王海濤 周海紅 閔建平 王濤 王蘭 郭歡 張永東 蘇海翔

甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院，甘肅 蘭州730050

RNA 編輯是一種重要的轉(zhuǎn)錄后修飾機(jī)制，通過堿基的替換、插入或缺失，改變核苷酸序列，進(jìn)而導(dǎo)致氨基酸序列的改變，影響基因表達(dá)、可變剪接、RNA 穩(wěn)定性等［1］。RNA 編輯增大了轉(zhuǎn)錄多樣性，進(jìn)而增加了蛋白質(zhì)的種類，使生物體能夠更好地適應(yīng)生存環(huán)境［2］。同時(shí)，RNA 編輯也進(jìn)一步擴(kuò)充了中心法則，增進(jìn)人類對生物遺傳規(guī)律的認(rèn)知［3］。A-to-I RNA 編輯是最普遍的一種RNA 編輯，是在雙鏈RNA 腺苷脫氨酶（adenosine deaminases acting on RNA，ADARs）作用下，腺苷A 的C6 位氨基水解脫氨形成次黃苷I 的過程，而后者在逆轉(zhuǎn)錄和翻譯過程中被識別為鳥苷G［4］。A-to-I RNA 編輯廣泛存在于哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，研究表明，其對于維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)和機(jī)體正常的生理功能必不可少，是神經(jīng)發(fā)育、神經(jīng)系統(tǒng)功能以及神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生的重要因素［5-7］。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，對生命、疾病的研究已不再局限于某個(gè)基因位點(diǎn)。高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展，為研究RNA 編輯提供了新的技術(shù)平臺(tái)，為全基因組或全外顯組范圍內(nèi)的RNA 編輯位點(diǎn)的研究提供了可能［8］。RNA-Seq 技術(shù)的發(fā)展為RNA 編輯提供了更便利的條件［9］。本研究以星形膠質(zhì)細(xì)胞作為研究對象，運(yùn)用高通量測序技術(shù)對其外顯組和轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行深度測序，通過對二者測序結(jié)果的精確比對，鑒定出神經(jīng)系統(tǒng)外顯子組中的A-to-I RNA 編輯靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑 1800-P 人星形膠質(zhì)細(xì)胞系（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心）；RPMI 1640 培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、星形細(xì)胞生長因子（美國Gibco 公司）；無水乙醇、氯仿、異戊酸和冰乙酸（北京化學(xué)試劑公司）；Trizol（美國Thermo 公司）；DNase I、Prime Script TM RT Reagent Kit（日本Takara 公司）；2×Taq PCR Mastermix（北京天根公司）；胰蛋白酶、蛋白酶K、瓊脂糖（美國progema 公司）；DNAStoolMiniKit（德國QIAamp公司）；TruSeq Library Construction Kit（美國Illumina 公司）；NEBNext○RUltraTMDirectional RNA Library Prep Kit for Illumina○R（美國NEB 公司）；Agilent SureSelect Human AllExomeV6 試劑盒（加拿大AgilentTechnologies 公司）。

1.2 儀器 CO2組織細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo 公司），超凈臺(tái)（北京HDL），-80℃冰箱（美國Thermo 公司），高壓滅菌鍋（北京HDL），Nanodrop 2000 超微量分光光度計(jì)（美國Thermo 公司），Qubit 2.0 熒光計(jì)（美國Thermo公司），凝膠電泳儀（美國Thermo 公司），凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司），高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf），小型高速離心機(jī)（德國Eppendorf）。

1.3 方法

1.3.1 1800-P 星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)。將1800-P 星形膠質(zhì)細(xì)胞在含有10%FBS 的RPMI 1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)（含有100μ/mL 青霉素和100μ/mL 鏈霉素），并置于37℃、20%O2、5%CO2、75%N2的孵箱中，每2~3 天更換培養(yǎng)基。

1.3.2 星形膠質(zhì)細(xì)胞基因組DNA 和總RNA 的提取。采用DNA Stool Mini Kit 試劑盒提取1800-P 星形膠質(zhì)細(xì)胞基因組DNA；利用Trizol 試劑提取星形膠質(zhì)細(xì)胞總RNA，并用DNase I 去除基因組DNA。采用Nanodrop 2000 超微量分光光度計(jì)測定所得DNA 和RNA的濃度和純度；采用瓊脂糖凝膠電泳對DNA 和RNA樣本進(jìn)行完整性分析，檢測合格的基因組DNA 和總RNA保存在-80℃冰箱中。

1.3.3 轉(zhuǎn)錄組測序。①轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建。對鑒定合格的樣品進(jìn)行文庫構(gòu)建，主要流程為：用帶有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA；加入Fragmentation Buffer 隨機(jī)打斷mRNA；用六堿基隨機(jī)引物合成第一條cDNA 鏈；加入DNA polymerase I、dNTPs、緩沖液和RNase H 合成第二條cDNA 鏈；純化cDNA 并進(jìn)行末端修復(fù)、加A 尾并連接測序接頭，然后用AMPure XP beads 進(jìn)行片段大小選擇；通過PCR 富集得到cDNA 文庫。為保證質(zhì)量，文庫構(gòu)建完成后，使用qPCR 方法對文庫的有效濃度（文庫有效濃度＞2nM）進(jìn)行準(zhǔn)確定量。②上機(jī)測序。庫檢合格后，對不同文庫進(jìn)行pooling，測序平臺(tái)為Illumina HiSeq，全轉(zhuǎn)錄組測序由北京百邁克公司完成。

1.3.4 外顯組測序。①外顯組文庫構(gòu)建。采用Agilent外顯子捕獲試劑盒，構(gòu)建插入片段180~280bp 的文庫，主要流程為：將檢測合格的DNA 樣品利用超聲波破碎儀打斷至180~280bp 左右，并進(jìn)行末端修復(fù)加接頭，構(gòu)建DNA 文庫；對文庫進(jìn)行連接介導(dǎo)PCR（LMPCR）擴(kuò)增，測定每個(gè)樣品濃度；將擴(kuò)增后的樣品與生物素標(biāo)記探針進(jìn)行雜交，形成外顯子區(qū)域和探針復(fù)合體；利用鏈霉親和素修飾的納米磁珠吸附復(fù)合體，清洗磁珠，去除未結(jié)合序列，然后將捕獲的外顯子序列洗脫下來；對捕獲后的樣品再次進(jìn)行LM-PCR 擴(kuò)增；利用qPCR 技術(shù)評估目標(biāo)區(qū)域的相對富集倍數(shù)，以確保樣品達(dá)到質(zhì)控要求。②上機(jī)測序。庫檢合格后，對樣本進(jìn)行雙端測序，所用平臺(tái)為Illumina HiSeq，全外顯組測序由北京百邁克公司完成。

1.3.5 測序數(shù)據(jù)質(zhì)控。為了保證后續(xù)分析準(zhǔn)確可靠，需對原始測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控和過濾，去除含有接頭序列和polyN（N 代表無法確定的堿基信息）的reads，N的比例超過10%的reads 和低質(zhì)量堿基（Qphred≤20）比例大于50%的reads 也需要去除。原始數(shù)據(jù)經(jīng)過濾后得到clean data，使用FastQC 軟件檢測raw data 和clean data 的質(zhì)量，并統(tǒng)計(jì)clean data 的Q30 和GC 含量。

1.3.6 RNA 編輯位點(diǎn)鑒定。使用RES-Scanner 對獲得的高通量測序數(shù)據(jù)進(jìn)行RNA 編輯位點(diǎn)的鑒定分析，流程主要包括三步：①構(gòu)建參考基因組索引，預(yù)處理fastq 文件；②讀長回貼；③RNA 編輯位點(diǎn)鑒定。檢測出的RNA 編輯位點(diǎn)均滿足以下條件：支持該位點(diǎn)發(fā)生RNA 編輯的RNA 測序reads 至少有3 條；RNA 編輯水平不小于0.05，且至少位于1 條支持編輯發(fā)生的RNA測序reads 的中間位置；不位于長度大于等于5bp 的同聚物序列；不落在reads 末端6bp 范圍內(nèi)；二項(xiàng)分布檢驗(yàn)的FDR 小于0.05。

2 結(jié)果

2.1 測序數(shù)據(jù)產(chǎn)出統(tǒng)計(jì)

2.1.1 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)。完成4 個(gè)樣本的轉(zhuǎn)錄組分析，共計(jì)獲得Clean Data 29.79Gb，各樣本Clean Data 均達(dá)到6.81Gb，Q30 堿基百分比在93%以上。分別將各樣本的Clean Reads 與指定的參考基因組進(jìn)行序列比對，比對效率從95.65%到97.45%不等。見表1。

表1 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表

2.1.2 外顯組測序數(shù)據(jù)。4 個(gè)樣本的平均Clean Bases為9.99Gbp，Q30 達(dá)到93.75%，樣本與參考基因組平均比對效率均為99.96%，目標(biāo)區(qū)域平均深度約為88.63X。見表2。

表2 外顯組測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表

2.2 RNA 編輯位點(diǎn)的鑒定 本研究以hg38 作為參考基因組版本進(jìn)行序列比對及后續(xù)分析。使用RESScanner 軟件鑒定RNA 編輯位點(diǎn)，該軟件需同時(shí)提供匹配的轉(zhuǎn)錄組測序和外顯組測序數(shù)據(jù)以剔除外顯組單核苷酸變異的影響，同時(shí)能夠自動(dòng)將轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)按來源劃分成正鏈和負(fù)鏈reads，從而準(zhǔn)確判定RNA 編輯類型。本研究中所檢測的4 個(gè)轉(zhuǎn)錄組樣本T1、T2、T3、T4 和4 個(gè)外顯組轉(zhuǎn)錄樣本E1、E2、E3、E4 是一一對應(yīng)關(guān)系，即T1 與E1 對應(yīng)同一樣本，T2 與E2 對應(yīng)同一樣本，T3 與E3 對應(yīng)同一樣本，T4 與E4 對應(yīng)同一樣本。本研究主要針對最常見的一種RNA 編輯類型：Ato-I RNA 編輯，利用RES-Scanner 軟件對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行深度分析，共計(jì)檢測出A-to-IRNA 編輯位點(diǎn)1751 個(gè)。

2.3 RNA 編輯位點(diǎn)在染色體上的分布 本研究在星形膠質(zhì)細(xì)胞的外顯組中檢測到的RNA 編輯位點(diǎn)廣泛存在于各條染色體上，但在染色體間呈現(xiàn)不均勻分布。其中A-to-I RNA 編輯位點(diǎn)在1 號染色體上分布明顯多于其他染色體，而在20、21 號染色體和X 染色體上分布較少。這一結(jié)果可能與染色體長度，及其所含基因的數(shù)量、總長度和活性等因素有關(guān)。見表3。

2.4 RNA 編輯位點(diǎn)在外顯組上的分布 RNA 編輯的功能與其發(fā)生位置密切相關(guān)，發(fā)生在5’UTR 和3’UTR中的RNA 編輯可能影響mRNA 的穩(wěn)定性，進(jìn)而調(diào)控基因表達(dá)；發(fā)生在CDS 區(qū)的RNA 編輯可能影響氨基酸的編碼，增加蛋白質(zhì)的多樣性；發(fā)生在非編碼區(qū)或者內(nèi)含子上的RNA 編輯可能會(huì)影響選擇性剪接、Circular RNA 成環(huán)、miRNA 和lncRNA 與靶標(biāo)的結(jié)合等。本研究統(tǒng)計(jì)了外顯組中不同基因功能區(qū)域的RNA 編輯位點(diǎn)，根據(jù)ANNOVAR 軟件中定義的優(yōu)先級，統(tǒng)計(jì)位于CDS、5’UTR 和3’UTR 中的A-to-I RNA 編輯位點(diǎn)，見表4。

表3 RNA 編輯位點(diǎn)在染色體上的分布

表4 RNA 編輯位點(diǎn)在外顯組的分布

2.5 CDS 中的RNA 編輯位點(diǎn) 在星形膠質(zhì)細(xì)胞的外顯組中檢測到了大量A-to-I RNA 編輯位點(diǎn)，僅有251個(gè)位點(diǎn)位于CDS 中，其中118 個(gè)位點(diǎn)為錯(cuò)義RNA 編輯位點(diǎn)，133 個(gè)為同義編輯位點(diǎn)。所有錯(cuò)義RNA 編輯位點(diǎn)分布在102 個(gè)基因上，共導(dǎo)致25 種類型的氨基酸替換，分別為Arg/Gly、Asn/Asp、Asn/Ser、Asp/Gly、Cys/Arg、Gln/Arg、Glu/Gly、His/Arg、Ile/Met、Ile/Thr、Ile/Val、Leu/Pro、Leu/Ser、Lys/Arg、Lys/Glu、Met/Thr、Met/Val、Phe/Leu、Phe/Ser、Ser/Gly、Ser/Pro、Thr/Ala、Trp/Arg、Tyr/Cyc、Val/Ala，其中Thr/Ala 最多，Val/Ala 次之，Cys/Arg、Leu/Ser 和Tyr/Cyc 最少，前3 種氨基酸替換類型（Thr/Ala、Val/Ala 和Ser/Gly）占全部氨基酸替換類型的23.73%。高達(dá)95.76%的錯(cuò)義RNA 編輯位點(diǎn)位于密碼子第1 位或者第2 位堿基上。

2.6 5’UTR 和3’UTR 中的RNA 編輯位點(diǎn) 一段成熟的mRNA 是由CDS 及其前后的5’UTR 和3’UTR組成的。本研究中，對外顯組進(jìn)行高通量測序的結(jié)果中得到了大量UTR 區(qū)的編輯信息。我們在5’UTR 中共計(jì)檢測出110 個(gè)A-to-I 編輯位點(diǎn)，在3’UTR 中共計(jì)檢測出1390 個(gè)A-to-I 編輯位點(diǎn)。這些位點(diǎn)的RNA 編輯可以改變RNA 的穩(wěn)定性、亞細(xì)胞定位、翻譯效率等。

表5 CDS 中的RNA 編輯位點(diǎn)

3 討論

RNA 編輯廣泛存在于哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)錄組中，內(nèi)含子和基因間隔區(qū)最為豐富［10］；在靈長類動(dòng)物中，A-to-I編輯更占到全部編輯的90%以上［11］。發(fā)生在編碼區(qū)的RNA 編輯可能會(huì)導(dǎo)致蛋白重編碼，產(chǎn)生異于基因組編碼的蛋白質(zhì)，在生物體蛋白質(zhì)多樣性的形成中發(fā)揮重要作用［12］。在正常生理狀態(tài)下，GluR-B 上的Q/R 位點(diǎn)幾乎完全發(fā)生A-to-I RNA 編輯，導(dǎo)致谷氨酰胺（Q）轉(zhuǎn)變?yōu)榫彼幔≧），使得AMAP 受體鈣離子通透性顯著下降，從而實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞鈣平衡的調(diào)節(jié)［13-15］，該Q/R 位點(diǎn)的異常編輯可導(dǎo)致小鼠癲癇發(fā)作及死亡［16］。發(fā)生在GLI1 第2179 位核苷酸的A-to-I RNA 編輯改變了該基因的轉(zhuǎn)錄效率，進(jìn)而對細(xì)胞的增殖造成影響［17］。DNA修復(fù)酶NEIL1 上的A-to-I RNA 編輯導(dǎo)致精氨酸轉(zhuǎn)變成賴氨酸，影響了NEIL1 的特異性［18］。

因技術(shù)有限，早期研究對于RNA 編輯的廣泛性理解有限。高通量測序技術(shù)可以幫助研究人員大規(guī)模鑒定RNA 編輯位點(diǎn)，也促進(jìn)了人們對RNA 編輯產(chǎn)生機(jī)理、調(diào)控機(jī)制及分布特征等的認(rèn)識［8］。即便如此，RNA編輯位點(diǎn)的鑒定仍是一項(xiàng)復(fù)雜的工作，需要綜合考慮多種因素，對變異位點(diǎn)進(jìn)行重重過濾。為了準(zhǔn)確鑒定出RNA 編輯位點(diǎn)，本研究進(jìn)行了優(yōu)化設(shè)計(jì)：①采用讀長150bp 的雙末端測序策略，提高讀長回貼的準(zhǔn)確性并促進(jìn)超編輯reads 的鑒定；②采用鏈特異性轉(zhuǎn)錄組測序，僅對第一鏈cDNA 進(jìn)行測序，以使生成的讀長保留其來源信息，確保準(zhǔn)確判定RNA 編輯類型；③對同一樣本來源的外顯組和轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序，以充分剔除單核苷酸變異的影響；④使用RES-Scanner 鑒定RNA 編輯位點(diǎn)，進(jìn)一步提高RNA 編輯位點(diǎn)鑒定的準(zhǔn)確性和可靠性。

從現(xiàn)有文獻(xiàn)中已經(jīng)鑒定出的RNA 編輯位點(diǎn)分布情況來看，絕大多數(shù)的RNA 編輯位點(diǎn)發(fā)生在基因的內(nèi)含子區(qū)及基因間隔區(qū)，發(fā)生在外顯子區(qū)的RNA 編輯，只占總體RNA 編輯位點(diǎn)中極少比例的一部分。本研究通過對星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和外顯組高通量測序數(shù)據(jù)進(jìn)行深度分析，共計(jì)檢測出外顯組中A-to-I RNA 編輯位點(diǎn)1751 個(gè)。

編碼區(qū)的RNA 編輯可能會(huì)導(dǎo)致氨基酸的改變，對機(jī)體生命活動(dòng)產(chǎn)生影響，目前已明確生物學(xué)意義的RNA編輯位點(diǎn)大多位于基因編碼區(qū)。本項(xiàng)目旨在鑒定外顯組上A-to-I RNA 編輯位點(diǎn)，通過分析RNA 編輯位點(diǎn)在外顯組上的分布，統(tǒng)計(jì)發(fā)生在CDS 和UTR 區(qū)的編輯位點(diǎn)。在所鑒定出的1751 個(gè)A-to-I RNA 編輯位點(diǎn)中，位于CDS 的位點(diǎn)只是很小的一部分，僅占14.33%，而大多數(shù)位點(diǎn)位于UTR 區(qū)，其中位于5’UTR 的位點(diǎn)占6.28%，位于3’UTR 的位點(diǎn)所占比例最高，達(dá)79.38%。

本研究在CDS 中共檢測到251 個(gè)A-to-I RNA 編輯位點(diǎn)，其中133 個(gè)編輯位點(diǎn)為同義編輯位點(diǎn)，這些編輯位點(diǎn)絕大多數(shù)位于密碼子的第3 位堿基上。由于同義突變不改變所編碼的氨基酸，所以通常認(rèn)為其在進(jìn)化上是“中性”的，對表型沒有影響。然而，最近的一些研究發(fā)現(xiàn)，同義突變并不完全“沉默”，一些同義突變可以通過改變密碼子的使用偏性、翻譯效率、mRNA 二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、選擇性剪接以及miRNA 靶標(biāo)識別等過程影響基因的表達(dá)。需要進(jìn)一步的研究來確定外顯組中的同義A-to-I RNA 編輯位點(diǎn)的生物學(xué)作用。

另外，我們對其中118 個(gè)錯(cuò)義A-to-I RNA 編輯位點(diǎn)進(jìn)行了系統(tǒng)分析。結(jié)果顯示這些錯(cuò)義編輯位點(diǎn)分布在102 個(gè)基因上，其中MUC4 基因上有6 個(gè)位點(diǎn)，RPEL1基因上有4 個(gè)位點(diǎn)，SETSIP 基因上有3 個(gè)位點(diǎn)，AC011 005.1、CD52、DHDDS、HNRNPA1P48、PKD1 和UVSSA基因各有2 個(gè)位點(diǎn)，其余基因各有1 個(gè)位點(diǎn)。這些錯(cuò)義A-to-I RNA 編輯位點(diǎn)多位于密碼子第1 位或者第2位堿基上，共導(dǎo)致25 種類型的氨基酸替換，其中替換較多的為Thr/Ala、Val/Ala 和Ser/Gly 三種類型，Cys/Arg、Leu/Ser 和Tyr/Cyc 最少。本研究發(fā)現(xiàn)，1 號染色體和X 染色體上各有1 個(gè)腺苷酸經(jīng)A-to-I RNA 編輯后，其所在的終止密碼子均突變?yōu)榘被峋幋a密碼子。我們推測這2 個(gè)位點(diǎn)的編輯對于合成具有正常功能的蛋白質(zhì)是至關(guān)重要的，假如不編輯或發(fā)生編輯異常，會(huì)使蛋白質(zhì)合成提前終止，進(jìn)而對機(jī)體正常生命活動(dòng)造成影響。

真核生物5’UTR 含有二級和三級結(jié)構(gòu)以及其他序列元件，可以調(diào)節(jié)帽依賴翻譯起始和非帽依賴翻譯起始，前者通過解旋酶介導(dǎo)的RNA 結(jié)構(gòu)重塑和高階RNA（higher-order RNA）相互作用來調(diào)節(jié)翻譯起始，后者可通過IRES、mRNA 修飾和其他特殊的翻譯途徑來調(diào)節(jié)。位于終止密碼子與poly（A）尾之間的3’UTR 在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要作用：通過富AU 元件（rich AU element）來調(diào)節(jié)mRNA 的穩(wěn)定性；調(diào)控mRNA 的定位表達(dá)和翻譯；結(jié)合多個(gè)RNA 結(jié)合蛋白來行使調(diào)控功能；調(diào)控蛋白-蛋白相互作用。本研究在5’UTR 和3’UTR 鑒定了大量的A-to-I RNA 編輯位點(diǎn)，這些位點(diǎn)的編輯可能對基因的正常表達(dá)，機(jī)體生命活動(dòng)的正常進(jìn)行具有重要意義。

本研究運(yùn)用高通量測序技術(shù)對星形膠質(zhì)細(xì)胞外顯組和轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了深度測序，初步鑒定了星形膠質(zhì)細(xì)胞外顯組中的A-to-I RNA 編輯位點(diǎn)，但是，這些位點(diǎn)在神經(jīng)發(fā)育、神經(jīng)系統(tǒng)功能以及神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生的機(jī)制層面的分析仍待進(jìn)一步的探索。