陳光華 黃貴芝 林瀚 吳新誘 譚小艷 陳周韜

廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，廣東 湛江 524001

骨質(zhì)疏松是一種以骨量減少、骨微結(jié)構(gòu)受損、骨脆性增加、骨折風(fēng)險(xiǎn)增加為特征的代謝性骨病。據(jù)估計(jì)，在全世界老年婦女中，與骨質(zhì)疏松有關(guān)的骨折發(fā)病率約為40%，在男子中約為13%[1]。糖皮質(zhì)激素由于其抗炎和免疫抑制作用，在臨床上得到了廣泛的應(yīng)用。激素治療期間骨保護(hù)素與核因子受體激活劑κB配體比值的變化導(dǎo)致前3～6個(gè)月骨吸收增加，出現(xiàn)骨質(zhì)疏松的不良反應(yīng)，骨折風(fēng)險(xiǎn)也明顯增加[2]。糖皮質(zhì)激素引起的骨質(zhì)疏松(glucocorticoid induced osteoporosis，GIOP)在繼發(fā)性骨質(zhì)疏松中居首位。有一些證據(jù)顯示氧化應(yīng)激與絕經(jīng)后骨密度喪失之間的相關(guān)性；絕經(jīng)期雌激素缺乏會(huì)增加氧化應(yīng)激和骨質(zhì)流失[3]。生育三烯酚 (tocotrienols，TTS)是維生素E的一個(gè)亞組，具有4種異構(gòu)體α、β、γ和δ，在過(guò)去的10年中，由于其強(qiáng)大的抗氧化和抗炎特性[4]，在包括骨質(zhì)疏松癥在內(nèi)的慢性病的治療上獲得了極大的關(guān)注[5]。有研究表明抗氧化劑對(duì)降低大鼠氧化應(yīng)激和血管細(xì)胞黏附分子-1的生成，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)抗氧化劑的抗氧化能力可以有效降低氧化應(yīng)激[6]。由于氧化應(yīng)激在OP中發(fā)揮重要作用，抗氧化劑具有抗氧化作用，然而，其對(duì)GIOP的研究目前有限。因此，本研究旨在探討生育三烯酚對(duì)GIOP誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松大鼠的影響并探索可能的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑

12周齡雌性SD大鼠30只，體質(zhì)量(230±15) g，購(gòu)自上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。生育三烯酚(維克奇；批號(hào)： 20190021)。抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)、Ⅰ型膠原交聯(lián)羧基末端肽(CTX-I)、堿性磷酸酶(ALP)檢測(cè)試劑盒和骨鈣素(OC)酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)試劑盒購(gòu)自中國(guó)上海源業(yè)生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組和治療

動(dòng)物分組造模，自適應(yīng)喂養(yǎng)雄性SD大鼠1周。將大鼠隨機(jī)分為3組，每組10只：對(duì)照組(CON組)，肌肉注射生理鹽水0.1 mL；地塞米松組(DEX組)10只，肌肉注射地塞米松溶液0.1 mL，1 mg/kg(每周2次)；連續(xù)干預(yù)3個(gè)月建立GIOP大鼠模型[7]。地塞米松+生育三烯酚組(DEX+TTS組)10例，給予地塞米松溶液0.1 mL，每周2次；同時(shí)給予2 mg生育三烯酚灌胃，而其他組給予相同劑量的生理鹽水灌胃治療，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。處死前集外周血清和雙側(cè)股骨。雙側(cè)股骨用生理鹽水紗布包裹，置于-20 ℃的冰箱中。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

將左側(cè)股骨在室溫下解凍并固定在樣品架中，使用SCANCOuCT80進(jìn)行微計(jì)算機(jī)斷層掃描(micro computed tomography，Micro-CT)掃描。該掃描儀的電壓為50 kvp，電流為200μA，分辨率為15 μm/像素。骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)包括骨密度(BMD)、組織骨密度(TMD)、骨小梁數(shù)目(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨體積/總體積(BV/TV)、相對(duì)骨表面(BS/TV)、骨小梁分離度(TBsp)和連接密度(Conn.D)，通過(guò)使用內(nèi)置軟件進(jìn)行定量分析來(lái)確定連接密度(connection density，Conn.D)。

待影像學(xué)檢測(cè)完畢后，進(jìn)行三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)。在進(jìn)行測(cè)試時(shí)，股骨水平放置在機(jī)器的表面上，探頭慢慢地放下。加載方向垂直于實(shí)驗(yàn)臺(tái)，作用在骨的中心軸上，加載速度為2 mm/min。通過(guò)與試驗(yàn)機(jī)連接的計(jì)算機(jī)專用軟件自動(dòng)記錄載荷-位移曲線，得到最大載荷和彈性模量。

將股骨均勻液氮中冷凍并在RIPA緩沖液裂解，然后等份裝載(20 mg蛋白質(zhì))，使用SDS-PAGE(4%堆積，12%流動(dòng)凝膠在120 V時(shí)90～110 min)分離蛋白質(zhì)。將蛋白質(zhì)在100 V下轉(zhuǎn)移至0.2 mm的聚偏二氟乙烯膜(目錄號(hào)162e0177，Bio-Rad實(shí)驗(yàn)室，赫拉克勒斯，加利福尼亞)上60 min。使用了以下一抗： BMP-2(1∶2000，Cell Signalling)，b-catenin(1∶750，Santa Cruz BT)，OPG(1∶500，Santa Cruz BT)和RANKL(1∶500，Santa Cruz BT)，然后進(jìn)行適當(dāng)處理二抗。化學(xué)發(fā)光HRP底物檢測(cè)抗原抗體復(fù)合物，并使用LI-COR C-Digit印跡掃描儀進(jìn)行可視化，并使用相關(guān)的Image Studio 5.2軟件(LI-COR Biosciences，NE，美國(guó))進(jìn)行光密度分析。Ponceau S(Biorad)用于控制總蛋白含量，β-actin作內(nèi)部對(duì)照。

隨后使用試劑盒檢測(cè)大鼠血清TRACP、CTX-I、ALP和OC水平，并嚴(yán)格按照生產(chǎn)廠家在試劑盒上的說(shuō)明進(jìn)行操作。ELISA試劑盒檢測(cè)血清TRACP、CTX-I、ALP和OC水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠體重

實(shí)驗(yàn)期間未發(fā)現(xiàn)大鼠死亡；治療12周后，大鼠的體重發(fā)生變化，DEX組大鼠體重[(436.11±7.87) g]明顯低于CON組[(356.44±8.98) g](P<0.05)；而DEX+TTS組[(371.29±8.66) g]與DEX組相比，體重?zé)o顯著差異(P>0.05)。

2.2 Micro-CT分析結(jié)果

股骨的二維矢狀位圖像見(jiàn)圖1，股骨的微觀參數(shù)見(jiàn)表1。DEX組左側(cè)股骨BMD、TMD、Conn.D、Tb.N、Tb.Th、Tb.p、BS/TV較對(duì)照組明顯降低(P<0.05)。DEX+TTS組左側(cè)股骨BMD、Conn.D、Tb.Th均明顯高于DEX組(P<0.05)，DEX+TTS組左側(cè)股骨BMD、Conn.D、Tb.Th明顯高于DEX組(P<0.05)。

圖1 各組大鼠治療12周后左股骨的Micro-CT二維矢狀位圖 A：CON組，B：DEX組，C：DEX +TTS組Fig.1 Two-dimensional sagittal images of the left femur in micro-CT after 12 weeks of treatment in each group of rats. A: Con group, B: DEX group, C: DEX+TTS group.

表1 各組大鼠左股骨的Micro-CT檢測(cè)結(jié)果Table 1 Micro-CT results of the left femur of rats in each group

2.3 股骨的生物力學(xué)變化

股骨三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)表明，DEX+TTS組的最大載荷和彈性模量均高于DEX組，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表2)，DEX+TTS組的最大載荷和彈性模量均高于DEX組(P<0.05)。

表2 各組大鼠右股骨的三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)結(jié)果

2.4 血清ALP、OC、TRACP和CTX-I的變化

與CON組比較，DEX組血清骨形成指標(biāo)(ALP、OC)顯著降低(P<0.05)，骨吸收指標(biāo)TRACP、CTX-I顯著升高(P<0.05)。與DEX組比較，DEX+TTS組血清骨形成指標(biāo)ALP和OC顯著升高(P<0.05)，骨吸收指標(biāo)TRACP和CTX-I顯著降低(P<0.05)。DEX+TTS組血清ALP和OC顯著高于DEX組(P<0.05)，而骨吸收指標(biāo)TRACP和CTX-I則顯著低于DEX組(P<0.05)，詳見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠的ALP、CTX-1、OC和ACP結(jié)果Table 3 Results of ALP, CTX-I, OC, and ACP of rats in each group

2.5 WB檢測(cè)結(jié)果

股骨BMP-2、OPG和RANKL的表達(dá)如圖2所示，和CON比較，DEX組大鼠的BMP-2和OPG顯著降低，而RANKL表達(dá)明顯增加；經(jīng)過(guò)TTS干預(yù)后，DEX+TTS組大鼠BMP-2和OPG顯著增加，而RANKL表達(dá)明顯降低，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 蛋白質(zhì)印跡定量檢測(cè)BMP-2、OPG和RANKL蛋白的表達(dá)Fig.2 The protein expressions of BMP-2, OPG, and RANKL with quantitative Western blotting.注：與CON組比較，*P<0.05；與DEX組比較，#P<0.05。

3 討論

骨質(zhì)疏松癥是一種發(fā)病率較高的骨代謝性疾病。GIOP在繼發(fā)性骨質(zhì)疏松中首位。研究表明，糖皮質(zhì)激素治療開(kāi)始3個(gè)月內(nèi)，脊椎骨折的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加，12個(gè)月時(shí)達(dá)到高峰。在連續(xù)接受GCS治療的患者中，骨折風(fēng)險(xiǎn)與每日口服GCS劑量密切相關(guān)[8]。因此，骨質(zhì)疏松癥越來(lái)越受到研究者的關(guān)注。

越來(lái)越多的證據(jù)表明，過(guò)多的氧化應(yīng)激對(duì)骨代謝(骨形成<骨吸收)[9]、微結(jié)構(gòu)退變和骨丟失有不利影響，顯著增加了骨脆性和骨折易感性[10]。一半的絕經(jīng)后婦女將經(jīng)歷骨質(zhì)疏松癥導(dǎo)致的骨折[10]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織，估計(jì)在美國(guó)大約有2 200萬(wàn)婦女出現(xiàn)低骨量(稱為骨量減少癥)和800萬(wàn)婦女有嚴(yán)重的骨質(zhì)丟失(稱為骨質(zhì)疏松癥)[11]。盡管抗骨質(zhì)疏松癥療法(例如激素療法、雙膦酸鹽、甲狀旁腺激素)的使用已經(jīng)被廣泛接受，它們?cè)陂L(zhǎng)期使用后的遺傳副作用引起了一些關(guān)注[11]。因此，尋找替代的天然化合物來(lái)緩解絕經(jīng)后婦女骨惡化和骨丟失的進(jìn)展已成為一個(gè)高度公共衛(wèi)生優(yōu)先事項(xiàng)。研究表明，TTS保護(hù)成骨細(xì)胞免受脂質(zhì)過(guò)氧化和抑制破骨細(xì)胞分化，破骨細(xì)胞成熟和骨吸收活性通過(guò)抑制核因子κB(NF-kB)和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶的激活[12]。這些結(jié)果表明TTS可能在抗骨質(zhì)疏松癥領(lǐng)域有著獨(dú)特的影響。

本研究中使用GCs制備骨質(zhì)疏松模型，而GCs對(duì)大鼠骨量的影響依賴于大鼠的年齡[13]和GC給藥的劑量方案[14]。本研究發(fā)現(xiàn)DEX組大鼠的體重顯著低于CON組。本研究結(jié)果與先前研究[14-15]的結(jié)果類似，已知用地塞米松治療成年雌性大鼠(大約3個(gè)月)可在治療期間誘導(dǎo)體重和食物攝入顯著減少。在本研究中，使用Micro-CT發(fā)現(xiàn)DEX組大鼠股骨的骨密度顯著下降，表明建模是成功的。用TTS治療GIOP大鼠后，BV/TV、Tb.N、Tb.Th和Conn.D與DEX組相比呈增加趨勢(shì)，表明骨小梁的微觀結(jié)構(gòu)得到改善。骨生物力學(xué)中的骨結(jié)構(gòu)力學(xué)指標(biāo)測(cè)試是了解骨質(zhì)疏松性骨折風(fēng)險(xiǎn)的最直接方法，它也是骨強(qiáng)度、骨骼結(jié)構(gòu)和骨量的綜合表現(xiàn)。然而，觀察骨組織形態(tài)學(xué)和單獨(dú)測(cè)量骨密度不能完全反映骨質(zhì)量。使用機(jī)械性質(zhì)的干預(yù)效果的評(píng)估是治療骨質(zhì)疏松癥的其他方法不可替代的。在本研究中，三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)表明，DEX組的最大載荷和彈性模量顯著低于對(duì)照組，TTS治療可顯著提高大鼠骨組織的抗折強(qiáng)度。這些發(fā)現(xiàn)與先前研究的結(jié)果相似，即缺乏GLP-1受體的大鼠的骨生物力學(xué)指標(biāo)顯著下降[16]。血清CTX-I是骨骼中I型膠原的降解產(chǎn)物，檢測(cè)血清CTX-I含量可以特異性地反映破骨細(xì)胞的吸收活性。TRACP主要由破骨細(xì)胞釋放的非膠原蛋白產(chǎn)生，破骨細(xì)胞與膠原代謝物一起分泌在細(xì)胞外。因此，TRACP和CTX-1水平與骨吸收呈正相關(guān)。成骨細(xì)胞可以分泌骨特異性ALP，ALP是總ALP的重要組成部分，可以反映骨形成的狀態(tài)。OC是骨基質(zhì)中最豐富的標(biāo)志物，其由成骨細(xì)胞釋放到細(xì)胞外，反映骨形成的狀態(tài)。此外，骨形成標(biāo)志物包括OC、ALP和膠原蛋白1的表達(dá)也顯著增加。本研究的結(jié)果表明TTS可增加成骨細(xì)胞活性來(lái)促進(jìn)GIOP大鼠的骨形成來(lái)保護(hù)骨組織。

經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)途徑是眾所周知的合成代謝級(jí)聯(lián)反應(yīng)，可促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖，成骨細(xì)胞的分化以及成骨細(xì)胞產(chǎn)生骨保護(hù)素(OPG)的作用[17]。OPG是核因子κB配體(RANKL)受體激活劑的誘餌受體，RANKL是破骨細(xì)胞生成的關(guān)鍵激活劑[17]。因此，激活經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)途徑可導(dǎo)致骨骼中OPG/RANKL比率增加，并使平衡朝成骨細(xì)胞生成傾斜，最終轉(zhuǎn)移骨骼更新，有利于骨骼形成而不是骨骼吸收[17]。本研究通過(guò)WB檢測(cè)骨組織BMP-2、OPG和RANKL的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TTS治療后的大鼠骨組織BMP-2和OPG表達(dá)顯著增加，而RANKL的表達(dá)顯著降低，這表明TTS治療后可以激活Wnt/β-catenin信號(hào)來(lái)促進(jìn)成骨；OC、ALP和膠原蛋白1水平顯著增加更好地體現(xiàn)這點(diǎn)。

本研究有其局限性，首先本研究TTS劑量比較單一，需要考慮劑量對(duì)結(jié)果的影響；其次，本研究使用的激素誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松模型，是否適合其他因素誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥模型就不得而知；最后就是研究設(shè)計(jì)的時(shí)間較短，大鼠數(shù)量也較少。

總之，TTS可以通過(guò)減少骨吸收和促進(jìn)骨形成及激活Wnt/β-catenin信號(hào)來(lái)改善骨密度、骨微觀結(jié)構(gòu)和骨強(qiáng)度以及治療GIOP。