桂英愛(ài)，葛祥武，孫程鵬，丁 勇

( 1.大連市檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證技術(shù)服務(wù)中心，遼寧 大連 116037； 2.大連市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展服務(wù)中心，遼寧 大連 116023 )

撲草凈，化學(xué)名稱為4,6-雙異丙胺基-2-甲硫基-1,3,5-三嗪，是均三氮苯類內(nèi)吸傳導(dǎo)選擇性除草劑，分子式為C10H19N5S，分子量241.36。近年來(lái)，除了在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛作為稗草、馬齒莧、車前草等1年生禾本科及闊葉草的除草劑外，還在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中作為環(huán)境改良劑清除魚、蝦、蟹、貝、海參等養(yǎng)殖水體中的絲狀藻類(青苔)、大型草類及有害藻類。由于大面積及不合理使用，撲草凈通過(guò)吸附遷移及食物鏈等造成了生態(tài)環(huán)境和相關(guān)產(chǎn)品中的殘留。2012年4月—2019年7月，我國(guó)出口的水產(chǎn)加工品和鮮品有幾十個(gè)批次被日本檢出(為一律基準(zhǔn)10 μg/kg)含有撲草凈，作廢棄銷毀處理[1-2]，給中國(guó)水產(chǎn)品出口企業(yè)帶來(lái)了極大的經(jīng)濟(jì)損失。水產(chǎn)品對(duì)撲草凈的富集能力較強(qiáng)，如在海水暴露質(zhì)量濃度為1 μg/L的情況下，文蛤(Meretrixmeretrix)對(duì)撲草凈的最大富集系數(shù)達(dá)到22.9[3]，說(shuō)明監(jiān)控水產(chǎn)品中撲草凈殘留量的重要性。所以當(dāng)務(wù)之急需要盡快摸索出高效、快捷的適用檢測(cè)方法。

迄今，國(guó)內(nèi)外已有諸多對(duì)撲草凈檢測(cè)方法的報(bào)道，有氣相色譜法、氣質(zhì)聯(lián)用法及液質(zhì)聯(lián)用法等，其中以氣質(zhì)聯(lián)用法最多，主要涉及水體[4]、土壤[5]和海產(chǎn)品[6-7]等。由于撲草凈分子2個(gè)側(cè)鏈具有R-NH-特征的特殊結(jié)構(gòu)極易產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)，導(dǎo)致測(cè)量數(shù)據(jù)中的樣品信號(hào)可能與純組分不同，通過(guò)常規(guī)的外標(biāo)校準(zhǔn)法對(duì)這樣的信號(hào)進(jìn)行量化可能產(chǎn)生不可靠的結(jié)果，在氣質(zhì)檢測(cè)過(guò)程中這種基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)極大地影響了結(jié)果的準(zhǔn)確性和定量，在低含量時(shí)表現(xiàn)尤為明顯，而產(chǎn)品中撲草凈檢測(cè)的技術(shù)關(guān)鍵是在一律基準(zhǔn)質(zhì)量濃度10 μg/kg處能夠精準(zhǔn)定量。因此，分析方法建立時(shí)，必須考察樣品的基質(zhì)效應(yīng)及定量限附近的結(jié)果。有多篇文獻(xiàn)提到了撲草凈的基質(zhì)效應(yīng)及采取的措施，如朱曉華等[8]采用固相萃取—?dú)赓|(zhì)串聯(lián)法檢測(cè)水產(chǎn)品撲草凈時(shí)，嚴(yán)格匹配了各種基質(zhì)，并采用基質(zhì)匹配校準(zhǔn)法和用內(nèi)標(biāo)法糾正回收率和系統(tǒng)誤差增大的現(xiàn)象；Garrido等[9]采用標(biāo)準(zhǔn)加入法對(duì)潛在的可能超過(guò)最大允許殘留量水平的陽(yáng)性樣品進(jìn)行了準(zhǔn)確的定量，并同時(shí)監(jiān)測(cè)2～3個(gè)特征離子篩選鑒別潛在的非負(fù)性樣品；Hernndez Torres等[10]通過(guò)溶液校準(zhǔn)和基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線的斜率和截距進(jìn)行配對(duì)比較，采用校正函數(shù)對(duì)基質(zhì)影響的不確定度進(jìn)行了描述。Stüber等[11]測(cè)試了3種不同的校準(zhǔn)方法(內(nèi)標(biāo)法、外標(biāo)法和基質(zhì)匹配校準(zhǔn)法)補(bǔ)償樣品中基體效應(yīng)，并與標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行比較，認(rèn)為高度復(fù)雜的樣品，3種方法都不能得到與標(biāo)準(zhǔn)加入法相當(dāng)?shù)目煽繑?shù)據(jù)。因此標(biāo)準(zhǔn)加入法提供了最精確的結(jié)果，是補(bǔ)償高負(fù)載樣品中基質(zhì)效應(yīng)有效的量化方法。

筆者在以上研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探索了撲草凈的氣質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)、基質(zhì)效應(yīng)、復(fù)雜基質(zhì)樣品的處理和假陽(yáng)性的排查等方法，為開展仿刺參(Apostichopusjaponicus)、菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)等水產(chǎn)品中的撲草凈含量檢測(cè)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來(lái)源

仿刺參和菲律賓蛤仔樣品均購(gòu)自大連市市場(chǎng)。

1.1.2 主要儀器與試劑

7890A-5975C型氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Agilent公司)；SQP電子天平，感量0.01 g(賽多利期科學(xué)儀器公司)；BS224S天平，感量0.1 mg(賽多利期科學(xué)儀器公司)；N-EVAPTMⅢ氮吹儀(Organomation公司)。

撲草凈標(biāo)準(zhǔn)品(德國(guó)Dr公司，純度大于98.0%)；乙腈、丙酮和正己烷均為色譜純；無(wú)水硫酸鈉(分析純)，550 ℃烘4 h，冷卻后裝瓶于干燥器中密封保存；Envi-Carb/LC-NH2固相萃取柱500 mg/500 mg×6 mL(Supelco公司)。

1.2 方法

1.2.1 儀器條件

色譜：毛細(xì)管色譜柱DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；柱溫程序升溫條件：初始溫度50 ℃以10 ℃/min升至150 ℃保持0.50 min，然后以30 ℃/min升至213 ℃，以30 ℃/min升至280 ℃保持2 min；進(jìn)樣口溫度：280 ℃；進(jìn)樣方式為不分流進(jìn)樣；載氣為高純氦氣(99.999%)，流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量1 μL。

質(zhì)譜：電子轟擊離子源(EI)；四極桿溫度150 ℃；離子源溫度為230 ℃；傳輸線溫度280 ℃；電離能量70 eV。測(cè)定方式為40～480分子量全掃描(SCAN)和選擇離子掃描(SIM)；溶劑延遲時(shí)間為5.00 min，監(jiān)測(cè)離子時(shí)間為5.00～21.93 min。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線配制

準(zhǔn)確稱取撲草凈標(biāo)準(zhǔn)品0.0100 g，用正已烷溶解，定容于100 mL容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，再用正已烷稀釋成相應(yīng)質(zhì)量濃度的工作混合溶液。

(1)采用正已烷作為溶劑配制質(zhì)量濃度為0、0.005、0.01、0.02、0.04、0.10、0.20、1.0 μg/mL的撲草凈系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到撲草凈標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(2)向空白仿刺參樣品中分別添加不同濃度的撲草凈標(biāo)準(zhǔn)溶液，使添加水平為0、5.0、10、20、40 μg/kg和100 μg/kg，樣品提取過(guò)程見(jiàn)1.2.3，得到基質(zhì)校準(zhǔn)曲線。

1.2.3 樣品前處理

樣品提取主要參照文獻(xiàn)[8]方法。以仿刺參為例，準(zhǔn)確稱取2.00 g已勻漿的試樣于100 mL離心管中，加入30 mL乙腈溶劑超聲30 min，4000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液通過(guò)無(wú)水硫酸鈉的漏斗于250 mL雞心瓶中，再重復(fù)用10 mL乙腈提取1次，合并提取液于同一個(gè)雞心瓶中，于40 ℃水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干燥，殘?jiān)? mL正己烷溶解，備用。

將ENVI-Carb/LC-NH2固相萃取柱依次用3 mL丙酮和3 mL正己烷活化。轉(zhuǎn)移濃縮的樣品溶液至柱子中，再用3 mL正己烷清洗瓶子并過(guò)柱，過(guò)完后抽干。以5 mL正己烷∶丙酮(體積比為6∶4)的混合液分2次以1 mL/min流速過(guò)柱洗脫，收集全部洗脫液至10 mL小試管中，氮吹儀緩慢吹干。用1 mL正己烷定容，供氣相色譜—質(zhì)譜分析檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜圖

數(shù)據(jù)采集模式：在1.2.1色譜及質(zhì)譜條件下，得到撲草凈標(biāo)準(zhǔn)溶液全掃描質(zhì)譜圖(圖1)，選擇相對(duì)豐度高的4個(gè)特征離子241(100%)，184(85%～90%)，226(60%～65%)和199(22%～25%)，以m/z241作為撲草凈的定量離子。

2.2 線性方程、基質(zhì)效應(yīng)和檢出限

撲草凈標(biāo)準(zhǔn)溶液在0.005～1.0 μg/mL濃度線性范圍內(nèi)曲線回歸方程為y=11 658x-2.78，r2=0.9994(圖2)和在0.010～0.2 μg/mL質(zhì)量濃度線性范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)加入法工作曲線為y=21 189x-1.90，r2=0.9984。以提取前加標(biāo)峰面積/撲草凈在溶劑中峰面積評(píng)價(jià)基質(zhì)影響[12]。兩者斜率比超出80%～120%[13]，達(dá)到145%，這與Rodríguez-Gonzlez等[14]的129%～142%相近。說(shuō)明存在比例誤差，相比系統(tǒng)誤差[10]可以忽略，有明顯的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，需要采取相應(yīng)的基質(zhì)補(bǔ)償措施。

結(jié)合表1結(jié)果，在回收率和精密度滿足殘留檢測(cè)要求的前提下，根據(jù)3倍信噪比計(jì)算檢出限4 μg/kg ，定量限(10 S/N)為10 μg/kg亦為基準(zhǔn)含量值，比Chae等[15]的定量限40 μg/kg還要低，可以滿足日本對(duì)我國(guó)水產(chǎn)品出口的撲草凈限量要求。

2.3 加標(biāo)回收率和精密度

在2.00 g空白仿刺參樣品中分別添加10、20和100 μg/kg 3個(gè)水平的撲草凈，每個(gè)水平設(shè)6份加標(biāo)平行樣，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)加入法計(jì)算的回收率為99.6%～112.6%(表1)，精密度分別為15.4%、9.0%和2.0%。

圖1 撲草凈標(biāo)準(zhǔn)全掃描質(zhì)譜圖及譜庫(kù)檢索結(jié)構(gòu)式Fig.1 Standard full scan mass spectrum and library search structure of prometryn

圖2 不同水平撲草凈標(biāo)準(zhǔn)溶液響應(yīng)Fig.2 Responses of the different standard solution of prometryn

表1 仿刺參中撲草凈3個(gè)添加水平加標(biāo)回收率和精密度(n=6)Tab.1 Spike recovery rate and precision of prometryn in sea cucumber at 3 doses

試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)檢測(cè)含量越低，精密度越差，基質(zhì)干擾越嚴(yán)重，但是在定量限10 μg/kg處可以滿足檢測(cè)要求。由圖3～4可見(jiàn)，同時(shí)對(duì)500 μg/kg高水平添加撲草凈樣品進(jìn)行全掃描，得到4個(gè)監(jiān)測(cè)離子241、184、226和199的理論豐度比符合撲草凈的定性要求，經(jīng)譜庫(kù)檢索吻合度達(dá)99%，與標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間15.507 min一致，說(shuō)明目標(biāo)物就是撲草凈。

2.4 樣品定量中假陽(yáng)性的判斷

菲律賓蛤仔樣品經(jīng)其他固相萃取柱凈化得到的色譜圖見(jiàn)圖5，出峰時(shí)間和撲草凈標(biāo)準(zhǔn)完全一致(15.508 min)，但是監(jiān)測(cè)特征離子對(duì)184/241的比例和標(biāo)準(zhǔn)溶液184/241離子對(duì)85%～90%比例相比遠(yuǎn)超過(guò)20%的偏差，可見(jiàn)樣品峰為干擾物質(zhì)不是目標(biāo)物，判定為假陽(yáng)性。

2.5 實(shí)際樣品測(cè)定

分別抽取22個(gè)菲律賓蛤仔和12個(gè)仿刺參樣品按以上試驗(yàn)條件進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)采用標(biāo)準(zhǔn)加入法和結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線進(jìn)行定量，有1個(gè)菲律賓蛤仔樣品信號(hào)較強(qiáng)。選取此樣品重新進(jìn)樣，同時(shí)選定2個(gè)特征離子(241和184)，結(jié)果表明184/241離子比例為85.3%，在85%～90%內(nèi)，符合<20%的相對(duì)偏差要求(圖6)，確認(rèn)是撲草凈組分但經(jīng)計(jì)算其含量低于10 μg/kg限量值。其他33個(gè)菲律賓蛤仔和仿刺參樣品未檢出撲草凈，產(chǎn)品質(zhì)量也同樣滿足企業(yè)出口要求。

圖3 未知樣品(上)和仿刺參加標(biāo)樣品20 μg/kg(下)TIC圖Fig.3 TIC diagrams of unknow samples (top) and spiked samples (bottom) in sea cucuber exposed to 20 μg/kg

圖4 仿刺參加標(biāo)樣品提取離子流圖Fig.4 Ion current diagram of standard sample extraction in sea cucumber

圖5 菲律賓蛤仔假陽(yáng)性樣品的TIC色譜圖和提取離子流圖Fig.5 TIC diagram and extracted particle flow diagram of false positive samples in Manila clam

圖6 菲律賓蛤仔實(shí)際樣品的測(cè)定及定性結(jié)果(保留時(shí)間15.404 min)Fig.6 Determination and qualitative results of actural samples (retention time=15.404 min)

3 討 論

3.1 樣品處理方法及進(jìn)樣條件的選擇

線性方程的穩(wěn)定性：由于儀器狀態(tài)如進(jìn)樣口、色譜柱、檢測(cè)器等隨時(shí)間發(fā)生變化，表現(xiàn)在每批撲草凈標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線法及標(biāo)準(zhǔn)加入法的響應(yīng)值和線性方程都有差異，不同進(jìn)樣時(shí)間段的保留時(shí)間也會(huì)有所偏移，所以需要在同一設(shè)備同一色譜質(zhì)譜方法條件下保證標(biāo)準(zhǔn)和樣品同時(shí)進(jìn)樣比較才能實(shí)現(xiàn)定量的準(zhǔn)確性。

本試驗(yàn)先后采用了乙酸乙酯、正已烷和乙腈做為提取溶劑，乙酸乙酯提取溶液顏色較深，含部分色素，而正已烷顏色雖淺但是共萃取的脂類雜質(zhì)較多，均對(duì)結(jié)果產(chǎn)生了干擾，增加了凈化的復(fù)雜性，而用乙腈溶劑提取則干擾少峰形好而且提取效率高。

由于水產(chǎn)品中基質(zhì)成分復(fù)雜，含大量的脂肪、蛋白質(zhì)和色素等大分子物質(zhì)，如果樣品處理不好，將直接影響后續(xù)的定性和定量。本試驗(yàn)采用了常用的弗羅里硅土柱、N-丙基乙二胺(PSA)柱和ENVI-Carb/LC-NH2柱聯(lián)用等進(jìn)行凈化試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)用弗羅里硅土柱凈化回收率較高，超過(guò)90%，但是除色素能力沒(méi)有ENVI-Carb/LC-NH2柱聯(lián)用高。PSA填料是極性吸附劑，有2個(gè)氨基，具有一定的陰離子交換能力，單獨(dú)使用可去除部分雜質(zhì)但凈化不夠徹底。ENVI-Carb碳黑填料去除產(chǎn)品色素功能強(qiáng)大，而氨基Amino-NH2柱屬正相萃取柱適合極性化合物，弱陰離子交換萃取，ENVI-Carb/LC-NH2柱聯(lián)用使洗脫液呈透明色，凈化效果好，在譜圖干擾峰、除色素能力和回收率(可達(dá)99%以上)等方面均獲得理想結(jié)果。

綜上，本試驗(yàn)采用乙腈溶劑提取和ENVI-Carb/LC-NH2柱聯(lián)用凈化。

3.2 樣品定量中假陽(yáng)性的判斷及基質(zhì)效應(yīng)的排除

試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)樣品種類不同、加標(biāo)水平不同，基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)也不同，同時(shí)發(fā)現(xiàn)仿刺參和菲律賓蛤仔樣品均有本底，對(duì)撲草凈檢測(cè)的干擾不可忽視，樣品中待測(cè)含量越低干擾越嚴(yán)重，故當(dāng)樣品中分析物含量接近(或超過(guò))限量水平即處于邊緣值時(shí)，極易造成結(jié)果的高估。為了保證定量的準(zhǔn)確性，在測(cè)定過(guò)程中要盡量選擇干凈的樣品作為空白基質(zhì)，樣品含量測(cè)試結(jié)果要保證同時(shí)用同批同類樣品結(jié)合同一基質(zhì)加標(biāo)樣品并與溶劑標(biāo)準(zhǔn)比較進(jìn)行校正。

針對(duì)檢測(cè)過(guò)程中復(fù)雜樣品基質(zhì)和撲草凈目標(biāo)物峰重疊產(chǎn)生背景干擾造成譜庫(kù)檢索匹配相似度降低及定量干憂的情況，Wu 等[16]采用化學(xué)計(jì)量法對(duì)撲草凈進(jìn)行解析，從韭菜樣品的重疊峰中提取目標(biāo)物信號(hào)，Yu 等[17]則采用免疫算法對(duì)頭發(fā)中撲草凈復(fù)雜重疊色譜信號(hào)進(jìn)行解析，并均采用標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行定量。本試驗(yàn)對(duì)樣品中的撲草凈組分主要通過(guò)保留時(shí)間和定量離子等參數(shù)信息對(duì)采集到的譜圖進(jìn)行篩選判斷是否有撲草凈檢出，以限量值10 μg/kg的30%，即7 μg/kg作為截止值，如果檢出目標(biāo)物，則認(rèn)為該樣品可能是非陰性的?？紤]到樣品中撲草凈的峰值可能隱藏在漂移基線和高水平背景重疊峰里，本試驗(yàn)主要通過(guò)SIM方法確認(rèn)，即同時(shí)監(jiān)測(cè)潛在的非負(fù)性樣品中241和184 2個(gè)特征離子，如果在樣品和標(biāo)準(zhǔn)中的離子豐度比例偏差<20%則證實(shí)存在撲草凈，即判斷樣品為非陰性，對(duì)檢測(cè)含量可能超過(guò)10 μg/kg的陽(yáng)性樣品，則通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行精確的量化。

撲草凈的檢測(cè)受干擾因素較多。這可能是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中先后使用了多種結(jié)構(gòu)類似的三嗪類農(nóng)藥，加上土壤中原有殘留的影響，從而導(dǎo)致樣品中可能含有撲草凈降解物及類似物，但還不能確定其在氣質(zhì)進(jìn)樣過(guò)程中是否共同對(duì)定量和譜圖解析造成干擾，需進(jìn)一步的試驗(yàn)論證。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)探索了水產(chǎn)品中撲草凈的固相萃取—?dú)赓|(zhì)聯(lián)用法檢測(cè)法，采用乙腈提取Envi-Carb/LC-NH2串聯(lián)固相萃取柱凈化氣質(zhì)聯(lián)用法檢測(cè)結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)加入法定量，采用同時(shí)監(jiān)測(cè)2個(gè)特征離子進(jìn)行確證有效排除了樣品中的假陽(yáng)性。試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度均滿足國(guó)家規(guī)定的要求，可用于水產(chǎn)品中撲草凈的檢測(cè)和確證分析。