庹媛媛， 金 皎

貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院兒科血液專科，貴陽 550001

遺傳性血小板功能障礙(inherited platelet function disorders，IPFD)是一種多伴常染色體遺傳的罕見出血性疾病，兒童多見，典型表現(xiàn)為不同程度的出血，以皮膚黏膜出血、月經(jīng)過多、外傷后難以止血多見，伴或不伴血小板減少[1]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，二代測序在臨床的應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)了越來越多與血小板功能有關(guān)的基因突變。其中RASGRP2基因編碼鈣和甘油二酯調(diào)節(jié)鳥嘌呤交換因子Ⅰ(CalDAG-GEFⅠ)，參與血小板活化過程中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，影響血小板粘附、聚集功能，其功能缺陷可導(dǎo)致出血性疾病的發(fā)生[2]。目前國內(nèi)外有少量相關(guān)基礎(chǔ)研究及病例報(bào)道。本文報(bào)道1例RASGRP2基因罕見雙重雜合突變并可能因此導(dǎo)致的出血性疾病病例，進(jìn)行相關(guān)文獻(xiàn)復(fù)習(xí)，以期提高對(duì)遺傳性血小板功能障礙臨床診斷及治療的認(rèn)識(shí)。

1 臨床資料

1.1 病史及體格檢查

患兒，男，4歲，因“反復(fù)鼻出血3年余”于2018年1月來我院兒科血液?？崎T診就診?；純?歲時(shí)出現(xiàn)自發(fā)性鼻腔出血，不易止血，皮膚、關(guān)節(jié)等其他部位無顯著出血，隨后反復(fù)鼻腔出血，每周1～2次到每月2～3次不等。病程中合并小細(xì)胞低色素性貧血。外院多次診斷鼻出血，予鼻腔填塞止血及口服鐵劑治療。查體：輕度貧血貌，全身皮膚無瘀點(diǎn)、瘀斑，全身淺表淋巴結(jié)未觸及腫大，瞼結(jié)膜蒼白，雙側(cè)鼻腔可見血痂附著，心肺腹查體無特殊，四肢無畸形。既往史、個(gè)人史陰性，否認(rèn)父母近親結(jié)婚史及出血性疾病家族史。

1.2 外院輔助檢查回顧

血常規(guī)：血紅蛋白波動(dòng)于60～112 g/L，呈小細(xì)胞低色素，血小板計(jì)數(shù)、血小板平均體積均正常。血塊收縮試驗(yàn)、纖維蛋白原、凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ活性篩查及vWF檢測均正常。地中海貧血基因檢測陰性。血小板功能檢測：血小板對(duì)ADP聚集率18.5%。骨髓常規(guī)：增生明顯活躍，粒細(xì)胞∶紅細(xì)胞=2.97∶1，紅系增生，成熟紅細(xì)胞大小不均，以小細(xì)胞為主，中心淡染區(qū)擴(kuò)大，全片可見468個(gè)巨核細(xì)胞，血小板數(shù)量輕度增高，散在分布，細(xì)胞內(nèi)鐵0%，細(xì)胞外鐵陰性，提示缺鐵性貧血骨髓像。采取外周血標(biāo)本送檢武漢康圣達(dá)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所，應(yīng)用二代測序篩查遺傳性血液病相關(guān)近700個(gè)基因，結(jié)果顯示患兒第11號(hào)染色體上RASGRP2基因雙重雜合突變：64497534位點(diǎn)[c.1545C>A，p.515C>X](RASGRP2 p.515C>X)，64509585位點(diǎn)[c.74-1G>C]。

1.3 家系驗(yàn)證

利用一代Sanger測序驗(yàn)證先證者及父母、弟弟RASGRP2上述突變位點(diǎn)的情況(圖1)?；純耗赣H檢出RASGRP2基因64497534位點(diǎn)與先證者相同的點(diǎn)突變，為該突變雜合攜帶者，64509585位點(diǎn)未檢測出突變；患兒父親，檢出RASGRP2基因64509585位點(diǎn)與先證者相同點(diǎn)突變；患兒弟弟，7月齡，未檢出RASGRP2基因突變，為野生型。上述家庭成員均無過度出血表現(xiàn)，家系圖譜見圖2。應(yīng)用SIFT、PolyPhen2、LRT、Mutation Taster方法進(jìn)行突變分析，在NCBI上比對(duì)NM_001098670、NM_001098671、NM_153819等3種轉(zhuǎn)錄本，64497534位點(diǎn)突變位于13號(hào)外顯子，為無義突變[c.1545C>A，p.515C>X]，64509585位點(diǎn)突變位于4號(hào)外顯子，為剪接突變[c.74-1G>C]，通過查詢千人基因組計(jì)劃數(shù)據(jù)庫、人類遺傳突變數(shù)據(jù)庫、美國國家生物技術(shù)信息中心單核苷酸多態(tài)性數(shù)據(jù)庫等國際多個(gè)數(shù)據(jù)庫，暫未發(fā)現(xiàn)上述位點(diǎn)突變的人類相關(guān)致病報(bào)道。

1.4 診斷及治療、隨訪

結(jié)合患兒臨床表現(xiàn)、血小板功能檢測，以及二代測序RASGRP2基因雙重雜合突變結(jié)果。該患兒診斷為遺傳性血小板功能障礙(IPFD)及缺鐵性貧血。醫(yī)囑：①注意外傷，避免鼻腔出血；②鐵劑治療，每月監(jiān)測血常規(guī)+網(wǎng)織紅細(xì)胞；③兒科血液?？崎T診隨診。隨訪：患兒出院后遵醫(yī)囑，日常生活注意避免出血發(fā)生。5歲后鼻出血發(fā)生頻率下降，約1～2次/月，貧血糾正。治療過程中未予輸注血小板等特殊治療。

A：先證者64509585位點(diǎn)[c.74-1G>C]，64497534位點(diǎn)[c.1545C>A]；B：母親64509585位點(diǎn)未檢測出突變，64497534位點(diǎn)[c.1545C>A]；C：父親64509585位點(diǎn)[c.74-1G>C]突變圖1 先證者及父母RASGRP2基因突變位點(diǎn)Sanger測序圖Fig.1 Sanger sequencing analysis of the patient and his parents with the mutations in RASGRP2

圖2 先證者家系圖譜Fig.2 Family pedigrees of the patient

2 討論

人類的出凝血系統(tǒng)，由血管、血小板、凝血系統(tǒng)、抗凝纖溶系統(tǒng)共同調(diào)節(jié)，其中任何一個(gè)因素的異常，將導(dǎo)致患者發(fā)生過度出血或血栓形成。在兒童患者中，血小板數(shù)量的減少、先天性或獲得性凝血因子缺乏及血管因素，是最常見的出血性疾病的病因，血小板功能障礙性疾病相對(duì)少見。臨床上將血小板功能障礙性疾病分為遺傳性和繼發(fā)性，繼發(fā)性血小板功能障礙性疾病多由于其他血液病和非血液病使用某些藥物影響血小板功能所致。小兒以遺傳性血小板功能障礙性疾病多見，遺傳性血小板功能障礙是一種多數(shù)伴常染色體遺傳的罕見疾病，全球散發(fā)，是一組和不同嚴(yán)重程度出血有關(guān)的異質(zhì)性疾病，多數(shù)是由于參與血小板粘附、聚集、分泌和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能的基因缺陷導(dǎo)致的一類血小板疾病。以血小板無力癥(Glanzmann thrombasthenia，GT)及巨大血小板綜合征(Bernard-Soulier syndrome，BSS)最常見。臨床以皮膚黏膜自發(fā)出血、外科手術(shù)和創(chuàng)傷后出血不止為主要表現(xiàn)。2015年國際血小板生理學(xué)科學(xué)小組委員會(huì)發(fā)布IPFD診斷指南[3]，指出該病診斷主要依賴于病史和查體、實(shí)驗(yàn)室對(duì)血小板計(jì)數(shù)和形態(tài)的評(píng)估、血小板功能的評(píng)估以及流式細(xì)胞儀檢測血小板顆粒和表面標(biāo)記物含量，疑似病例進(jìn)一步完善二代測序(NGS)。隨著二代測序的應(yīng)用，越來越多的IPFD借助二代測序獲得診斷，該病已不再像之前所認(rèn)為的那樣罕見?，F(xiàn)已被認(rèn)可有51種基因與該病的臨床表現(xiàn)及實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果相關(guān)[4]。

RASGRP2基因位于11號(hào)染色體長臂13區(qū)1帶，1998年首次被克隆，曾被命名為人類CDC25類似物(HCDC25L)、Ca2+及二酰甘油調(diào)節(jié)的鳥嘌呤交換因子Ⅰ(CalDAG-GEFⅠ)。其編碼表達(dá)的CalDAG-GEFⅠ蛋白在造血系統(tǒng)的血小板、中性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞中強(qiáng)烈表達(dá)[5-6]，是一種膜結(jié)合的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，可整合鈣離子和二?；视?DAG)通路，其位于胞質(zhì)內(nèi)的短片段與Rap1和Rap2結(jié)合，通過活化Rap，調(diào)控細(xì)胞對(duì)外界刺激的反應(yīng)。Bergmeier等[7]研究發(fā)現(xiàn)敲除RASGRP2基因的小鼠其血小板Rap1活化功能存在缺陷，導(dǎo)致血小板信號(hào)傳導(dǎo)功能下降，對(duì)誘聚劑反應(yīng)下降，整合素介導(dǎo)的血小板粘附減少，血栓形成增多。Hisashi等[8]研究顯示RASGRP2的缺陷可阻斷蛋白激酶C(PKC)的活化，阻止整合素αⅡbβ3活化，從而影響血小板聚集、粘附的功能，導(dǎo)致出血性疾病的發(fā)生。由此可見，CalDAG-GEFⅠ對(duì)血小板活化的關(guān)鍵事件——PKC活化釋放和整合素αⅡbβ3的激活調(diào)節(jié)均十分重要，其缺陷影響正常血小板的粘附、聚集功能[9]。由RASGRP2缺陷所導(dǎo)致的出血性疾病和某些血小板無力癥(GT)發(fā)病機(jī)制相似，實(shí)驗(yàn)室顯示血小板LTA對(duì)常見誘聚劑反應(yīng)下降，但血小板表面aⅡbβ3表達(dá)僅輕度或中度下降[10-11]。Canault等[12]報(bào)道RASGRP2第8外顯子的純合c.742G-T突變，引起CDC25催化結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)保守區(qū)域發(fā)生了G248W取代，導(dǎo)致RasGRP2功能缺陷，血小板內(nèi)外信號(hào)傳導(dǎo)缺陷，干擾血小板聚集和擴(kuò)散。這是關(guān)于RASGRP2突變體導(dǎo)致遺傳性血小板功能障礙的首次報(bào)道。目前人類遺傳突變數(shù)據(jù)庫(HGMD)收錄RASGRP2基因24個(gè)突變中，有20個(gè)是點(diǎn)突變，3個(gè)是缺失突變，1個(gè)是重復(fù)突變。近期，Westbury等[13]研究者通過對(duì)2042例不明原因的出血患者家系進(jìn)行高通量測序和表型數(shù)據(jù)分析，又發(fā)現(xiàn)11例新的RASGRP2雙等位基因變異可能具有致病性。目前臨床表型-基因型分離驗(yàn)證存在難度，將基因突變與潛在的出血性疾病聯(lián)系起來仍是一個(gè)持續(xù)性的挑戰(zhàn)。

本報(bào)道通過對(duì)CalDAG-GEFⅠ蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分析發(fā)現(xiàn)，先證者RASGRP2基因64497534位點(diǎn)突變[c.1545C>A，p.515C>X]，位于13號(hào)外顯子二酰甘油結(jié)合結(jié)構(gòu)域(C1)，無義突變導(dǎo)致終止密碼子提前編碼，阻斷了肽鏈的合成；64509585位點(diǎn)[c.74-1G>C]突變位于4號(hào)外顯子前一個(gè)堿基，4號(hào)外顯子位于Ras交換基序(REM)。通過human splicing finder軟件預(yù)測c.74-1G>C剪接受體位點(diǎn)結(jié)構(gòu)，顯示先證者剪接位點(diǎn)被破壞，導(dǎo)致mRNA剪接異常，無法正常表達(dá)RAS交換基序，從而影響下游蛋白的表達(dá)。由此可以預(yù)測先證者的雙重雜合突變影響CalDAG-GEFⅠ結(jié)構(gòu)，是可能致病的(圖3)。

IPFD的臨床出血表現(xiàn)存在異質(zhì)性，及時(shí)的診斷及分類，評(píng)估病情預(yù)測出血程度對(duì)該類患者尤為重要。輸注血小板被認(rèn)定為目前治療嚴(yán)重出血或手術(shù)預(yù)防出血的常用措施，產(chǎn)生抗血小板抗體是常見的不良反應(yīng)，為減少同種免疫反應(yīng)，這類患者應(yīng)該輸注去白細(xì)胞或者HLA匹配的血小板[14]；許多臨床醫(yī)師鑒于此不良反應(yīng)，更傾向選擇重組凝血因子Ⅶa(rFⅦa)。Di Minno等[15]研究者指出單純用重組凝血因子Ⅶ治療血小板無力癥止血，成功率可達(dá)91.0%；全球已有散在的造血干細(xì)胞移植治療IPFD成功的病例，但其可能出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥等情況，被慎重考慮。此外，去氨加壓素(DDAVP)、激素避孕藥以及抗纖維蛋白溶解療法也被視為有效的輔助治療方法。目前遺傳性血小板功能障礙無有效的靶向治療措施，基因治療總體處于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，且高額的費(fèi)用，短時(shí)間可能難以在臨床實(shí)施。值得注意的是，所有患者均有可能合并缺鐵性貧血，在治療中需得到關(guān)注。預(yù)防仍是原發(fā)性出血的最佳管理方法，因此需注意口腔衛(wèi)生，避免高?；顒?dòng)，并適當(dāng)早期干預(yù)。

REM：RAS交換基序；CDC25：催化結(jié)構(gòu)域；EF：鈣結(jié)合位點(diǎn)；C1：二酰甘油結(jié)合結(jié)構(gòu)域圖3 RASGRP2基因[c.74-1G>C]與[c.1545C>A]突變?cè)贑alDAG-GEFI蛋白結(jié)構(gòu)中的定位與預(yù)測圖Fig.3 Localization and prediction map of the[c.74-1G>C]and[c.1545C>A]mutations within the RASGRP2 sequence and the encoded protein CalDAG-GEFI

綜上所述，RASGRP2基因缺陷通過影響血小板Rap1的激活，從而影響PKC及αⅡbβ3整合素的激活，導(dǎo)致血小板粘附、聚集功能障礙，臨床表現(xiàn)可出現(xiàn)不同程度的出血。它是遺傳性血小板功能障礙的致病基因之一，目前全球仍然陸續(xù)發(fā)現(xiàn)與疾病相關(guān)的未知遺傳變異。遺傳性血小板功能障礙臨床表現(xiàn)存在異質(zhì)性，實(shí)驗(yàn)室診斷難以達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)化，診斷相對(duì)困難，臨床上只有少部分通過二代測序明確診斷。本文首次報(bào)道RASGRP2基因罕見雙重雜合突變可能導(dǎo)致遺傳性血小板功能障礙1例，對(duì)于IPFD的認(rèn)識(shí)不足導(dǎo)致該患兒診斷過程欠系統(tǒng)。對(duì)于疑似IPFD的患者應(yīng)及時(shí)完善血小板功能評(píng)估，流式細(xì)胞儀檢測血小板膜表面蛋白表達(dá)以及二代測序是有必要的。