陳韞慧，方思璇，陳佳琪，郭振新，胡宇超，艾連中，王光強(qiáng)*

1(上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海，200093)2(上海食品微生物工程技術(shù)研究中心，上海，200093)

益生元是一類不被宿主消化吸收卻能夠選擇性地促進(jìn)體內(nèi)有益菌的代謝和增殖，從而改善宿主健康的有機(jī)物質(zhì)，目前常用的是功能性低聚糖，即由2～10個(gè)單糖分子所組成的寡糖類物質(zhì)。益生元具有非消化的特性，但益生元可以被腸道菌群發(fā)酵，促進(jìn)腸道益生菌的新陳代謝和繁殖[1-2]。益生元被分解代謝，通過(guò)產(chǎn)酸使腸道內(nèi)pH值下降，減少機(jī)體內(nèi)的毒素水平，提高機(jī)體的抗病性[3]。研究發(fā)現(xiàn)，益生元還能增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，調(diào)節(jié)脂肪、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)的代謝吸收，改善腸道的微環(huán)境系統(tǒng)[4]。雖然益生元十分重要，但目前益生元的篩選仍然比較混亂[3,5-6]。有的是直接在培養(yǎng)基中添加不同益生元后進(jìn)行篩選，有的則是利用益生元代替培養(yǎng)基中的葡萄糖當(dāng)作碳源。但到目前為止還沒(méi)有對(duì)這些方法進(jìn)行比較，對(duì)不同培養(yǎng)條件下益生元對(duì)益生菌生長(zhǎng)的影響還未知，而且這些結(jié)果是否與體外模擬腸道環(huán)境下的結(jié)果一致也需進(jìn)一步的研究。另外，由于益生菌具有菌株差異性，不同菌株含有的糖類代謝基因完全不同，導(dǎo)致了益生元對(duì)不同益生菌的影響是不同的[7]。由于菌株之間的差異性很大，而且同一個(gè)糖類代謝酶可能可以作用于不同的寡糖類益生元，因此目前靶向篩選益生菌仍然是一個(gè)難題[3]。

本文分別在MRS培養(yǎng)基中添加益生元、以益生元替代MRS中的葡萄糖以及在體外模擬腸道中添加益生元為培養(yǎng)基，研究不同益生元對(duì)5株生理特性不同的植物乳桿菌生長(zhǎng)的影響，提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

供試菌株：植物乳桿菌AR113、AR509、AR237、AR514、AR117,由本實(shí)驗(yàn)室提供。

益生元：低聚果糖(fructooligosaccharides,FOS)純度≥95%、低聚木糖(xylooligosaccharides,XOS)純度≥95%、低聚半乳糖(galactooligosaccharides,GOS)純度≥70%、低聚異麥芽糖(isomaltooligosaccharide,IMO)純度≥90%、菊粉(Inulin)純度≥90%，由上海源葉生物科技有限公司生產(chǎn)。

設(shè)備：Bioscreen C 全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀，芬蘭 Bioscreen；HPX-9162MBE 型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司；湘儀L500臺(tái)式低速自動(dòng)平衡離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；SW-CJ-2FD 超凈工作臺(tái)，上海續(xù)暢實(shí)業(yè)有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋，日本 Hirayama。

1.2 培養(yǎng)基配制

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、牛肉浸粉10 g、葡萄糖20 g、K2HPO42 g、CH3COONa·3H2O 5 g、檸檬酸三銨2 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、MnSO4·4H2O 0.05 g、吐溫-80 1 mL,定溶于1 L去離子水中，115 ℃滅菌20 min。

1.3 菌株純化

從-80 ℃冰箱中取出5株菌株，于MRS固體培養(yǎng)基上劃線后于厭氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，重復(fù)3次后涂片，染色，鏡檢，然后用甘油保藏法保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 添加益生元時(shí)植物乳桿菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

從-20 ℃冰箱中取出待試菌株，將5株菌株活化12 h后，以1%的接種量接種于MRS培養(yǎng)基中，分別添加20 g/L的FOS、XOS、GOS、IMO和Inulin，添加的益生元均經(jīng)過(guò)0.22 μm水相過(guò)濾器過(guò)濾，對(duì)照組不添加益生元。每組取200 μL 菌液放置于全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀的培養(yǎng)板中，37 ℃培養(yǎng)48 h，以未接菌的培養(yǎng)基為參比溶液，每組3個(gè)平行，測(cè)定間隔為0.5 h。

1.4.2 益生元充當(dāng)碳源時(shí)植物乳桿菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

配制不含葡萄糖的MRS基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以20 g/L的FOS、XOS、GOS、IMO和Inulin替換葡萄糖作為碳源，接種量為1%，對(duì)照組加入20 g/L葡萄糖，益生元與葡萄糖溶液都經(jīng)0.22 μm水相過(guò)濾器過(guò)濾。每組取200 μL 菌液放置于全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀的培養(yǎng)板中，37 ℃培養(yǎng)48 h，以未接菌的培養(yǎng)基為參比溶液，每組3個(gè)平行，測(cè)定間隔為0.5 h。

1.4.3 體外模擬小鼠腸道

由于腸道微生物所受影響因素很多，為了盡可能地控制飲食、環(huán)境等因素對(duì)腸道微生物的影響，也為了方便增加可重復(fù)性，依據(jù)文獻(xiàn)，采集統(tǒng)一喂養(yǎng)小鼠所排泄的糞便[8]。另一方面，隨著菌株特異性標(biāo)記技術(shù)的成熟，后續(xù)進(jìn)一步通過(guò)小鼠模型驗(yàn)證體外所篩選益生元對(duì)特定益生菌的影響，從而確認(rèn)此方法的可靠性。當(dāng)然待小鼠實(shí)驗(yàn)被證實(shí)完全可信后還需要增加人體相關(guān)實(shí)驗(yàn)，證實(shí)有效后進(jìn)而推廣產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。

本實(shí)驗(yàn)的具體操作如下：配制6 g/L的小鼠糞便溶液，均質(zhì)后于高壓滅菌鍋121 ℃滅菌15 min。將活化12 h后的菌液以9 600 r/min離心1 min，倒去培養(yǎng)基，菌體洗滌后將1%菌液接種于小鼠糞便液體培養(yǎng)基中，加入20 g/L胰蛋白胨充當(dāng)?shù)矗?0 g/L益生元充當(dāng)碳源(其分組如表1所示),對(duì)照組不添加胰蛋白胨與益生元，益生元與胰蛋白胨溶液都經(jīng)0.22 μm水相過(guò)濾器過(guò)濾。每組取200 μL菌液放置于全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀的培養(yǎng)板中37 ℃培養(yǎng)48 h，以未接菌的培養(yǎng)基為參比溶液，每組3個(gè)平行測(cè)定OD600，測(cè)定間隔為0.5 h。

表1 實(shí)驗(yàn)分組Table 1 Test group

2 結(jié)果與分析

2.1 不同益生元對(duì)植物乳桿菌生長(zhǎng)的促增殖作用

按照1.4.1小節(jié)所述方法添加相應(yīng)益生元，利用Bioscreen測(cè)得各株植物乳桿菌的生長(zhǎng)曲線如圖1所示。以O(shè)D600的最大值作為植物乳桿菌菌株的生長(zhǎng)情況的代表量，將各組進(jìn)行單因素方差分析，分析數(shù)據(jù)見(jiàn)表2和表3。由表2可知，與對(duì)照組相比，菌株的各益生元組的最大比生長(zhǎng)速率均無(wú)顯著的增長(zhǎng)跡象。由表3可知，除AR117的IMO組外，菌株在各益生元組的最大生物量與對(duì)照組相比無(wú)顯著的增長(zhǎng)跡象。在一些組別中，添加益生元甚至顯著抑制了菌株的生長(zhǎng)，如AR509、AR237的FOS組、XOS組、GOS組、Inulin組以及AR117的GOS組、Inulin組(P<0.05)?？傮w上添加益生元也不能促進(jìn)它們的生長(zhǎng)(P>0.05)。

目前大部分研究是在培養(yǎng)基中直接添加益生元，然后研究添加益生元后活性或者功能特性的變化[10-11]，部分研究把益生元添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中[12]，但基礎(chǔ)培養(yǎng)基十分復(fù)雜，不適合大規(guī)模的篩選。但直接把益生元添加到MRS培養(yǎng)基中并不能促進(jìn)菌株的生長(zhǎng)，反而還可能抑制植物乳桿菌的生長(zhǎng)。這可能的原因是葡萄糖效應(yīng)，當(dāng)益生元與葡萄糖同時(shí)存在時(shí)，菌株優(yōu)先利用葡萄糖作為碳源，產(chǎn)生了分解代謝物阻遏效應(yīng)[13-14]，但具體原因需要進(jìn)一步的研究。因此有葡萄糖存在的情況下，直接添加益生元可能并不適合用作益生元的篩選。

圖1 植物乳桿菌在添加不同益生元的MRS培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth cur e of L.plantarum in MRS medium with different prebiotics

菌株最大生物量(OD600)對(duì)照FOSXOSGOSIMOInulinAR1131.546±0.005abc1.501±0.051c1.505±0.008bc1.570±0.020ab1.587±0.015a1.552±0.039abcAR5091.628±0.016a1.552±0.015bc1.571±0.028b1.551±0.019bc1.604±0.004ab1.516±0.040cAR2371.557±0.004a1.439±0.010c1.468±0.011b1.449±0.001bc1.561±0.009a1.469±0.021bAR5141.555±0.054ab1.528±0.011b1.532±0.011b1.544±0.022b1.609±0.006a1.514±0.031bAR1171.648±0.015b1.635±0.003bc1.654±0.012ab1.625±0.005c1.673±0.005a1.587±0.010d

2.2 植物乳桿菌在不同益生元作為碳源的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)狀況

由于葡萄糖的存在影響了益生元的選擇，因此根據(jù)1.4.2的方法，用不同益生元替換MRS培養(yǎng)基中的葡萄糖，測(cè)得各株植物乳桿菌的生長(zhǎng)曲線如圖2所示。由圖2、表4可知， AR113, AR509和AR117對(duì)益生元的利用情況相似，其增殖效果為：FOS、GOS最優(yōu)，IMO次之，Inulin與XOS較差；益生元對(duì)AR237的增殖效果為：FOS、Inulin最優(yōu)， IMO、GOS次之，XOS較差；益生元對(duì)AR514的增值效果為：Inulin>FOS> GOS>IMO>XOS。植物乳桿菌對(duì)不同的碳源具有選擇偏好性，且不同植物乳桿菌菌株具有菌株特異性，這與SHARMA等[15]的研究基本一致?？傮w上，F(xiàn)OS、GOS和Inulin對(duì)植物乳桿菌的增殖效果較好，而XOS的效果最差，XOS不適合用作植物乳桿菌的碳源。

圖2 使用益生元作為碳源時(shí)植物乳桿菌的生長(zhǎng)曲線Fig.2 Growth cur e of L.plantarum using prebiotics as carbon source

菌株最大生物量(OD600)對(duì)照FOSXOSGOSIMOLnulinAR1131.563±0.013a1.441±0.044b0.556±0.024e1.413±0.012bc1.360±0.019c1.004±0.049dAR5091.660±0.028a1.504±0.014b0.570±0.013e1.501±0.024b1.370±0.013c0.784±0.023dAR2371.465±0.013b1.590±0.012a0.542±0.029d1.392±0.012c1.397±0.037c1.568±0.034aAR5141.529±0.029c1.573±0.029b0.536±0.010f1.343±0.016d1.276±0.003e1.620±0.009aAR1171.665±0.021a1.487±0.019b0.422±0.027f1.384±0.005c1.097±0.011d0.802±0.028e

根據(jù)各植物乳桿菌的最大比生長(zhǎng)速率分析各菌株在不同益生元作為發(fā)酵底物時(shí)的活力，由表5可知,除XOS組，AR117中的GOS組、IMO組，AR237中的IMO組外，其余各組與對(duì)照組相比，最大比生長(zhǎng)速率顯著提高(P<0.05)。其中，F(xiàn)OS、GOS與Inulin作為發(fā)酵底物時(shí)，菌株最大比生長(zhǎng)速率提高幅度較大。這與上文中益生元增殖效果的分析相符合。

2.3 體外模擬小鼠腸道中植物乳桿菌對(duì)不同益生元的利用情況

糞便是胃腸道代謝系統(tǒng)的生理產(chǎn)物，可以間接反映腸道代謝情況。李俊等[16]通過(guò)代謝物總離子圖分析得知,小鼠糞便中含有多種小分子代謝物，如氨基酸類、脂肪酸、糖類、有機(jī)酸等。因此以滅菌小鼠糞便為培養(yǎng)基模擬小鼠腸道是可行的。與人工合成的其他培養(yǎng)基相比，小鼠糞便本身當(dāng)作培養(yǎng)基更能反應(yīng)小鼠腸道的環(huán)境[17]。為了驗(yàn)證體外篩選的益生元能否在模擬小鼠腸道促進(jìn)益生菌的生長(zhǎng)，測(cè)得各株植物乳桿菌的生長(zhǎng)曲線如圖3所示。

圖3 模擬腸道環(huán)境中各植物乳桿菌的最大生物量Fig.3 Maximum biomass of L.plantarum in simulated intestinal en ironment

可能由于營(yíng)養(yǎng)成分的缺乏，5株植物乳桿菌在只含糞便培養(yǎng)基的對(duì)照組中均無(wú)明顯的生長(zhǎng)現(xiàn)象。最近研究發(fā)現(xiàn),氮源是限制腸道微生物生長(zhǎng)的關(guān)鍵因素[18-19]。加入篩選的益生元與氮源后則出現(xiàn)了明顯的生長(zhǎng)現(xiàn)象(圖3)。這表明植物乳桿菌在模擬腸道中可以利用FOS、GOS、Inulin這類益生元，促進(jìn)自身的生長(zhǎng)繁殖。通過(guò)比較植物乳桿菌的最大生長(zhǎng)量可知，3株菌株AR113、AR509、AR117 對(duì)GOS與FOS的利用效率無(wú)顯著性差異，2株菌株AR514與AR237 中FOS的利用效率顯著高于Inulin(P<0.05)，Inulin在此模擬環(huán)境中不能很好地被植物乳桿菌利用，這說(shuō)明在不同環(huán)境下植物乳桿菌利用益生元的種類不同，這可能是由于利用益生元相關(guān)的基因大部分是誘導(dǎo)表達(dá)的相關(guān)[20-21]，但具體原因還需要進(jìn)一步的研究。

根據(jù)1.4.3小節(jié)的方法測(cè)得數(shù)據(jù)，通過(guò)軟件擬合后得到表6結(jié)果。由表6可知，除AR117以及AR113的GOS組外，各組的最大比生長(zhǎng)速率均無(wú)顯著性差異，AR117與各組相比生長(zhǎng)速率下降顯著(P<0.05)。比較各組植物乳桿菌生長(zhǎng)的遲滯期可知，各植物乳桿菌的遲滯期差異較大，其中AR117的GOS組遲滯期最長(zhǎng)，AR237的Inulin組遲滯期最短。這說(shuō)明益生元對(duì)不同植物乳桿菌的影響具有菌株特異性。

表6 模擬腸道環(huán)境中各植物乳桿菌的遲滯期與最大比生長(zhǎng)速率Table 6 Lag period and maximum specific growth rate of L. plantarum in simulated intestinal en ironment ±SD)

3 結(jié)論

在MRS培養(yǎng)下，添加5種質(zhì)量濃度為20 g/L的益生元對(duì)植物乳桿菌無(wú)明顯促增殖作用，因此并不能用此方法篩選益生元。在以益生元替代葡萄糖作為碳源的MRS培養(yǎng)基中，植物乳桿菌對(duì)不同的益生元具有選擇偏好性，且具有菌株特異性。綜合5株植物乳桿菌在此培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)狀況，低聚果糖、低聚半乳糖、菊粉這3種益生元促增殖效果較好，此方法基本上能與模擬腸道的培養(yǎng)體系一致，但存在一定的誤差，比如菊粉在模擬腸道環(huán)境下不能很好地促進(jìn)植物乳桿菌生長(zhǎng)。在以滅菌小鼠糞便與胰蛋白胨復(fù)合為基礎(chǔ)培養(yǎng)條件的模擬腸道體系下，與對(duì)照相比，益生元能明顯促進(jìn)所有植物乳桿菌的增長(zhǎng)，其中低聚果糖與低聚半乳糖的促增殖效果更為優(yōu)異，這是一個(gè)更加方便可靠的方法，可以用作益生元的篩選。