鄧麗娟 劉睿婷 胡小霞 黃 瓊 李新霞
1.新疆埃樂欣藥業(yè)有限公司,新疆 烏魯木齊 830013 2.新疆醫(yī)科大學(xué),新疆 烏魯木齊 830011
大蒜(AlliumsativumL.)是世界公認(rèn)的藥食兩用植物,也是為數(shù)不多以鮮品形式收錄于中國(guó)藥典的藥材,能解毒消腫、殺蟲、止痢,用于癰腫瘡瘍、疥癬、肺癆、頓咳、泄瀉、痢疾等疾病治療[1]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明大蒜功效成分具有抗感染[2]、抗腫瘤[3]、防治心腦血管疾病[4]、保護(hù)肝臟[5]、提高機(jī)體免疫力[6]、降三高[7-8]等作用。但是新鮮大蒜保質(zhì)期太短,即使存放在2~8 ℃的冷庫(kù)中超過10個(gè)月也會(huì)變質(zhì)。文獻(xiàn)研究證實(shí)將新鮮大蒜冷凍干燥,加工成蒜片或蒜粉,在冷庫(kù)中可保質(zhì)5年以上,有較強(qiáng)的蒜辣味,且殺菌的效果與新鮮大蒜一致[9]。由于大蒜凍干粉具有:制備工藝簡(jiǎn)單、零添加、生產(chǎn)成本低、儲(chǔ)存運(yùn)輸方便,尤其是完整的保留大蒜的功效成分等優(yōu)勢(shì),被美國(guó)藥典[10]、英國(guó)藥典[11]和歐盟藥典[12]收錄作為膳食補(bǔ)充劑,而中國(guó)藥典僅收錄大蒜藥材標(biāo)準(zhǔn),缺少大蒜粉這一品種,嚴(yán)重限制了大蒜藥用及保健制劑的開發(fā)。因此,急需建立大蒜粉相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),為制備安全、有效、質(zhì)量可控的大蒜類保健食品和藥品提供科學(xué)依據(jù)。
世界公認(rèn)大蒜的活性成分是蒜酶催化蒜氨酸產(chǎn)生的大蒜辣素,大蒜辣素極不穩(wěn)定,可進(jìn)一步分解產(chǎn)生系列含硫化合物[13]。蒜氨酸是大蒜辣素的前體物質(zhì),化學(xué)性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定,美國(guó)藥典以蒜氨酸和甲硫氨酸作為大蒜粉的薄層鑒別成分,英國(guó)藥典和歐盟藥典大蒜粉的薄層鑒別以丙氨酸替代蒜氨酸,現(xiàn)有文獻(xiàn)僅報(bào)道了大蒜原藥材、有效部位蒜氨酸薄層鑒別方法[14-16],對(duì)大蒜粉薄層鑒別方法的研究鮮有報(bào)道。本研究參考美國(guó)藥典、歐盟藥典、英國(guó)藥典大蒜粉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)文獻(xiàn),建立大蒜粉薄層鑒別方法,為大蒜粉的質(zhì)量控制提供依據(jù)。
1.1 儀器 電子天平(AB135-S,梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易有限公司),硅膠G薄層板(青島海洋化工分廠,德國(guó)Merk公司,安徽良臣硅源材料有限公司)。
1.2 試藥 甲醇(分析純,天津百世化工)、正丁醇(分析純,天津永晟精細(xì)化工)、正丙醇(分析純,西安化學(xué)試劑廠)、冰乙酸(分析純,天津富宇精細(xì)化工)、無水乙醇(分析純,天津富宇精細(xì)化工)、茚三酮(分析純,上海試劑三廠)。
蒜氨酸對(duì)照品(批號(hào)AL080428,新疆埃樂欣藥業(yè)有限公司)。
大蒜粉為來自不同產(chǎn)地的大蒜鱗莖經(jīng)去皮,切碎、真空冷凍干燥加工制成,其中Y201811001批次來源于新疆皮山縣桑珠鄉(xiāng),Y201811004、Y201811005和2018110006來源于新疆皮山縣克里昂鄉(xiāng),Y201904003批次來源于新疆吉木薩爾縣,Y201901021批次來源于新疆且末縣。生產(chǎn)加工方為新疆埃樂欣藥業(yè)有限公司。
2.1 溶液的配制
2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 取蒜氨酸對(duì)照品適量,加50%甲醇溶液制成每1mL含1mg的溶液,即得。
2.1.2 供試品溶液的制備 稱取1 g大蒜粉,加甲醇5 mL,振搖,靜置,取上清液即得。
2.1.3 茚三酮溶液的配制 顯色劑1(英國(guó)/歐盟藥典):精密稱取適量茚三酮,加冰乙酸—丁醇=5∶95溶液溶解,制成2 g/L茚三酮溶液(冰乙酸-丁醇,5∶95)。
顯色劑2(美國(guó)藥典):精密稱取適量茚三酮,加正丁醇-2 moL/L冰乙酸=19∶1溶液溶解,制成0.2%茚三酮溶液(正丁醇-2 mol/L冰乙酸溶液,19∶1)。
顯色劑3:精密稱取適量茚三酮,加無水乙醇溶解,制成2 g/L茚三酮無水乙醇溶液。
2.3 薄層色譜條件優(yōu)選
2.3.1 供試品制備方法考察 分別按照三種方法制備供試品溶液:
①歐盟藥典供試品溶液制備: 取1 g大蒜粉,加甲醇5 mL,振搖60 s,濾過,作為供試品溶液1。
②美國(guó)藥典供試品溶液制備:取1 g大蒜粉,加甲醇-水(1∶1)20 mL,超聲10 min,離心(轉(zhuǎn)速為8000轉(zhuǎn)/min)10 min,取上清液,沉淀加甲醇-水(1∶1)20 mL,再超聲10 min,合并兩次上清液,濃縮至5 mL,作為供試品溶液2。
③課題組方法供試品溶液制備:取1g大蒜粉,置具塞錐形瓶中,加50%甲醇20 mL溶解,超聲10 min,離心(轉(zhuǎn)速為8000轉(zhuǎn)/min)10 min,取上清液,作為供試品溶液3。
分別取對(duì)照品溶液和上述供試品溶液各5 μL,點(diǎn)于同一薄層板上,以正丁醇-冰醋酸-水(4∶1∶1)展開劑,展開,取出,晾干,噴以0.2%茚三酮乙醇溶液,在105 ℃下加熱至斑點(diǎn)清晰,檢視,如圖1所示。結(jié)果表明:三種方法制備的供試品溶液主斑點(diǎn)與對(duì)照品溶液斑點(diǎn)的顏色、位置相同,均有較好的分離度,故供試品溶液制備方法選擇操作簡(jiǎn)單的歐盟藥典方法。
從左到右依次為:對(duì)照品溶液、供試品溶液1、供試品溶液3、供試品溶液2圖1 不同供試品制備方法比較
2.3.1 展開系統(tǒng)選擇 吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各5μL,點(diǎn)于同一薄層板上,分別以冰乙酸-丙醇-水-無水乙醇(1∶1∶1∶2)、正丁醇-正丙醇-冰乙酸-水(3∶1∶1∶1)、正丁醇-冰醋酸-水(4∶1∶1)為展開劑,展開,取出,晾干,再噴氨基酸專屬顯色劑0.2%茚三酮乙醇溶液,在105℃加熱,蒜氨酸斑點(diǎn)均清晰可見,如圖2所示。采用冰乙酸-丙醇-水-無水乙醇(1∶1∶1∶2)為展開劑,展開,對(duì)照品溶液與供試品溶液Rf(0.7)值較大,且分離度較差;采用正丁醇-正丙醇-冰乙酸-水(3∶1∶1∶1)和正丁醇-冰醋酸-水(4∶1∶1)為展開劑,展開,對(duì)照品溶液與供試品溶液Rf(0.43-0.48)值適中,分離度均良好,確定配制方法簡(jiǎn)單、使用有機(jī)溶劑種類少的正丁醇-冰醋酸-水(4∶1∶1)為最佳展開系統(tǒng)。
A B C左:對(duì)照品溶液;右:供試品溶液A.冰乙酸-丙醇-水-無水乙醇(20∶20∶20∶40);B.正丁醇-正丙醇-冰乙酸-水(3∶1∶1∶1);C.正丁醇-冰醋酸-水(4∶1∶1)圖2 展開劑考察結(jié)果
A B C左:對(duì)照品溶液;右:供試品溶液A.2g/L茚三酮溶液(冰乙酸-丁醇,5∶95);B.0.2%茚三酮溶液(正丁醇-2 mol/L冰乙酸溶液,19∶1);C.0.2%茚三酮無水乙醇溶液圖3 顯色劑考察結(jié)果
2.3.2 顯色劑的選擇 吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各5μL,點(diǎn)于同一薄層板上,以正丁醇-冰醋酸-水(4∶1∶1)為展開劑,展開,取出,晾干,分別噴以2 g/L茚三酮溶液(冰乙酸-丁醇,5∶95)、0.2%茚三酮溶液(正丁醇-2 moL/L冰乙酸溶液,19∶1)、0.2%茚三酮乙醇溶液三種顯色劑,在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顏色清晰,檢視,如圖3所示。結(jié)果表明,三種顯色劑均可使主斑點(diǎn)顯色清晰,故選擇制備方法簡(jiǎn)單,使用有機(jī)溶劑種類最少的課題組方法,即0.2%茚三酮無水乙醇溶液為顯色劑。
從左到右依次為:對(duì)照品溶液3 μL、5 μL、7 μL,供試品溶液3 μL、5 μL、7 μL圖4 點(diǎn)樣量考察結(jié)果
2.3.3 點(diǎn)樣量的選擇 吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各3 μL、5 μL和7 μL,點(diǎn)于同一薄層板上,以正丁醇-冰醋酸-水(4∶1∶1)為展開劑,展開,取出,晾干,噴以0.2%茚三酮無水乙醇溶液,在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰,立即檢視,如圖4所示。結(jié)果顯示:對(duì)照品溶液和供試品溶液點(diǎn)樣量在3~7 μL范圍內(nèi),各斑點(diǎn)清晰,且分離度較好,故選擇點(diǎn)樣量為均為5 μL。
2.4 耐用性考察
2.4.1 不同廠牌薄層板的考察 吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各5 μL,分別點(diǎn)于三個(gè)不同廠家生產(chǎn)的硅膠G薄層板上,以正丁醇-冰醋酸-水(4∶1∶1)為展開劑,展開,取出,晾干,噴以0.2%茚三酮乙醇溶液,在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰,立即檢視,如圖5所示。結(jié)果顯示:三種硅膠G薄層板分離效果良好,表明該色譜條件耐用性良好。
2.4.2 不同溫度考察 吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各5 μL,點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以正丁醇-冰醋酸-水(4∶1∶1)為展開劑,分別于4 ℃、20 ℃、35 ℃展開,取出,晾干,噴以0.2%茚三酮無水乙醇溶液,在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顏色清晰,立即檢視,如圖6所示。結(jié)果顯示:20 ℃和35 ℃,供試品薄層色譜分離效果良好,但在4 ℃主斑點(diǎn)與雜質(zhì)斑點(diǎn)未完全分離,分離效果稍差一些,表明在20~35 ℃范圍內(nèi),溫度對(duì)薄層色譜鑒別影響較小。
A B C左:對(duì)照品溶液,右:供試品溶液A.青島海洋;B.安徽良臣;C.德國(guó)默克圖5 不同廠家硅膠板考察結(jié)果
A B C左:對(duì)照品溶液;右:供試品溶液A.4 ℃;B.20 ℃;C.35 ℃圖6 不同溫度考察結(jié)果
2.4.3 不同相對(duì)濕度考察 在雙側(cè)展開缸的一側(cè)分別加入適當(dāng)濃度的硫酸溶液,得到相對(duì)濕度分別為RH42%、RH65%、RH88%的環(huán)境[1]。取供試品溶液和對(duì)照品溶液各5 μL,點(diǎn)于同一薄層板,放在另一側(cè)槽中,密閉放置30 min左右,以正丁醇-冰醋酸-水(4∶1∶1)展開,取出,晾干,以2 g/L茚三酮無水乙醇溶液顯色,在105 ℃下加熱至斑點(diǎn)清晰,置日光下檢視,如圖7所示。結(jié)果顯示:濕度對(duì)蒜氨酸對(duì)照品與供試品的分離度并未產(chǎn)生影響。
A B C左:對(duì)照品溶液;右:供試品溶液A.RH 42%;B.RH 65%;C.RH 88% 圖7 濕度對(duì)分離度影響
2.5 不同批次大蒜粉的薄層鑒別 按上述實(shí)驗(yàn)確定的色譜條件,對(duì)來自不同產(chǎn)地大蒜加工的六批次大蒜粉進(jìn)行薄層鑒別,如圖8所示,結(jié)果顯示:在與對(duì)照品相對(duì)應(yīng)的位置,供試品顯示相同顏色斑點(diǎn),不同產(chǎn)地大蒜制得的大蒜粉色譜圖一致。
從左到右依次為:蒜氨酸對(duì)照品;大蒜粉Y201811001;大蒜粉Y201901021;大蒜粉Y201904003;大蒜粉Y201811004;大蒜粉Y201811005;大蒜粉Y201811006圖8 點(diǎn)樣量考察結(jié)果
本研究參照美國(guó)藥典、英國(guó)藥典、歐盟藥典及相關(guān)文獻(xiàn),建立大蒜粉薄層鑒別方法,確定以蒜氨酸為對(duì)照品,以甲醇為提取溶劑制備供試品溶液,點(diǎn)樣量5 μL,正丁醇-冰醋酸-水(4∶1∶1)為展開系統(tǒng),以2 g/L茚三酮無水乙醇溶液為顯色劑,105 ℃下加熱至斑點(diǎn)清晰,置日光下檢視。與美國(guó)藥典、英國(guó)藥典及歐盟藥典大蒜粉薄層鑒別方法相比,新建方法具有以下幾點(diǎn)優(yōu)勢(shì):①英國(guó)藥典和歐盟藥典以丙氨酸替代蒜氨酸做標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),而本研究方法以功效成分蒜氨酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為對(duì)照品,專屬性更強(qiáng),達(dá)到準(zhǔn)確鑒別供試品的目的;②新建方法中供試品制備方法參照歐盟藥典,操作簡(jiǎn)便快速,而美國(guó)藥典及文獻(xiàn)方法中供試品制備方法復(fù)雜,提取時(shí)長(zhǎng)達(dá)3 h,不能滿足薄層色譜鑒別快速和簡(jiǎn)便的要求;③展開劑配制方法最簡(jiǎn)單,且色譜斑點(diǎn)分離效果比歐盟藥典的方法好。
本研究中的大蒜粉為來自不同產(chǎn)地的大蒜經(jīng)切碎、真空冷凍干燥等工藝加工制得,對(duì)多批次大蒜粉進(jìn)行薄層鑒別(僅列出6批薄層鑒別圖譜),結(jié)果顯示各批次供試品色譜圖在與對(duì)照品相應(yīng)位置,顯相同顏色斑點(diǎn),且各批次樣品的色譜圖具有較高相似度,揭示大蒜粉生產(chǎn)工藝穩(wěn)定,且不同產(chǎn)地大蒜中氨基酸的組成差異不大。
本研究建立的薄層色譜鑒別方法具有操作簡(jiǎn)單、專屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn),為控制大蒜粉的生產(chǎn)工藝、產(chǎn)品質(zhì)量提供簡(jiǎn)便易行的檢測(cè)手段,確保以大蒜粉為原料的保健食品和藥品質(zhì)量可控。