K/Akt信號(hào)通路較OVX組明顯激活，PI3K、Akt及RUNX-2相關(guān)蛋白表達(dá)明顯上調(diào)。因此筆者認(rèn)為IXO能保護(hù)去卵巢對(duì)大鼠骨量破壞作用可能是介導(dǎo)PI3K/Akt信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)的。

總的來說，異紫杉脂素可能通過降低骨轉(zhuǎn)換速度及激活PI3K/Akt信號(hào)通路來改善骨密度、骨微觀結(jié)構(gòu)和骨強(qiáng)度以及治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥。