楊艷清， 陳俊偉， 劉遠航， 付 潔， 徐 丹， 江昌艷

武漢市第三醫(yī)院(武漢大學(xué)同仁醫(yī)院)整形外科，武漢 430060

自體顆粒脂肪移植在整形美容外科領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，特別在面部年輕化的治療方面發(fā)揮重要的作用[1-3]。為了促進移植脂肪的存活，臨床上在進行自體顆粒脂肪移植時常常加入脂肪干細胞，即干細胞輔助脂肪移植(cell-assisted lipotransfer，CAL)技術(shù)[4-5]。脂肪干細胞存在于人體多個部位，本研究觀察了分別來自腹部和大腿的脂肪干細胞在體內(nèi)促進移植脂肪存活方面的差異，為臨床選擇脂肪干細胞的獲取部位提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

脂肪組織取自2015年3月至2017年2月在武漢市第三醫(yī)院整形外科行脂肪抽吸術(shù)的女性患者，共14例，包括來自腹部和大腿的脂肪組織標本各7例?；颊吣挲g19～36歲，平均24.28歲。2組患者年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義。上述標本的獲取均征得患者本人知情同意。

雌性裸鼠7只，購自北京華阜康生物科技股份有限公司[動物許可證編號：SCXK(京)2014-0004]，質(zhì)量15～18 g，4周齡。

1.2 人脂肪干細胞的分離和培養(yǎng)

在無菌條件下分別抽吸獲取7例腹部和7例大腿的脂肪組織標本，PBS反復(fù)浸泡沖洗，洗凈標本上的血液。清洗后加入等體積的0.1%Ⅰ型膠原酶，恒溫水浴鍋消化60 min后在低速離心機中以1200 r/min離心6 min。棄除懸浮的脂肪顆粒、脂滴、脂肪細胞和培養(yǎng)液，保留最下層的細胞沉淀。用含有10%胎牛血清(FBS)、1%雙抗(青霉素和鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)液重懸，以1×106/mL的細胞密度接種于75 cm2的培養(yǎng)瓶內(nèi)，然后放入恒溫細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。收集培養(yǎng)的第3代細胞進行流式細胞儀檢測。

1.3 脂肪干細胞輔助脂肪移植模型的制備

收集培養(yǎng)的第3代脂肪干細胞，自體顆粒脂肪均取自腹部。取4周齡雌性裸鼠7只，將裸鼠用2%戊巴比妥鈉按照50 mg/kg進行腹腔注射麻醉，然后利用注射器將細胞注射至裸鼠背部皮下。每只裸鼠移植3個部位，一側(cè)為腹部來源脂肪干細胞輔助脂肪移植組(A組)：將數(shù)量為1×106/mL腹部來源脂肪干細胞混懸于0.2 mL DMEM培養(yǎng)液中，然后與0.3 mL脂肪細胞混合；對稱的另一側(cè)為大腿來源脂肪干細胞輔助脂肪移植組(B組)：將數(shù)量為1×106/mL大腿來源脂肪干細胞混懸于0.2 mL DMEM培養(yǎng)液中，然后與0.3 mL脂肪細胞混合；另外一處(背部尾側(cè)端中線處)為陰性對照組(C組)：0.2 mL DMEM完全培養(yǎng)液與0.3 mL脂肪細胞均勻混合。混合后的細胞按照隨機原則注射于裸鼠腰背區(qū)皮下的3個區(qū)域。

1.4 脂肪移植術(shù)后觀察

脂肪移植術(shù)后3個月，對移植的脂肪組織進行觀察，包括①移植物組織的細胞鑒定：對分離培養(yǎng)的細胞進行油紅O染色觀察；②移植物體積測定：術(shù)后3個月取材，肉眼觀察并測算移植物體積大小(移植物長徑×寬徑×高×π/6)；③濕重測量：沿移植物包膜外分離，完整取出移植物，用電子天平對其進行濕重測定。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 流式細胞儀檢測細胞表面抗原的表達

本實驗選取了FITC熒光素標記的CD13、CD29、CD44、CD45、CD90和CD105單克隆抗體，使用流式細胞儀檢測培養(yǎng)的第3代細胞，結(jié)果顯示，從脂肪組織分離培養(yǎng)的干細胞表達間充質(zhì)細胞表面標記物CD13、CD29、CD44、CD90和CD105，而不表達造血細胞和內(nèi)皮細胞表面標記物CD45(圖1)。

圖1 流式細胞儀檢測脂肪干細胞表面抗原標記物的表達Fig.1 Expression of cell surface CD markers of ADSCs by flow cytometry

2.2 移植物細胞油紅O染色結(jié)果

觀察分離培養(yǎng)獲得的細胞，可見胞質(zhì)內(nèi)有少量微小脂滴形成，細胞油紅O染色后可見脂滴被染成橘紅色(圖2)，符合脂肪細胞的細胞學(xué)特征。

圖2 細胞油紅O染色(×400)Fig.2 Cells stained with oil red O staining(×400)

2.3 大體觀察

術(shù)后3個月，A組脂肪塊體積最大，B組脂肪塊體積次之，C組移植物體積明顯小于其他組(圖3)。其中A組移植物體積平均值為(0.065±0.008)cm3，B組移植物體積平均值為(0.032±0.006)cm3，C組移植物體積平均(0.011±0.004)cm3。實驗組(A組和B組)移植物體積與陰性對照組的差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)，A組與B組兩組間比較，移植物體積差異亦具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 濕重測量

術(shù)后3個月，A組和B脂肪移植物濕重分別為(0.201±0.020)g、(0.146±0.070)g，兩組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

A：腹部來源脂肪干細胞輔助脂肪移植組；B：大腿來源脂肪干細胞輔助脂肪移植組；C：陰性對照組圖3 植入術(shù)后3個月大體觀察圖Fig.3 Gross observation 3 months after implantation

3 討論

Matsumoto等[6]首先提出細胞輔助脂肪移植的概念，脂肪組織來源干細胞在體內(nèi)可促進游離移植脂肪的存活已得到證實[6-7]。干細胞輔助脂肪移植中脂肪干細胞的作用可能包括：可分化為脂肪細胞并促進脂肪組織再生；可分化為血管內(nèi)皮細胞，促進血管生成；可釋放血管生成因子，誘導(dǎo)移植脂肪周圍血管再生等[8-9]。不同部位來源的脂肪干細胞促進血管化的作用不盡相同，前期我們的研究發(fā)現(xiàn)：與來自大腿的脂肪干細胞相比較，來自腹部的脂肪干細胞在向血管內(nèi)皮細胞分化和分泌血管內(nèi)皮細胞生長因子方面有更多的優(yōu)勢，可能更利于新生血管的形成[10]。干細胞輔助脂肪移植技術(shù)也可以改善游離移植脂肪的存活率，脂肪干細胞存在于身體多個部位，不同部位來源的脂肪干細胞在促進體內(nèi)移植脂肪存活方面有無差異性，是本課題研究的重點內(nèi)容。

我們分別分離及培養(yǎng)來自腹部和大腿的脂肪干細胞，利用流式細胞儀檢測，結(jié)果顯示，細胞表面出現(xiàn)間充質(zhì)干細胞特異性標志物CD13、CD29、CD44、CD90和CD105，而不表達造血系的表面標記物CD45，符合間充質(zhì)干細胞的鑒定標準，且由非造血系細胞分化而來。將培養(yǎng)的第3代脂肪干細胞與取自同一人體的腹部顆粒脂肪混合移植于裸鼠腰背部皮下，然后觀察移植物體積和濕重的變化。移植術(shù)后3個月，細胞油紅O染色后可見脂滴被染成橘紅色，符合脂肪細胞的細胞學(xué)特征，說明移植存活的組織為脂肪組織。實驗觀察結(jié)果顯示：實驗組A組(腹部來源脂肪干細胞輔助脂肪移植組)、實驗組B組(大腿來源脂肪干細胞輔助脂肪移植組)和陰性對照組脂肪塊體積分別是(0.065±0.008)cm3、(0.032±0.006)cm3和(0.011±0.004)cm3。實驗組移植物體積明顯大于對照組(均P<0.01)，而A組體積又大于與B組，差異亦具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。A組和B組脂肪移植物濕重分別為(0.201±0.020)g和(0.146±0.070)g，兩組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。上述研究結(jié)果表明脂肪干細胞可以促進移植脂肪的存活，而且來自腹部的脂肪干細胞可能比來自大腿的脂肪干細胞更易促進腹部脂肪顆粒的存活。

我們的研究中不同部位獲取的脂肪干細胞出現(xiàn)促進脂肪存活的差異，這可能與不同部位脂肪干細胞的功能差異有關(guān)。這在一定程度上提示我們，在臨床利用脂肪干細胞輔助脂肪移植技術(shù)時，獲取來自于腹部的脂肪干細胞可能更有利于促進腹部顆粒脂肪的存活。由于本研究采集的顆粒脂肪都來自于腹部，如果取來自于大腿的顆粒脂肪，不同部位脂肪干細胞輔助移植時是否也存在存活率的差異性，以及同一部位脂肪干細胞是否更利于同一部位的顆粒脂肪存活，將是我們下一步要研究的問題。