鄭夢(mèng)珍，佟延南，翟少偉，林 茂，江興龍，賴曉健，李忠琴

( 1.集美大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，福建 廈門 361021； 2.鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心，福建 廈門 361021；3.廈門市漁用藥物工程技術(shù)研究中心，福建 廈門 361021； 4.海南省海洋與漁業(yè)科學(xué)院，海南 ?？?570206 )

在各類病害中，細(xì)菌性疾病仍是主要的問題，其中無(wú)乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)不僅感染多種養(yǎng)殖魚類，如尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)、斑馬魚(Brachydaniorerio)等[1-2]，而且還能感染人類和哺乳動(dòng)物[3-4]，造成極大的經(jīng)濟(jì)損失?？股氐然瘜W(xué)藥物雖是細(xì)菌性疾病的主要防治手段，但長(zhǎng)期使用會(huì)出現(xiàn)致病菌耐藥性增強(qiáng)、藥物殘留、環(huán)境污染等問題，這使得人們不斷尋求更加安全綠色的防治手段。我國(guó)中草藥儲(chǔ)備非常豐富，其中許多種類具有毒副作用小、抗病毒、抑菌、純天然等優(yōu)點(diǎn)，在治療疾病中有顯著的療效，擁有廣闊的開發(fā)前景[5]。

五倍子(GallaChinensis)是癭綿蚜科，蚜蟲刺傷漆樹科，漆樹屬鹽膚木的葉或葉柄而形成的囊狀蟲癭。五倍子主要有效組分為鞣質(zhì)、沒食子酸等。其中鞣質(zhì)是五倍子的主要組分，含量可達(dá)70%[6]。研究表明，五倍子具有抗菌、抗寄生蟲、抗氧化、止瀉等生物活性[7-10]。五倍子是水產(chǎn)養(yǎng)殖中用于防治細(xì)菌性疾病的重要藥材。Wu等[11-12]研究表明，五倍子對(duì)副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)和單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、遲鈍愛德華菌(Edwardsiellatarda)和嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)的生長(zhǎng)均有明顯抑制作用。中草藥的成分復(fù)雜，在漁業(yè)病害防治工作中很難做到高效利用，因此，在開發(fā)新型高效的漁用藥物過程中，對(duì)中藥的活性物質(zhì)進(jìn)行分離和藥效分析必不可少。

本試驗(yàn)采用高速逆流色譜法，從五倍子粗提物中分析及分離出五倍子活性組分[13]，分離五倍子的溶劑體系通過檢測(cè)器時(shí)，其不同極性的組分會(huì)產(chǎn)生不同大小的信號(hào)，進(jìn)而分離制備。筆者采用根據(jù)生物熱動(dòng)力學(xué)參數(shù)和熱譜圖比較分析藥物藥效作用的微量熱法[14]，測(cè)定五倍子粗提物和各分離組分對(duì)無(wú)乳鏈球菌的體外抑制效果，表現(xiàn)為隨時(shí)間變化所放出的全部熱量，根據(jù)五倍子各組分對(duì)無(wú)乳鏈球菌的半數(shù)抑制質(zhì)量濃度，篩選出具有較好抑制作用的五倍子組分，在制藥過程中去除五倍子無(wú)效組分，提高藥效，降低用藥量，為漁用中藥制劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

五倍子，購(gòu)于福建銘遠(yuǎn)制藥有限公司。

無(wú)乳鏈球菌(TN3L)為本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定保藏菌株。

1.2 儀器與試劑

無(wú)水乙醇(西隴科學(xué)股份有限公司)、乙酸乙酯(西隴科學(xué)股份有限公司)、二甲基亞砜(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純)、腦—心浸出液肉湯(廣東環(huán)凱微生物科技公司)、瓊脂粉(廣東環(huán)凱微生物科技公司)。

大容量高速冷凍離心機(jī)(北京昊諾斯科技有限公司，RC-6 Plus型)、超聲波粉碎儀(南京先歐儀器制造有限公司，X0DL-1000N)、多樣品平行蒸發(fā)儀(瑞士BUCHI，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀R-215)、分析型高速逆流色譜(上海同田生化技術(shù)有限公司，TBE-20A)、制備型高速逆流色譜(上海同田生化技術(shù)有限公司，TBE-300B)、離心濃縮儀(Labconco CentriVap，美國(guó))、滅菌鍋(AUTOCLAVE，美國(guó)，G154DS型)、酶標(biāo)儀(Thermo Scientific，美國(guó)，1510-00669C)、生化培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司， LRH-250)、微量熱儀(Waters LC，美國(guó)，TAMⅢ)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 制備五倍子粗提物

精確稱取五倍子藥粉(粒徑約150 μm)，以料液比1∶5與70%乙醇進(jìn)行混合，浸泡30 min后，在超聲破碎儀下提取30 min，重復(fù)提取2次后，于大容量高速冷凍離心機(jī)中3000 r/min離心20 min，取上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在70 ℃條件下蒸發(fā)獲得浸膏。將所得浸膏烘干后研磨，得到五倍子醇提物藥粉，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 高速逆流色譜儀分析和分離提取五倍子粗提物各組分

通過五倍子組分的結(jié)構(gòu)性質(zhì)和溶劑極性大小確定溶劑最佳分離體系為：乙酸乙酯—乙醇—水(5∶1∶5，體積比)，可分離5個(gè)峰[15]。使用分析型高速逆流色譜儀(HSCCC)(TBE-20A)測(cè)試并驗(yàn)證試驗(yàn)條件，記錄并根據(jù)公式計(jì)算固定相保留率：

固定相保留率/%=(V1-V2)/V1×100%

式中，V1為色譜柱線圈體積，V2為固定相被推出的體積。

利用分析型高速逆流色譜的試驗(yàn)條件，將已確定的溶劑體系在制備型高速逆流色譜上進(jìn)行放大，分離提取出五倍子的不同組分。將收集分離提取物蒸發(fā)干燥后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 微量量熱法測(cè)定五倍子對(duì)無(wú)乳鏈球菌TN3L的生物活性

使用TAMⅢ六通道微量熱儀測(cè)定五倍子各組分及其粗提物對(duì)無(wú)乳鏈球菌的體外抑制作用。精確稱取制備的五倍子醇提物及分離的5個(gè)組分藥粉，選用1 mL 5% 二甲基亞砜作為溶劑對(duì)其進(jìn)行溶解。將6管已經(jīng)過高壓滅菌的安瓿瓶進(jìn)行編號(hào)，在無(wú)菌條件下，向各安瓿瓶中分別加入液體培養(yǎng)基2.25 mL，并接種107cfu/mL的菌液100 μL；在編號(hào)為2～5的安瓿瓶中加入不同體積的藥液以制成具有濃度梯度的處理組，編號(hào)1和編號(hào)6安瓿瓶分別設(shè)置為空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組，結(jié)束操作后密封。提前設(shè)置儀器工作溫度為28 ℃，后按編號(hào)將安瓿瓶分別放入微量量熱儀的6個(gè)通道中，記錄試驗(yàn)，得到關(guān)于細(xì)菌生長(zhǎng)代謝的熱功率隨時(shí)間變化的關(guān)系(P-t)曲線。

1.3.4 細(xì)菌生長(zhǎng)代謝受藥物作用影響下的熱動(dòng)力學(xué)研究

微生物的指數(shù)生長(zhǎng)期中產(chǎn)熱功率(Pt)與速率常數(shù)(k)之間存在如下關(guān)系式[16]：

Pt=P0exp(kt)或lnPt=lnP0+kt

式中，P0為細(xì)菌指數(shù)生長(zhǎng)期起始點(diǎn)的熱功率，t為指數(shù)生長(zhǎng)期中某一對(duì)應(yīng)的t時(shí)刻。

在熱譜曲線上，取指數(shù)生長(zhǎng)期的一段Pt與t的數(shù)值，代入上述公式中，并運(yùn)用Matlab進(jìn)行計(jì)算，得到k值，再與藥物含量(c)擬合成k與c的曲線方程。

為定量描述各組分對(duì)細(xì)菌的抑制效果，通常定義抑制率I如下：

I=(k0-kc)/k0×100%

式中，k0為空白組安瓿瓶中菌株生長(zhǎng)速率常數(shù)，kc為藥物含量為c時(shí)菌的生長(zhǎng)速率常數(shù)。

一定含量下，抑制率值越大，表明抑菌能力越強(qiáng)，當(dāng)抑制率為50%時(shí)，對(duì)應(yīng)的藥物含量為半數(shù)抑制質(zhì)量濃度(IC50)。

2 結(jié)果與分析

2.1 高速逆流色譜分離制備五倍子各組分

分析型高速逆流色譜研究五倍子組分的分離體系，得到分析圖譜(圖1)，圖中有5個(gè)明顯的峰，體系乙酸乙酯—乙醇—水(5∶1∶5，體積比)的分離效果良好，固定相保留率約為36%，滿足逆流色譜的分離要求。

依據(jù)分析型高速逆流色譜的試驗(yàn)條件，將確定溶劑體系按比例擴(kuò)大，在制備型高速逆流色譜上進(jìn)行分離，圖譜見圖2，詳細(xì)的分離結(jié)果見表1。該體系溶劑在制備型高速逆流色譜上也可以分離得到5個(gè)峰(W1～W5)。W2、W3、W53個(gè)組分總含量為90.4%，是五倍子的主要組分。

圖2 制備型高速逆流色譜分離五倍子圖譜Fig.2 Chromatogram of Galla Chinensis separated by preparative HSCCC

表1 制備型高速逆流色譜分離五倍子各組分的分析結(jié)果Tab.1 Components in Galla Chinensis separated by preparative HSCCC

2.2 五倍子分離組分對(duì)無(wú)乳鏈球菌TN3L的生物活性測(cè)定

無(wú)乳鏈球菌TN3L在不同質(zhì)量濃度五倍子粗提物及各分離組分作用下的微量熱生長(zhǎng)代謝熱譜曲線見圖3，從各熱譜圖中正常代謝曲線1可以看出，無(wú)乳鏈球菌TN3L的生長(zhǎng)階段分別為延滯期、指數(shù)生長(zhǎng)期、穩(wěn)定期和衰減期。1號(hào)空白對(duì)照組與6號(hào)溶劑對(duì)照組的菌株生長(zhǎng)曲線差異不大，可知用于溶解五倍子的5%二甲基亞砜對(duì)無(wú)乳鏈球菌生長(zhǎng)過程的影響不大，因此影響菌株生長(zhǎng)的因素只有藥物濃度的大小。2～5號(hào)曲線為加入不同質(zhì)量濃度藥液的生長(zhǎng)曲線，除組分W1外，均表現(xiàn)出一定的差異性，曲線的指數(shù)生長(zhǎng)期出現(xiàn)越晚，Pt峰值越低，表明細(xì)菌的生長(zhǎng)活力越低，藥物對(duì)細(xì)菌的抑制效果越佳。取圖中的各曲線指數(shù)生長(zhǎng)期的Pt-t數(shù)據(jù)，按照1.3.4的計(jì)算方法，得出藥液質(zhì)量濃度與無(wú)乳鏈球菌TN3L生長(zhǎng)速率k的擬合方程和半數(shù)抑制質(zhì)量濃度(表2)。由圖3b可見，2～5曲線與1、6曲線基本重疊，且不能計(jì)算出半數(shù)抑制質(zhì)量濃度，故五倍子組分W1對(duì)無(wú)乳鏈球菌TN3L沒有抑制效果。根據(jù)計(jì)算出的半數(shù)抑制質(zhì)量濃度，得出其他組分與粗提物的抑菌強(qiáng)度依次為W2

圖3 無(wú)乳鏈球菌TN3L在五倍子的各分離組分作用下，測(cè)得在不同質(zhì)量濃度藥液下的生長(zhǎng)代謝熱譜曲線Fig.3 The Power-Time curves of TN3L growth in the presence of the components from Galla Chinensis at various concentrations

表2 五倍子粗提物及各分離組分質(zhì)量濃度(c)與無(wú)乳鏈球菌TN3L生長(zhǎng)速率(k)的擬合方程及半數(shù)抑制質(zhì)量濃度Tab.2 The relationship between the concentrations of the components separated from Galla Chinensis and growth rate constant of TN3L, and the half inhibitory concentrations.

3 討 論

本試驗(yàn)采用生物熱動(dòng)力學(xué)的方法初步探討五倍子粗提物及其分離組分對(duì)無(wú)乳鏈球菌TN3L的抑菌效果，篩選出具有較好抑制作用的五倍子分離組分，為漁用中藥制劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。五倍子的主要有效成分為鞣質(zhì)，含量約70%，其在酸性條件下可水解為沒食子酸[6]。沒食子酸具有較好的抑菌活性，可溶于水、乙醇等溶劑中，沒食子酸在乙醇中的提取率顯著高于水提取[17]。靳恒[18]采用高速逆流色譜法在乙酸乙酯—乙醇—水(5∶1∶5，體積比)等4個(gè)溶劑體系下提取五倍子的組分，發(fā)現(xiàn)分離體系乙酸乙酯—乙醇—水(5∶1∶5，體積比)相較于其他3個(gè)體系，分離效果最好且最穩(wěn)定。本試驗(yàn)在乙酸乙酯—乙醇—水(5∶1∶5，體積比)的溶劑分離體系下，固定相的保留率為36%，體系穩(wěn)定，符合試驗(yàn)要求，作為分離五倍子組分的溶劑體系進(jìn)行制備的效果良好，W2、W3、W53個(gè)組分的含量較高，是五倍子的主要組分。在實(shí)際制備分離過程中，由于五倍子成分復(fù)雜，常常會(huì)遇到幾個(gè)極性相似物質(zhì)峰在一次分離中不能有效分開的現(xiàn)象，為達(dá)到最佳的分離效果，尚需不斷尋求有效的輔助措施。試驗(yàn)從分析型高速逆流色譜轉(zhuǎn)向制備型高速逆流色譜的過程中，受到溫度、轉(zhuǎn)速等工藝參數(shù)改變的影響，分離效果可能出現(xiàn)不同程度的降低，因此還需要進(jìn)一步的優(yōu)化工藝條件。

微量量熱法是評(píng)價(jià)生物活性物質(zhì)抑菌效果的一種先進(jìn)、靈敏的方法，微生物在代謝過程中產(chǎn)生的熱量，經(jīng)過微量熱儀的精密檢測(cè)，獲得熱功率—時(shí)間曲線，這些曲線反映了微生物的生長(zhǎng)階段與模式、溫度變化情況、藥物的抑菌效果等。崔健等[19]使用微量量熱法研究在不同產(chǎn)地、不同顏色拳參作用下大腸桿菌(Escherichiacoli)的生長(zhǎng)代謝曲線，發(fā)現(xiàn)均有不同程度的抑制作用。通過微量量熱法檢測(cè)五倍子粗提物及其各分離組分對(duì)無(wú)乳鏈球菌TN3L的抑制作用，發(fā)現(xiàn)在同一分離組分水平上，藥物含量越高，細(xì)菌的生長(zhǎng)代謝熱譜曲線越平緩，生長(zhǎng)速率常數(shù)k值越低，即藥物抑菌作用越強(qiáng)。在不同藥物水平上，藥物對(duì)菌株的半數(shù)抑制質(zhì)量濃度越低，抑菌效果越好。五倍子粗提物及其各分離組分的半數(shù)抑制質(zhì)量濃度大小依次為：粗提物

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)通過高速逆流色譜法分離出五倍子5個(gè)組分，通過微量量熱法檢測(cè)五倍子粗提物及其各分離組分對(duì)無(wú)乳鏈球菌TN3L的抑制作用，發(fā)現(xiàn)在同一分離組分水平上，藥物質(zhì)量濃度越高，抑菌作用越強(qiáng)。在不同藥物水平上，五倍子粗提物及其各分離組分的抑制作用依次為：粗提物>W5>W3>W4>W2。根據(jù)半數(shù)抑制質(zhì)量濃度的結(jié)果，五倍子組分W3～W5均能顯著抑制無(wú)乳鏈球菌TN3L的生長(zhǎng)。結(jié)合制備型高速逆流色譜的結(jié)果，組分W3、W2、W5的含量最高，組分W4的含量?jī)H為1.218%。因此，在配伍五倍子的實(shí)際應(yīng)用中，可以適當(dāng)剔除W1、W2和W4組分，保留W3和W5，達(dá)到減少用藥量、有效地進(jìn)行疾病防治、降低養(yǎng)殖成本的目的。