尹蕾麗,周 紛,姚林燕,王錫昌,*

(1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306; 2.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心,上海 201306; 3.農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(上海),上海 201306)

鮑魚又稱鰒魚、海耳等,屬軟體動(dòng)物門(Mollusca),腹足綱(Gastropoda)、鮑科(Haliotidae),是我國(guó)名貴的海產(chǎn)品,由于其營(yíng)養(yǎng)含量豐富、味道鮮美及口感獨(dú)特,深受全世界人們的喜愛[1-3]。我國(guó)是世界第一養(yǎng)鮑大國(guó),隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展及市場(chǎng)需求的提高,鮑魚的養(yǎng)殖產(chǎn)量呈逐年上升趨勢(shì),據(jù)2018中國(guó)漁業(yè)年鑒統(tǒng)計(jì),總產(chǎn)量約為16.3萬(wàn)噸,相比2017年增長(zhǎng)了9.85%[4],鮑魚現(xiàn)已成為家庭餐桌上的常見食材。我國(guó)現(xiàn)共有七大經(jīng)濟(jì)鮑類,其中皺紋盤鮑(Haliotisdiscushannai)是個(gè)頭最大、品質(zhì)最好、銷量最高的。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)鮑魚的研究主要集中在養(yǎng)殖[5-6]、生長(zhǎng)特性[7]、副產(chǎn)物開發(fā)[8-10]及加工特性[11-12]等方面,而對(duì)鮑魚原料學(xué)屬性的關(guān)注較少。除活品外,鮑魚常見的銷售形式還有冷凍、干制及罐裝等,在日本,鮑魚也常常被制作成刺身后進(jìn)行銷售和食用[2-3]。不同的加工方式,對(duì)肌肉的滋味、口感及營(yíng)養(yǎng)等方面均會(huì)帶來(lái)不同的程度影響,而這與肌肉本身特性息息相關(guān)。雖然已有學(xué)者[13-15]對(duì)鮑魚肌肉質(zhì)地方面進(jìn)行過相關(guān)性研究,但我國(guó)對(duì)鮑魚肌肉性質(zhì)的基礎(chǔ)性研究依然薄弱。

肌原纖維蛋白與膠原蛋白是構(gòu)成鮑魚肌肉的主要蛋白,其相對(duì)含量、相互作用等對(duì)于肌肉質(zhì)地的影響較大[16]。肌原纖維蛋白可以維持肌肉細(xì)胞骨架的完整性,而膠原蛋白的含量與肌肉的嫩度顯著相關(guān)[17]。另外,值得注意的是鮑魚肌原纖維蛋白中副肌球蛋白含量較高,這對(duì)鮑魚在加工過程中肌肉質(zhì)地的變化有著重要影響[16]。因此,本研究從食品原料學(xué)角度出發(fā),對(duì)皺紋盤鮑不同部位肌肉的營(yíng)養(yǎng)、蛋白組成、分布及微觀組織展開初步研究,為后續(xù)加工方式對(duì)肌肉特性影響的研究提供理論依據(jù),完善我國(guó)鮑類肌肉特性的基礎(chǔ)性研究數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

皺紋盤鮑(Haliotisdiscushannai) 上海蘆潮港海鮮市場(chǎng);CuSO4、K2SO4優(yōu)級(jí)純,上海麥克林生化科技有限公司;二甲苯 分析純,上海生工生物有限公司;十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑 美國(guó)Sigma公司;Van Gieson試劑盒 上海源葉生物科技有限公司。

H2050R高速冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀有限公司;FOSS8400凱氏定氮儀 福斯分析儀器公司;RM2245石蠟切片機(jī) 德國(guó)萊卡公司;ECLIPSE 80i高級(jí)研究級(jí)顯微鏡 上海尼康儀器有限公司;MesoMR23-060H.I低場(chǎng)核磁共振成像分析儀 上海紐邁科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料處理 2019年11月上旬,從上海市蘆潮港海鮮市場(chǎng)某海鮮批發(fā)店購(gòu)入同一捕撈地點(diǎn)、時(shí)間及批次的皺紋盤鮑,活體運(yùn)輸至上海海洋大學(xué)研究室,個(gè)體平均質(zhì)量為(34.96±2.78) g。將活品鮑魚清洗后去殼、去內(nèi)臟等,后進(jìn)行分離。

1.2.2 腹足肌肉組成 按照?qǐng)D1所示,將腹足肌肉分成閉殼肌(A)、過渡區(qū)(B)及裙邊(C)三部分進(jìn)行后續(xù)測(cè)定。

圖1 皺紋盤鮑腹足肌肉的劃分Fig.1 Division of H. discus hannai muscle

1.2.3 基本營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定

1.2.3.1 水分的測(cè)定 參照GB 5009.3-2016《食品中水分的測(cè)定》。

1.2.3.2 粗蛋白的測(cè)定 參照GB 5009.5-2016《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》凱氏定氮法。

1.2.3.3 粗脂肪的測(cè)定 參照GB 5009.6-2016索氏抽提法。

1.2.3.4 灰分的測(cè)定 參照GB/T 5009.4-2016高溫灼燒法。

1.2.3.5 總糖的測(cè)定 參照GB 9695.31-2008分光光度法。

1.2.4 蛋白的分離 含氮物的分離參照張龍[18]的方法,并略有修改。具體操作:取2.5 g樣品于離心管中,加入6倍體積0.1 mol/L的NaCl,20 mmol/L Tris-HCl(pH=7.5)緩沖液,均質(zhì)90 s后,以300 r/min的轉(zhuǎn)速攪拌30 min,然后在12000×g的轉(zhuǎn)速下離心10 min,保留上清液,在沉淀中繼續(xù)加入6倍體積0.1 mol/L的NaCl,20 mmol/L Tris-HCl(pH=7.5)緩沖液攪拌、離心(同上),此過程重復(fù)2遍,合并上清液即為水溶性蛋白。隨后在沉淀中加入6倍體積0.6 mol/L的NaCl,20 mmol/L Tris-HCl(pH=7.5)緩沖液攪拌、離心(同上),重復(fù)4次,合并上清液即為鹽溶性蛋白。在沉淀中加入6倍體積0.1 mol/L的NaOH溶液攪拌,過夜攪拌,離心(同上)取得的上清液即為堿溶性蛋白,沉淀為基質(zhì)蛋白,所有操作均在4 ℃下進(jìn)行。

1.2.5 蛋白分布測(cè)定 將蛋白溶液與電泳上樣液以4∶1的比例混合,于100 ℃煮沸5 min制得電泳樣品。采用SDS-PAGE法進(jìn)行蛋白組分分析,參照張龍[18]的方法,其中濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%,分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.5%。

1.2.6 顯微結(jié)構(gòu)觀察 將鮑魚切成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的正方體浸入10%福爾馬林中固定24 h,接著用70%、85%、90%、95%、100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ逐級(jí)脫水4 h、2 h、2 h、1 h、30 min及30 min,后將樣品置于乙醇與二甲苯混合液(1∶1)中浸泡5 min,取出置于二甲苯I溶液(100%)中浸泡10 min,取出后立即放入二甲苯II溶液(100%)中浸泡10 min左右,待樣品呈現(xiàn)透明狀態(tài)時(shí)結(jié)束浸泡,然后將樣品浸入65 ℃石蠟中包埋3 h后,切片、烤片、采用Van Gieson染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)組測(cè)定3平行,數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,使用SPSS 17.0軟件和Microsoft Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,采用Duncan法進(jìn)行顯著性差異分析處理,顯著水平P<0.05。

表2 皺紋盤鮑腹足不同部位肌肉的基本營(yíng)養(yǎng)成分分析Table 2 Analysis of the basic nutrient composition of muscles in different parts of H. discus

2 結(jié)果與分析

2.1 腹足肌肉組成

表1為鮑魚腹足不同部位肌肉的一般質(zhì)量組成。鮑魚屬于單殼貝類,與以貝柱為主的扇貝不同的是,鮑魚的整個(gè)腹足肌肉部分是其可食部位,主要由肌原纖維蛋白和膠原蛋白所構(gòu)成。研究表明,鮑魚的閉殼肌主要由肌原纖維蛋白構(gòu)成,而裙邊部分主要是膠原蛋白,從中心到邊緣部分,肌原纖維蛋白的含量逐漸減少,膠原蛋白的含量逐漸增多[15,17]。另外,膠原蛋白的含量與肌肉的韌性存在相關(guān)性,含量越高,肌肉質(zhì)地越緊實(shí)[17],因此對(duì)腹足肌肉部分進(jìn)行細(xì)分和研究是有必要的。從表1中可以看出,鮑魚肌肉中閉殼肌部位質(zhì)量占比最多,高達(dá)38.99%,其次為過渡區(qū)及裙邊部分,整個(gè)腹足肌肉占總重量約35%左右。與菲律賓蛤仔(3.00%)、蝦夷扇貝(12.41%)、海灣扇貝(11.24%)、櫛孔扇貝(14.08%)等[18-19]相比,其可食部分所占比例較大。

表1 鮑魚不同部位肌肉占腹足及整貝的質(zhì)量比(%)Table 1 The general weight compositionsof H. discus hannai(%)

2.2 基本營(yíng)養(yǎng)成分分析

皺紋盤鮑不同部位肌肉的基本營(yíng)養(yǎng)成分分析結(jié)果如表2所示。從肌肉的中心到邊緣部位,水分含量呈顯著遞增趨勢(shì)(P<0.05),而粗脂肪含量呈顯著遞減趨勢(shì)(P<0.05),這與郝林娟等[13]對(duì)鮑魚不同部位肌肉研究的結(jié)果相似。與其他貝類相比,皺紋盤鮑的蛋白含量較高,其含量高于菲律賓蛤仔(6.91%～10.39%)[18]、華貴櫛孔扇貝(14.30%)[20]、長(zhǎng)江口河蜆(9.29%)[21]及翡翠貽貝(10.60%)[22]等,而脂肪含量又遠(yuǎn)低于麗文蛤(3.52%)、海灣扇貝(2.21%)[23]及蝦夷扇貝(1.24%)[24]等,是一種高蛋白低脂肪的貝類。三個(gè)部位的肌肉在灰分含量方面不存在顯著性差異(P>0.05),裙邊部分的總糖含量顯著低于閉殼肌及過渡區(qū)部分(P<0.05),這與肖桂華等[14]的研究結(jié)果相似。一般來(lái)說(shuō),貝類中作為主要能量貯藏形式的糖原含量較為豐富,其含量會(huì)隨季節(jié)、產(chǎn)地的不同而有所不同[25]。另外,糖原的濃度與水分呈負(fù)相關(guān),當(dāng)糖原濃度最高時(shí),鮑魚的滋味最鮮美[26]。

2.3 蛋白組成分析

鮑魚肌肉中蛋白組成如表3所示?？诟小⒆涛?、營(yíng)養(yǎng)等特性是鮑魚作為名貴水產(chǎn)品深受人們的喜愛原因。從部位來(lái)看,閉殼肌、過渡區(qū)及裙邊中非蛋白氮含量不存在顯著性差異(P>0.05)。非蛋白氮中包含了一些小分子多肽、游離氨基酸、核苷酸等物質(zhì),它們對(duì)呈味起重要作用[25]。在鹽溶性蛋白、堿溶性蛋白和基質(zhì)蛋白含量上三個(gè)部位存在顯著性差異(P<0.05),表現(xiàn)為從邊緣到中間鹽溶性蛋白與堿溶性蛋白含量依次增加,而肌基質(zhì)蛋白含量逐漸減少。堿溶性蛋白主要是一些變性蛋白,如交聯(lián)的肌原纖維蛋白,其含量的變化與蛋白質(zhì)中氫鍵、離子鍵、二硫鍵等的形成相關(guān)[27-28]。鹽溶性蛋白和膠原蛋白是維持肉細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整的兩種主要的蛋白[16],含量的變化在一定程度上可以反映蛋白質(zhì)變性情況。另外,可以發(fā)現(xiàn)裙邊部分基質(zhì)蛋白含量約為過渡區(qū)的兩倍,閉殼肌部分的三倍?；|(zhì)蛋白中主要成分為膠原蛋白,含量隨部位的變化與Olaechea[17]、郝林娟[13]、肖桂華[14]等的研究一致。膠原蛋白是結(jié)締組織的主要成分,也是肌肉中另一種重要作用的蛋白質(zhì)。膠原蛋白不僅可以作為蛋白質(zhì)與多糖相互作用網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分,還可以影響細(xì)胞骨架的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),介導(dǎo)細(xì)胞粘附及細(xì)胞遷移[29]。研究表明鮑魚腹足肌肉中肌原纖維蛋白含量約占總蛋白的40%～50%,膠原蛋白約占20%～35%[30],與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果相似,但樣品及蛋白分離方法的不同也會(huì)產(chǎn)生不一樣的結(jié)果[31]。

從蛋白含量來(lái)看,各組織中鹽溶性蛋白(30.59%～42.22%)與非蛋白氮(33.68%～35.16%)含量相對(duì)較高,水溶性蛋白(2.39%～2.85%)含量相對(duì)較低。水溶性蛋白的存在對(duì)肌原纖維蛋白凝膠性有一定影響,據(jù)報(bào)道,將肌漿蛋白加入富含肌原纖維蛋白的魚糜中可增強(qiáng)魚糜的強(qiáng)度、彈性、硬度等,改善其質(zhì)地特性[32-33]。另外,肌漿蛋白對(duì)肌肉的色澤、保水性也有影響。Mcloughlin等[34]發(fā)現(xiàn)肌漿蛋白沉淀會(huì)掩蓋肌漿的紅色,導(dǎo)致豬肉色澤發(fā)白。閉殼肌與過渡區(qū)的蛋白組成相似,含量依次為鹽溶性蛋白>非蛋白氮>堿溶性蛋白>基質(zhì)蛋白>水溶性蛋白。裙邊略有不同,含量最高的為非蛋白氮,達(dá)34.19%,剩下的依次為鹽溶性蛋白、基質(zhì)蛋白、堿溶性蛋白和水溶性蛋白。一般來(lái)說(shuō),非蛋白氮的含量越高,肌肉的風(fēng)味越好[35-37]。

表3 皺紋盤鮑腹足不同部位肌肉蛋白組成分析Table 3 Analysis of muscle protein composition in different parts of H. discus hannai

圖2 皺紋盤鮑腹足不同部位肌肉的SDS-PAGE圖Fig.2 SDS-PAGE patterns of proteins in different parts of H. discus hannai注:M. 標(biāo)準(zhǔn)蛋白;1. 閉殼肌;2. 過渡區(qū);3. 裙邊。

2.4 蛋白分布分析

圖2顯示了鮑魚不同部位肌肉的蛋白的SDS-PAGE圖。從圖2中可以看出,鮑魚的全蛋白分子量分布在25～245 kDa范圍內(nèi),蛋白分布模式相似,種類豐富,主要以肌球蛋白重鏈(220 kDa)、副肌球蛋白(100 kDa)和肌動(dòng)蛋白(48 kDa)為主。由中心到邊緣部位,在135～245 kDa和25～35 kDa之間的蛋白條帶變淺或消失,這可能與上面所測(cè)的蛋白含量相符合。另外,可以發(fā)現(xiàn)在245 kDa附近有明顯條帶,推測(cè)可能為肌球蛋白重鏈多聚體、膠原蛋白等[18]。

水溶性蛋白中主要含有一些與糖酵解有關(guān)的酶類,AMP-脫氨酶、小清蛋白和細(xì)胞色素C等水溶性物質(zhì)[38]。由水溶性蛋白的SDS-PAGE圖中可以看出,三個(gè)部位的蛋白條帶較多,分布相似,無(wú)明顯新的條帶產(chǎn)生。但裙邊在135～180及<48 kDa 范圍內(nèi)的蛋白條帶少于其他兩部位。

肌原纖維蛋白由粗絲和細(xì)絲構(gòu)成,粗絲主要包括肌球蛋白與副肌球蛋白,細(xì)絲主要包括肌動(dòng)蛋白、原肌球蛋白和肌鈣蛋白。由鹽溶性蛋白的SDS-PAGE圖可以看出,肌原纖維蛋白也是主要以肌球蛋白重鏈、副肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白為主,這與郝林娟等[13]報(bào)道的南日鮑蛋白組成類似。軟體動(dòng)物與脊椎動(dòng)物最大的不同點(diǎn)在于副肌球蛋白含量特別高,在鮑魚肌原纖維蛋白中的含量可達(dá)35.8%[16]。少量的副肌球蛋白有助于肌肉凝膠的形成,賦予凝膠制品更好的彈性,但過量則會(huì)使凝膠制品變得堅(jiān)硬[39-40]。裙邊在<35 kDa部分條帶基本不可見,且主要的蛋白條帶較細(xì),說(shuō)明其所含的蛋白含量較低,這與上述所測(cè)的蛋白分布結(jié)果一致。

堿溶性蛋白中所含條帶較少,蛋白組成較簡(jiǎn)單。可以發(fā)現(xiàn),裙邊部分只在100及42 kDa附近看到明顯條帶,可能是因?yàn)檫@部分所含的變性蛋白較少。膠原蛋白是基質(zhì)蛋白的主要組成成分,其含量與肌肉的韌性緊密相關(guān)[16-17]。無(wú)脊椎動(dòng)物中膠原蛋白主要為I型和V型,其中I型廣泛存在于間質(zhì)結(jié)締組織中,V型廣泛存在于細(xì)胞周圍結(jié)締組織中[29,41]，圖中在>245 kDa以上有蛋白條帶存在,推測(cè)為交聯(lián)結(jié)締組織。三部分肌肉在100～135 kDa存在條帶,推測(cè)為膠原蛋白的α鏈。膠原蛋白有α、β、γ三種構(gòu)象,兩條α鏈可組成一條β鏈,三條α鏈可組成一條γ鏈[42]。袁起新[42]對(duì)鮑魚膠原蛋白性質(zhì)的研究中發(fā)現(xiàn),鮑魚可能存在兩種或多種類型的膠原,其中主要的結(jié)構(gòu)類型為(α1)3,另外的結(jié)構(gòu)需要通過免疫印跡鑒定。

2.5 顯微結(jié)構(gòu)觀察

圖3 皺紋盤鮑不同部位肌肉的光學(xué)顯微結(jié)構(gòu)圖Fig.3 Light microscopical feature of muscles in different parts of H. discus hannai注:A、B、C分別表示閉殼肌、過渡區(qū)及裙邊三部分;1、2分別表示肌肉的橫切面與縱切面。

圖3所示為皺紋盤鮑不同部位肌肉在光學(xué)顯微鏡(200倍)下的橫切與縱切圖片。根據(jù)Van Gieson染色原理,肌纖維呈現(xiàn)黃色,而膠原纖維呈現(xiàn)紅色。從圖中可以看到從閉殼肌到裙邊部分,黃色逐漸減少,而紅色逐漸增多,表明肌原纖維呈遞減趨勢(shì)而膠原纖維呈遞增趨勢(shì),這與圖2的測(cè)定結(jié)果相一致,且與肖桂華等[14]、?iseth等[43]的研究結(jié)果相同。另外,可以發(fā)現(xiàn)相同部位肌肉的橫切面與縱切面存在差異性。在橫切面中纖維主要呈點(diǎn)狀,少量條狀存在,而縱切面中纖維主要呈條狀,膠原隨機(jī)分布在肌纖維中間。閉殼肌部分的纖維粗短,分布存在一定的方向性,纖維間間隙較小,而裙邊部分纖維細(xì)長(zhǎng)排列呈雜亂無(wú)序,纖維間間隙較大。對(duì)于海洋軟體動(dòng)物來(lái)說(shuō),纖維束的直徑、粗細(xì)及纖維與纖維間的距離等都會(huì)影響鮑魚肌肉的質(zhì)地,纖維束越小,肌肉越緊實(shí)[43]。這些形態(tài)上的差異與后續(xù)加工中肌肉的品質(zhì)同樣密切相關(guān)。

3 結(jié)論

皺紋盤鮑不同部位肌肉在營(yíng)養(yǎng)成分、蛋白含量及分布、組織結(jié)構(gòu)都存在一定的差異,這將會(huì)對(duì)肌肉質(zhì)地產(chǎn)生不同程度的影響。研究結(jié)果表明三個(gè)部位中閉殼肌部分在營(yíng)養(yǎng)含量方面優(yōu)于其他兩部分。此部分肌肉中肌原纖維蛋白含量較高且肌肉組織緊密、纖維間隙較小,而裙邊部分膠原蛋白含量較高且肌纖維間間隙較大。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)肌肉中幾種不同蛋白特性的研究以探索蛋白特性與其食用品質(zhì)之間的關(guān)聯(lián)性,豐富我國(guó)水產(chǎn)品基礎(chǔ)性研究數(shù)據(jù),為今后鮑魚的深加工提供相關(guān)的理論支撐和實(shí)踐依據(jù)。由于不同部位肌肉的差異性,今后工業(yè)上可以針對(duì)其不同位置肌肉硬度、韌性的不同,針對(duì)不同人群(老人、兒童、年輕人)的食用習(xí)慣開發(fā)出新的產(chǎn)品。此外,針對(duì)不同位置的蛋白差異性,本研究還可為今后凍品加工中保鮮劑的使用(位置、方式)提供新的思路。