曾國勇 曾祥俊 葉 瑾
1.江西省贛州市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,江西贛州 341000;2.江西省贛州市人民醫(yī)院腎內(nèi)科,江西贛州 341000
散發(fā)性包涵體肌炎(IBM)是特發(fā)性炎性肌病的一種亞型,老年人下肢近端和手指的個(gè)別屈肌無力是其典型表現(xiàn)。IBM 疾病的臨床進(jìn)展較慢,常規(guī)免疫抑制治療通常效果差,最終可導(dǎo)致嚴(yán)重的殘疾。IBM 的發(fā)病機(jī)理非常復(fù)雜,目前尚未完全了解[1-2]。臨床上,IBM 必須區(qū)別于多發(fā)性肌炎(PM),后者是另一種富含T 細(xì)胞的炎性肌病,表現(xiàn)為彌漫性主要組織相容性復(fù)合體(MHC)-Ⅰ表達(dá)上調(diào)[3],因?yàn)閮煞N疾病對(duì)皮質(zhì)類固醇激素治療的反應(yīng)明顯不同,PM 通常效果良好,IBM 則幾乎沒有反應(yīng)。臨床常出現(xiàn)一部分IBM 患者被誤診為慢性PM 的情況,并接受了不必要的類固醇治療[4]。鑒于當(dāng)前診斷標(biāo)準(zhǔn)的局限性,研究者們做出了巨大的努力去發(fā)現(xiàn)具有更高靈敏度的IBM 免疫組織化學(xué)標(biāo)志物。目前蛋白質(zhì)聚集被認(rèn)為在IBM 發(fā)病機(jī)制中具有核心作用,因此人們認(rèn)為尋找與去除異常聚集蛋白有關(guān)的標(biāo)志物可能用于鑒別IBM 和PM[5]。研究顯示,鑲邊空泡(RVs)的形成都與自噬的損害存在一定相關(guān)性,自噬障礙導(dǎo)致自噬體積累積,這可能與自噬蛋白LC3、TDP-43 有關(guān)[6]。因此,本研究通過免疫組化法、Western blot 法等分析PM 組和IBM 組骨骼肌中TDP-43、LC3 陽性表達(dá)率及蛋白含量的差異性,進(jìn)而探究TDP-43、LC3 在PM 及IBM 中的表達(dá)及其作用。
選取2018年3月~2019年9月我院收治的PM(26 例)、IBM(26 例)患者的中等受累肌肉進(jìn)行活檢,并避開肌電圖穿刺點(diǎn),同時(shí)保證動(dòng)作輕柔未過度牽拉或擠壓所取的肌肉組織,大小約0.5 cm×1.0 cm×0.5 cm,并快速冷凍。將PM 患者取出肌肉組織作為PM 組,將IBM 患者取出肌肉組織作為IBM 組。PM 組和IBM組患者性別、肌肉組織選取部位、年齡、病程等一般資料比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1),具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn),參與研究的患者均簽署知情同意書。
表1 兩組一般資料的比較
臺(tái)式低速離心機(jī)(長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司,型號(hào):TD4K);萊卡冰凍切片機(jī)(北京海天友誠科技有限公司,型號(hào):CM1850);全自動(dòng)免疫組化儀(上海永創(chuàng)醫(yī)療器械有限公司,型號(hào):MY-2300)。
將肌肉組織進(jìn)行常規(guī)脫蠟及水化,加入2%甲醛溶液,固定,乙醇脫水,石蠟切片,切成長寬高為1.5 μm×1.5 μm×1.5 μm 的塊狀,沖洗,室溫封閉,滴加一抗,37℃放置30~40 min,沖洗,滴加生物素化二抗(二抗試劑盒)37℃放置40 min,沖洗,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色,水洗終止反應(yīng),蘇木精復(fù)染,分化,梯度酒精脫水干燥,中性樹膠封固。
洗凈烘干電泳槽及其他部件,制備12%分離膠,制作1 cm 的水層。將電泳裝置放置聚膠1 h,配制灌注成層膠。90 V 電泳,溴酚藍(lán)倒入分離膠,取出凝膠,放入聚偏二氟乙烯(PVDF)膜5~10 s。冰浴,雜交液稀釋一抗,β-actin:1∶1000。清洗3 次,把PVDF 膜放入對(duì)應(yīng)的二抗中常溫孵育1.5 h,輕輕晃動(dòng)。加入加入電化學(xué)發(fā)光(ECL)溶液和B 混合液約1 min,PVDF 膜檢測(cè)采用自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像分析。
采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間兩兩比較采用t 檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù)表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn);P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
IBM組肌肉組織中TDP-43、LC3 陽性表達(dá)高,PM組肌肉組織中TDP-43、LC3 陽性表達(dá)量低,兩組比較,IBM 組肌肉組織中TDP-43、LC3 陽性表達(dá)明顯高于PM 組(圖1,封四)。
圖1 兩組肌肉組織中TDP-43、LC3 陽性表達(dá)(蘇木精染色,400×)
Western blot 法結(jié)果顯示:IBM 組肌肉組織中TDP-43、LC3 蛋白含量高于PM 組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2)。
圖2 兩組肌肉組織中TDP-43、LC3 蛋白含量
IBM 與PM 由于對(duì)免疫抑制治療的效果明顯不同,且預(yù)后不同,因此病理診斷至關(guān)重要,特別是專家發(fā)現(xiàn)兩類患者臨床評(píng)估結(jié)果類似時(shí)。當(dāng)然,IBM 與PM 存在明顯的組織學(xué)重疊導(dǎo)致病理上的鑒別也很困難[7-8]。本研究定量評(píng)估了兩種免疫組織化學(xué)標(biāo)志物L(fēng)C3、TDP-4 在區(qū)分IBM 和PM 診斷方面的價(jià)值,結(jié)果顯示IBM 組肌肉組織中TDP-43、LC3 陽性表達(dá)更高,PM 組肌肉組織中TDP-43、LC3 陽性表達(dá)量更低,IBM 組肌肉組織中TDP-43、LC3 陽性表達(dá)高于PM 組(P<0.05)。Western blot 法檢測(cè)結(jié)果顯示,PM 組肌肉組織內(nèi)的TDP-43、LC3 蛋白含量最低,IBM 組肌肉組織內(nèi)的TDP-43、LC3 蛋白含量最高,IBM 組肌肉組織中TDP-43、LC3 蛋白含量高于PM 組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。IBM 發(fā)病機(jī)制的一種模型表明,細(xì)胞質(zhì)蛋白的積累是逐步發(fā)生的,首先發(fā)生自噬通量受損(通過LC3 累積檢測(cè)到),隨后發(fā)生TDP-43 和其他錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)的聚集,進(jìn)而出現(xiàn)IBM,病情逐步加重[9]。研究發(fā)現(xiàn),TDP-43、LC3 表達(dá)水平與IBM 的形成及增長有顯著相關(guān)性,在患者體內(nèi)TDP-43、LC3陽性數(shù)量越多則病情越嚴(yán)重[10-11]。實(shí)驗(yàn)得出,IBM患者TDP-43、LC3 陽性表達(dá)率顯著高于健康人群,得出TDP-43、LC3 可能參與了IBM 的發(fā)生及發(fā)展[12]。研究顯示,在PM 患者體內(nèi),TDP-43、LC3 表達(dá)水平均比健康人體高[13]。研究人員建議采用免疫組化法區(qū)分IBM、PM,在肌肉活檢中使用LC3 面板和TDP-43 抗體:LC3 臨界值<14% FS 可以幫助排除IBM,而TDP-43>7% FS 強(qiáng)烈支持IBM 診斷。由于TDP-43>7%FS 對(duì)IBM 診斷具有很高的特異性,因此TDP-43 免疫組化可以在臨床病史無法區(qū)分或病情不典型的情況下使用[14]。同時(shí),有學(xué)者研究得出,IBM 與PM 患者體內(nèi)TDP-43、LC3 表達(dá)水平不相同,且IBM患者體內(nèi)TDP-43、LC3 表達(dá)水平明顯較高,因此,臨床中可采用鑒別TDP-43、LC3 的方法來區(qū)分兩種疾病[15],與本研究結(jié)論一致。
綜上所述,TDP-43、LC3 在IBM 骨骼肌標(biāo)本中更易表達(dá),可作為與PM 鑒別診斷的指標(biāo)之一。