覃衛(wèi)娟 李玉蝶 黃嬌華

南寧市婦幼保健院檢驗(yàn)科，廣西南寧 530011

聽(tīng)力受損是最常見(jiàn)的出生缺陷，影響著全世界7千萬(wàn)人口。根據(jù)國(guó)內(nèi)外大量研究表明50%以上的聽(tīng)力損失是遺傳因素導(dǎo)致[1]，遺傳性耳聾主要的遺傳模式是常染色體隱性遺傳，其次是常染色體顯性遺傳。隨著測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用，大量的常染色體顯性遺傳和隱性遺傳基因被發(fā)現(xiàn)與耳聾相關(guān)，GJB3在我國(guó)主要的突變位點(diǎn)是c.538C＞T，而SLC26A4基因突變位點(diǎn)主要是c.919-2A＞G[2]。SLC26A4基因突變是引起遺傳性耳聾Pendred綜合征（pendred syndrome，PDS）/非綜合征性前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大（nonsyndromic enlarged vestibular aqueduct，NSEVA）的重要基因。PDS/NSEVA是感覺(jué)神經(jīng)性聽(tīng)力損失（sensorineural hearing loss，SNHL）譜系，通常是先天性，聽(tīng)力損傷從嚴(yán)重到極其嚴(yán)重，同時(shí)有前庭功能障礙或伴有顳骨異常，在兒童晚期至成年早期PDS會(huì)出現(xiàn)甲狀腺功能正常性甲狀腺腫的發(fā)展，而NSEVA則不包括[3]。SLC26A4基因突變是常染色體遺傳性耳聾的第二大遺傳因素，耳聾基因變體數(shù)據(jù)庫(kù)顯示超過(guò)400個(gè)與耳聾相關(guān)的SLC26A4基因致病性位點(diǎn)已經(jīng)被報(bào)道[4]。SLC26A4基因突變具有高度的異質(zhì)性，SLC26A4在我國(guó)主要的致病突變位點(diǎn)是c.919-2A＞G和c.2168A＞G，而在日本、韓國(guó)是c.2168A＞G突變[5]，不同的位點(diǎn)在各個(gè)區(qū)域和民族之間突變有顯著差異，為了篩查適合本地區(qū)的耳聾基因突變位點(diǎn)，了解本地區(qū)壯族孕期女性GJB3和SLC26A4基因突變攜帶情況，本研究對(duì)GJB3和SLC26A4基因進(jìn)行測(cè)序，為產(chǎn)前篩查、產(chǎn)前診斷、新生兒耳聾基因篩查提供遺傳咨詢數(shù)據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年6～12月來(lái)自南寧市婦幼保健院產(chǎn)前門(mén)診聽(tīng)力正常的402例壯族孕期女性，在知情同意下抽取孕婦外周血提取DNA，對(duì)耳聾基因GJB3、SLC26A4進(jìn)行全基因測(cè)序。本研究遵循醫(yī)學(xué)倫理要求，并取得了南寧市婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的同意。

1.2 檢測(cè)方法

使用測(cè)序法檢測(cè)402例孕婦GJB3和SLC26A4基因。（1）文庫(kù)構(gòu)建：根據(jù)樣品量計(jì)算需配制的PCR擴(kuò)增體系，選取目的片段擴(kuò)增程序進(jìn)行擴(kuò)增；（2）文庫(kù)純化；（3）文庫(kù)質(zhì)檢：參照KAPA Library Quantification KitIllumina? platforms TDS對(duì)文庫(kù)進(jìn)行定量；（4）測(cè)序：將文庫(kù)pooling，變性最終以1.8pM的文庫(kù)上機(jī)測(cè)序。生物信息學(xué)分析：利用GATK工具判讀SNP和Indel位點(diǎn)；利用Snpeff工具注釋SNP，最后利用dbSNP、千人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)、HGMD等數(shù)據(jù)庫(kù)、clinvar數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行注釋和比較分析。

1.3 分類(lèi)依據(jù)

根據(jù)耳聾基因變體數(shù)據(jù)庫(kù)（http://deafnessvariationdatabase.org/）對(duì)突變位點(diǎn)進(jìn)行分類(lèi)，分為良性、致病性、可能良性、重要性不明確、新發(fā)現(xiàn)位點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1 檢測(cè)結(jié)果

對(duì)402例壯族孕期女性進(jìn)行耳聾基因GJB3和SLC26A4測(cè)序發(fā)現(xiàn)，163例攜帶有耳聾基因突變，其中GJB3 和SLC26A4分別為99例和64例，攜帶率較高為40.55%（163/402）。其中攜帶致病性突變位點(diǎn)21例，GJB3 和SLC26A4分別為2和19例，攜帶率為5.22%（21/402）。GJB3和SLC26A4復(fù)合突變21例。

2.2 GJB3測(cè)序結(jié)果

對(duì)402例壯族孕期女性進(jìn)行GJB3耳聾基因測(cè)序，共發(fā)現(xiàn)99例孕期女性攜帶GJB3突變，突變攜帶率為24.63%（99/402），共9個(gè)突變位點(diǎn)，突變等位基因數(shù)104個(gè)；其中5個(gè)是良性突變位點(diǎn)，重要性不明確位點(diǎn)2個(gè)，致病性位點(diǎn)2個(gè)。本研究中GJB3常見(jiàn)的突變位點(diǎn)是c.357C＞T和c.53G＞A分別占104個(gè)總突變等位基因的74.04%和14.42%，均為良性突變；GJB3重要性不明確突變位點(diǎn)2個(gè)，分別為c.474G＞A位點(diǎn)2例，c.131G＞A位點(diǎn)1例；在我國(guó)c.538C＞T和 c.547G＞A位點(diǎn)為致病性位點(diǎn)，402例孕期女性中各檢出1例，均為雜合突變，GJB3致病位點(diǎn)攜帶率為0.50%（2/402）。見(jiàn)表1。

表1 402例孕期女性GJB3基因測(cè)序結(jié)果分析

2.3 SLC26A4測(cè)序結(jié)果

402例壯族孕期女性SLC26A4基因檢測(cè)出64例突變，攜帶率為15.92%（64/402），共33個(gè)突變位點(diǎn),突變等位基因數(shù)73個(gè)。其中致病性位點(diǎn)共6個(gè)，共檢出突變19例，等位基因數(shù)19個(gè)分別為c.1983C＞A、c.1547dup、c.754T＞C、c.1905G＞A、c.919-2A＞G、c.678T＞C，致病性位點(diǎn)攜帶率為4.73%（19/402），占突變等位基因數(shù)26.03% （19/73）；檢出率前三位分別是c.1983C＞A位點(diǎn)5例，c.1547dup位點(diǎn)5例，c.754T＞C位點(diǎn)4例，分別占總突變等位基因的6.85%，6.85%，5.48%；而常見(jiàn)的突變位點(diǎn)c.919-2A＞G僅2例；本研究還檢出2個(gè)（2.74%）可能良性位點(diǎn), 等位基因數(shù)2個(gè)（2.74%)：c.818C＞T、c.16G＞A；5個(gè)良性位點(diǎn)，等位基因數(shù)24個(gè)（32.88%）：c.69C＞A、c.2236-25T＞A、c.919-18T＞G、c.1707+76G＞C、c.1826T＞G；13個(gè)重要性不明確位點(diǎn)，等位基因數(shù)20個(gè)（27.40%）及7個(gè)新發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)，等位基因數(shù)8個(gè)（10.96%）。4類(lèi)突變位點(diǎn)中致病性位點(diǎn)、良性突變位點(diǎn)和重要不明確位點(diǎn)所占比例接近，可能良性突變位點(diǎn)與新發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)所占比例較少。33個(gè)突變位點(diǎn)中最常見(jiàn)的是c.69C＞A良性位點(diǎn)，等位基因數(shù)13個(gè)，占總突變等位基因數(shù)的17.81%，其他的突變等位基因位點(diǎn)所占比例均為6.85%及以下。見(jiàn)表2。

表2 402例孕期女性SLC26A4基因測(cè)序結(jié)果分析

2.4 GJB3和SLC26A4基因復(fù)合突變

402例壯族孕期女性中發(fā)現(xiàn)有21例攜帶GJB3和SLC26A4基因復(fù)合突變，攜帶率為5.22%。21例復(fù)合突變中共有18種基因型，攜帶有致病性位點(diǎn)的基因型有5例，分別為c.357C＞T/c.754T＞C、c.357C＞T/c.1905G＞A、c.357C＞T/c.1983C＞A，其他15種基因型未攜帶有致病性突變位點(diǎn)，但因是GJB3與SLC26A4復(fù)合突變，故其致病性未知。見(jiàn)表3。

表3 GJB3和SLC26A4基因復(fù)合突變結(jié)果分析

3 討論

GJB3基因編碼縫隙連接蛋白CX31，位于1p34號(hào)染色體上，有一個(gè)編碼外顯子，c.547G＞A和c.538C＞T位點(diǎn)位于該編碼區(qū)上。目前在人類(lèi)耳聾基因變體數(shù)據(jù)庫(kù)記錄的GJB3介導(dǎo)的常染色體隱性遺傳非綜合征性耳聾上的突變位點(diǎn)僅8個(gè)，本研究中未檢出，c.547G＞A和c.538C＞T位點(diǎn)在該數(shù)據(jù)庫(kù)中分類(lèi)屬于重要性不明確，本研究中分類(lèi)為致病性位點(diǎn)。c.547G＞A和c.538C＞T位點(diǎn)突變?cè)缙诒徽J(rèn)為其可導(dǎo)致遺傳性高頻聽(tīng)力損失[6]，然而這兩個(gè)位點(diǎn)的致病性一直存在爭(zhēng)議[7-8]，目前為止并沒(méi)有系統(tǒng)的耳聾基因系研究證明這兩個(gè)位點(diǎn)突變與耳聾的相關(guān)性，更有報(bào)道GJB3基因c.538C＞T位點(diǎn)突變與聽(tīng)力損失無(wú)關(guān)[7]。早期在我國(guó)這兩個(gè)位點(diǎn)被認(rèn)為是致病的，然而國(guó)內(nèi)大量的研究報(bào)道不管是在健康人群還是在聽(tīng)力障礙人群中GJB3基因c.538C＞T和c.547G＞A位點(diǎn)突變率均很低，在廣西也并非耳聾基因突變位點(diǎn)，壯族人群中的c.547G＞A和c.538C＞T突變攜帶率極低。本研究中402例壯族孕期女性共檢出9個(gè)突變位點(diǎn)，其中c.538C＞T和c.547G＞A位點(diǎn)突變各檢出1例，GJB3致聾性突變發(fā)病率很低，并非本地區(qū)壯族孕期女性的耳聾基因突變熱點(diǎn)。

SLC26A4基因編碼一個(gè)跨膜分子蛋白，該蛋白在氯化物、碘化物、碳酸氫鹽和甲酸鹽的轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮重要作用，SLC26A4致病性突變產(chǎn)物會(huì)導(dǎo)致該蛋白部分或完全失去活性從而引起Pendred綜合征/非綜合征性前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大（PDS/NSEVA）[3]。PDS/NSEVA以常染色體隱性遺傳方式遺傳，在SLC26A4雙等位基因致病性變異的家族受孕時(shí)受累個(gè)體的每個(gè)同胞兄弟姐妹受累的發(fā)生率為25%，成為無(wú)癥狀攜帶者的幾率為50%，未受累且不是攜帶者的發(fā)生率為25%[9]。當(dāng)已知家族有SLC26A4致病性突變時(shí)，對(duì)高危家族成員進(jìn)行攜帶者檢測(cè)、對(duì)高危妊娠進(jìn)行產(chǎn)前篩查和植入前基因診斷是很有必要的。SLC26A4基因突變具有高度異質(zhì)性，在我國(guó)主要是c.919-2A＞G突變?yōu)橹?，其次為c.2168A＞G[10]；而日本韓國(guó)主要是c.2168A＞G為主[5，11]；歐美白人主要以c.1246A＞C、c.412G＞T、c.707T＞c為主[12]。考慮到SLC26A4基因突變不同區(qū)域種族遺傳的異質(zhì)性，本研究對(duì)402例壯族孕期女性進(jìn)行SLC26A4全基因測(cè)序，旨在發(fā)現(xiàn)適合本地區(qū)的突變位點(diǎn)，增加本地區(qū)的突變譜。本研究結(jié)果提示，在402例壯族孕期女性中，SLC26A4基因常見(jiàn)的致病突變位點(diǎn)是c.1983C＞A位點(diǎn)5例，c.1547dup位點(diǎn)5例，c.754T＞C位點(diǎn)4例，c.1905G＞A位點(diǎn)2例，c.919-2A＞G位點(diǎn)2例和c.678T＞C位點(diǎn)1例，共6個(gè)位點(diǎn)19例，攜帶率為4.73%（19/402），而我國(guó)常見(jiàn)的突變位點(diǎn)c.919-2A＞G和c.2168A＞G在本地區(qū)并非突變位點(diǎn)。本研究中c.1983C＞A和c.1547dup位點(diǎn)已在我國(guó)的EVA患者中檢出[13-14]；c.754T＞C突變位點(diǎn)的致病性已在EVA患者列隊(duì)中有報(bào)道[10，15]，在我國(guó)新生兒攜帶率約0.14%[16]，本研究中檢出率為1.00%，可能是本研究樣本數(shù)有限；而檢出率較低的c.1905G＞A和c.678T＞C位點(diǎn)在我國(guó)的EVA患者中已有報(bào)道[13]。本研究通過(guò)對(duì)SLC26A4進(jìn)行基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)，廣西南寧市壯族孕期女性常見(jiàn)的突變位點(diǎn)為c.1983C＞A、c.1547dup、c.754T＞C、c.1905G＞A、c.919-2A＞G和c.678T＞C，與國(guó)內(nèi)其他地區(qū)有顯著差異，可能是其他地區(qū)未檢測(cè)以上幾個(gè)位點(diǎn)，也可能是本研究例數(shù)有限。

本 研 究 共 檢 出21例GJB3與SLC26A4復(fù)合雜合突變，攜帶率為5.22%；其中有5例攜帶SLC26A4致病性突變位點(diǎn)，攜帶率為1.24%。兩個(gè)基因復(fù)合突變對(duì)耳聾的致病作用有待進(jìn)一步研究，在健康孕期女性中篩查出此類(lèi)復(fù)合突變建議進(jìn)行遺傳咨詢。

綜上所述，南寧市壯族孕期女性攜帶GJB3突變較低，并非本地區(qū)壯族孕期女性的耳聾基因突變位點(diǎn)；南寧市壯族孕期女性SLC26A4突變較高，突變譜具有多樣性，常見(jiàn)致病突變位點(diǎn)為c.1983C＞A、c.1547dup、c.754T＞C、c.1905G＞A、c.919-2A＞G和c.678T＞C；壯族孕期女性GJB3與SLC26A4復(fù)合雜合突變對(duì)耳聾的致病作用有待進(jìn)一步研究。因此對(duì)南寧市壯族孕期女性進(jìn)行耳聾基因檢測(cè)時(shí)可增加篩查SLC26A4基因以上突變位點(diǎn)，指導(dǎo)優(yōu)生優(yōu)育。