李超明， 張春寧， 李明堯， 林華明

南方醫(yī)科大學(xué)附屬茂名市人民醫(yī)院腫瘤一科，茂名 525000

肺癌(lung carcinoma，LC)是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因[1]，其中非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung carcinoma，NSCLC)占全部肺癌的80%[2]。隨著早期診斷和治療方法的進(jìn)步，早期NSCLC生存率顯著提高，但晚期NSCLC預(yù)后仍不盡人意，5年生存率低于15%[3]。因此，迫切需要尋找和鑒定新的分子標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，以改善NSCLC患者的臨床結(jié)局[4-5]。致癌轉(zhuǎn)錄因子FOS樣抗原1(FOS-like antigen 1，F(xiàn)OSL1)是FOS家族的成員，是原癌基因KRAS和c-Jun的下游效應(yīng)分子，具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和分化的功能[6]。在體外研究中，發(fā)現(xiàn)胃癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌細(xì)胞系均可檢測(cè)到FOSL1 mRNA異常表達(dá)[7]，胃癌細(xì)胞中FOSL1高表達(dá)可通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/Akt和p53信號(hào)通路而促進(jìn)胃癌進(jìn)展[8]。體外研究已經(jīng)證實(shí)鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系中FOSL1基因高表達(dá)可促進(jìn)癌細(xì)胞增殖和侵襲[9]。在肺癌細(xì)胞系中，發(fā)現(xiàn)FOSL1表達(dá)上調(diào)，并通過(guò)調(diào)節(jié)p53表達(dá)而抑制細(xì)胞凋亡[10]。盡管如此，F(xiàn)OSL1在NSCLC組織中的表達(dá)模式和臨床價(jià)值尚未見報(bào)道。本研究旨在探討NSCLC中FOSL1的表達(dá)，及其與NSCLC患者臨床病理特征間的關(guān)系及預(yù)后價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 患者病理組織標(biāo)本收集

收集2013年1月至2015年1月于南方醫(yī)科大學(xué)附屬茂名市人民醫(yī)院接受肺癌手術(shù)治療的110例NSCLC患者肺癌組織標(biāo)本，經(jīng)甲醛溶液固定、石蠟包埋處理后，所有組織標(biāo)本在納入研究前經(jīng)2位病理醫(yī)師根據(jù)NSCLC病理分期(TNM分期第8版)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行重新確認(rèn)[11]。納入標(biāo)準(zhǔn)：①首次診斷NSCLC且按NCCN指南原則進(jìn)行治療；②患者除NSCLC外，不存在其他部位的惡性腫瘤；③患者有完整的病歷和隨訪資料。排除標(biāo)準(zhǔn)：隨訪資料不全或者失訪者。本研究通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意實(shí)施。共30例患者接受了術(shù)前新輔助化療，術(shù)后患者均按NCCN指南進(jìn)行后續(xù)化療。

1.2 患者臨床資料的收集和隨訪

從患者病例資料中獲得臨床病理數(shù)據(jù)，包括患者性別、年齡、吸煙狀況、腫瘤大小、組織學(xué)類型、腫瘤狀態(tài)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和TNM分期。總生存時(shí)間定義為從手術(shù)到最后一個(gè)隨訪日或患者死亡之間的時(shí)間間隔。無(wú)瘤生存時(shí)間定義為從手術(shù)到首次隨訪發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)或隨訪截止日之間的時(shí)間間隔。每半年隨訪1次，電話或者門診隨訪，隨訪內(nèi)容包括腫瘤復(fù)發(fā)和生存情況等，隨訪截止時(shí)間為2020年2月。

1.3 免疫組化染色

將甲醛溶液固定、石蠟包埋的病理組織制備成4 μm切片，組織切片脫蠟并在梯度乙醇中再水合，通過(guò)在pH 6.0的乙二胺四乙酸緩沖液中煮沸切片3 min行抗原修復(fù)，用3%過(guò)氧化氫作用30 min淬滅內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，使用兔單克隆抗FOSL1抗體(貨號(hào)ab184441，Abcam，英國(guó))在4℃下孵育過(guò)夜，然后與辣根過(guò)氧化物酶綴合的抗兔二抗(Sigma-Aldrich，美國(guó))在37℃溫育30 min，最后使用辣根過(guò)氧化物酶和3，3’-二氨基聯(lián)苯胺色原溶液處理切片并以蘇木精復(fù)染。

1.4 免疫組化評(píng)分

通過(guò)組織切片陽(yáng)性細(xì)胞的密度和染色強(qiáng)度來(lái)確定免疫組織化學(xué)評(píng)分(IHS)，即通過(guò)病理切片中FOSL1染色的陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分與染色強(qiáng)度評(píng)分乘積作為最終半定量評(píng)分。染色強(qiáng)度評(píng)分如下：0分(陰性)，1分(弱陽(yáng)性)，2分(中度陽(yáng)性)和3分(強(qiáng)陽(yáng)性)；FOSL1陽(yáng)性細(xì)胞的百分比評(píng)分如下：1分為0%～，2分為11%～，3分為51%～，4分為81%～。免疫組化總得分理論上從0～12分不等。IHS<4分的標(biāo)本定義為FOSL1低表達(dá)，IHS≥4分的標(biāo)本定義為FOSL1高表達(dá)，F(xiàn)OSL1低表達(dá)組共42例，F(xiàn)OSL1高表達(dá)組共68例。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件(SPSS Inc，Chicago，IL)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。χ2檢驗(yàn)用于檢測(cè)FOSL1表達(dá)與臨床病理變量的相關(guān)性。使用Kaplan-Meier方法繪制生存曲線，并使用對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)進(jìn)行比較。Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型用于影響預(yù)后的多變量分析。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC組織中FOSL1表達(dá)情況

NSCLC組織樣品中FOSL1蛋白陽(yáng)性染色主要定位于NSCLC細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中。在110個(gè)樣本中61.8%(68/110)FOSL1高表達(dá)，38.2%(42/110)FOSL1低表達(dá)。NSCLC組織中FOSL1典型免疫組化染色見圖1。

A：FOSL1低表達(dá)；B：FOSL1高表達(dá)圖1 NSCLC組織中FOSL1表達(dá)(免疫組化染色，×400)Fig.1 FOSL1 expression in non-small cell lung cancer tissues(Immunofluorescence staining，×400)

2.2 NSCLC組織中FOSL1表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

通過(guò)χ2檢驗(yàn)分析FOSL1表達(dá)與NSCLC臨床病理特征間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)癌組織中的FOSL1表達(dá)水平與TNM分期(P=0.022)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.01)顯著相關(guān)，與性別、年齡、腫瘤大小、吸煙狀態(tài)、組織學(xué)類型、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、新輔助化療及術(shù)后化療無(wú)相關(guān)性，見表1。

表1 NSCLC患者癌組織中FOSL1表達(dá)與 臨床病理因素的關(guān)系[n(%)]Table 1 Association between clinicopathological factors and FOSL1 expression in NSCLC patients[n(%)]

2.3 NSCLC患者癌組織中FOSL1表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

通過(guò)繪制FOSL1高表達(dá)和低表達(dá)組生存曲線評(píng)估FOSL1對(duì)NSCLC患者的預(yù)后價(jià)值。FOSL1高表達(dá)組患者無(wú)瘤生存率和總生存率均顯著低于FOSL1低表達(dá)患者(均P<0.01)。FOSL1高表達(dá)組患者5年無(wú)瘤生存率和總生存率分別為19.3%和29.6%，而FOSL1低表達(dá)組患者5年無(wú)瘤生存率和總生存率分別為33.5%和43.5%，見圖2。

圖2 Kaplan-Meier法比較FOSL1高、低表達(dá)組患者無(wú)瘤生存率(A)和總生存率(B)Fig.2Comparison of tumor-free survival(A)and overall survival(B)between high and low FOSL1 expression NSCLC groups by Kaplan-Meier method

2.4 影響NSCLC患者無(wú)瘤生存率的單因素和多因素分析

單因素分析示FOSL1表達(dá)、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響NSCLC患者無(wú)瘤生存率的影響因素；多因素Cox回歸分析顯示，F(xiàn)OSL1表達(dá)、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響NSCLC患者無(wú)瘤生存率的獨(dú)立危險(xiǎn)因子，見表2。

2.5 影響NSCLC患者總生存率的單因素和多因素分析

單因素分析示FOSL1表達(dá)、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移為影響NSCLC患者總生存率的因素；多因素Cox回歸分析顯示，F(xiàn)OSL1表達(dá)、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移為影響NSCLC患者總生存率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，見表3。

表2 影響NSCLC患者無(wú)瘤生存率的單因素和多因素Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型分析Table 2 Cox proportional hazards model analysis of prognostic factors affecting tumor-free survival rate of NSCLC patients

表3 影響NSCLC患者總生存率的單因素和多因素Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型分析Table 3 Cox proportional hazards model analysis of prognostic factors affecting overall survival rate of NSCLC patients

3 討論

肺癌發(fā)病率和死亡率在我國(guó)均居惡性癌癥第1位[12]，且其死亡率高于西方發(fā)達(dá)國(guó)家，死亡人數(shù)也不斷上升，成為我國(guó)居民健康的重要?dú)⑹諿13]。尋找預(yù)測(cè)預(yù)后并作為治療靶標(biāo)的特異性分子標(biāo)志物對(duì)改善NSCLC患者預(yù)后尤為重要[14]。

FOSL1是FOS蛋白家族的重要成員之一，F(xiàn)OS蛋白家族還包括FOS、FOSB和FOSL2等蛋白，均由位于11q13.1的基因編碼，是KRAS和c-Jun 2個(gè)原癌基因的重要下游效應(yīng)蛋白之一[15]。KRAS是人類上皮腫瘤尤其是肺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌的原癌基因[16]，目前尚無(wú)直接抑制KRAS基因的藥物，探索新方法用于抑制KRAS的下游分子以消除KRAS的致癌作用已成為研究的熱點(diǎn)[17]。目前已經(jīng)鑒定FOS等8個(gè)基因在不同組織來(lái)源的突變KRAS腫瘤中過(guò)表達(dá)[7]。探討FOSL1在NSCLC中的表達(dá)和臨床意義可能為NSCLC治療帶來(lái)新希望。

本研究發(fā)現(xiàn)在110例NSCLC病理標(biāo)本中61.8%(68/110)高表達(dá)FOSL1，38.2%(42/118)低表達(dá)FOSL1。最近研究報(bào)道[18]在115例胃腺癌患者中，通過(guò)免疫組化方法檢測(cè)FOSL1表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)FOSL1高表達(dá)69例，低表達(dá)46例，與本研究結(jié)果類似，顯示FOSL1在不同癌癥中存在表達(dá)差異。本研究發(fā)現(xiàn)NSCLC組織中的FOSL1表達(dá)水平與TNM分期(P=0.012)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.01)顯著相關(guān)，與性別、年齡、腫瘤大小、吸煙狀態(tài)、組織學(xué)類型、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及新輔助化療和術(shù)后化療無(wú)關(guān)。研究報(bào)道FOSL1高表達(dá)與TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示FOSL1高表達(dá)與患者疾病嚴(yán)重程度和腫瘤侵襲性密切相關(guān)[19]，上述結(jié)果提示FOSL1高表達(dá)的NSCLC患者，其腫瘤顯示出更高的惡性程度。

本研究通過(guò)Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)FOSL1高表達(dá)的NSCLC患者預(yù)后顯著差于FOSL1低表達(dá)患者，Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析提示FOSL1表達(dá)為影響患者無(wú)瘤生存率和總生存率的獨(dú)立預(yù)后標(biāo)志物。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[18]，在胃腺癌患者中，F(xiàn)OSL1高表達(dá)可作為影響術(shù)后總生存率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[18]。有研究通過(guò)檢索NCBI Gene Expression Omnibus數(shù)據(jù)庫(kù)，檢測(cè)577例結(jié)腸癌病理標(biāo)本中FOSL1表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)FOSL1高表達(dá)是結(jié)直腸癌患者無(wú)瘤生存率獨(dú)立預(yù)測(cè)因素，雖未探討FOSL1表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌患者總生存率的影響，但研究證實(shí)FOSL1高表達(dá)是促進(jìn)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要促進(jìn)分子[20]。

FOSL1高表達(dá)和NSCLC患者不良預(yù)后相關(guān)的機(jī)制尚不清楚，其可能機(jī)制如下：①在KRAS癌基因驅(qū)動(dòng)的肺癌中，研究發(fā)現(xiàn)與正常肺上皮相比，NSCLC組織中FOSL1表達(dá)顯著增加[7]，F(xiàn)OSL1是KRAS下游效應(yīng)分子，突變KRAS和MAPK激活通常促進(jìn)細(xì)胞異常有絲分裂和細(xì)胞增殖[21]，其高表達(dá)可能通過(guò)促進(jìn)癌細(xì)胞增殖而參與NSCLC增殖和進(jìn)展，并影響預(yù)后；②體外研究顯示在前列腺癌細(xì)胞中FOSL1高表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，并促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[22]，而在黑色素瘤細(xì)胞系中也存在類似發(fā)現(xiàn)，即FOSL1高表達(dá)有利于上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程并促進(jìn)癌細(xì)胞脫落[23]；③ FOSL1可能受到非編碼RNA或miRNA調(diào)控而發(fā)生表達(dá)異常，研究顯示，在食管癌中長(zhǎng)鏈非編碼RNA AGAP2-AS1可上調(diào)miRNA-195-5p并抑制FOSL1基因表達(dá)進(jìn)而抑制食管癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力[24]。在NSCLC中，F(xiàn)OSL1通過(guò)何種機(jī)制而影響其預(yù)后尚不清楚，值得進(jìn)一步研究。

本研究存在如下不足：本研究為單中心的回顧性研究，納入病例數(shù)目較少，尚需要多中心大樣本研究來(lái)證實(shí)本研究結(jié)論，同時(shí)，F(xiàn)OSL1影響NSCLC患者預(yù)后的分子機(jī)制尚需要進(jìn)一步研究。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)NSCLC組織中FOSL1高表達(dá)與患者TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；FOSL1高表達(dá)是NSCLC患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可作為預(yù)測(cè)NSCLC預(yù)后的新的分子標(biāo)志物。未來(lái)需要進(jìn)一步探索FOSL1促進(jìn)NSCLC進(jìn)展的具體機(jī)制。