王甘翔，唐 古，彭 頔，李媛媛，楊 慶，李飛鵬,*

(1. 平湖市漁業(yè)技術(shù)推廣中心，浙江嘉興 314200；2. 上海理工大學(xué)環(huán)境與建筑學(xué)院，上海 200093)

斑馬魚胚胎對有毒有害物質(zhì)非常敏感，已經(jīng)成為國際上生物醫(yī)學(xué)和環(huán)境毒理學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)模式生物，廣泛應(yīng)用于常規(guī)毒性試驗、分子及細(xì)胞生態(tài)毒理研究和生物誘導(dǎo)效應(yīng)檢測等多個方面。國際標(biāo)準(zhǔn)組織已將斑馬魚推薦為河水毒性檢測的試驗魚種，并提出了相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)方法(ISO 07346)；我國生態(tài)環(huán)境部亦發(fā)布了《水質(zhì) 急性毒性的測定 斑馬魚卵法》(HJ 1069—2019)，適用于測定地表水、地下水、生活污水和工業(yè)廢水的急性毒性。斑馬魚飼養(yǎng)容易，利用其胚胎的毒性檢測方法具有節(jié)約空間、費用低等諸多優(yōu)勢，因此，在生態(tài)毒理學(xué)研究和水環(huán)境檢測等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[1]。在利用斑馬魚胚胎評價環(huán)境污染物毒性時，致死性反應(yīng)毒理學(xué)終點是環(huán)境安全評估的一項重要指標(biāo)；但是，在自然水生態(tài)系統(tǒng)中，污染物通常具有濃度低、種類多、成分和作用機制復(fù)雜等特點，受污染的生物通常表現(xiàn)為畸形、突變等非致死性反應(yīng)。通過觀測經(jīng)毒性物質(zhì)染毒條件下魚卵胚胎心跳的情況，判斷魚卵胚胎發(fā)育的毒性效應(yīng)，是評價分析毒性物質(zhì)的一種重要方法，同時，胚胎的心率變化也是相對較早可檢測到的指標(biāo)。

當(dāng)前，針對斑馬魚胚胎的心率監(jiān)測，多依賴于顯微鏡觀測的計數(shù)方法，準(zhǔn)確性受觀測者主觀判斷的影響較大。在研究不同酒制大黃對斑馬魚胚胎發(fā)育的影響時，朱淑珍等[2]采用倒置光學(xué)顯微鏡和CCD數(shù)碼攝像機對胚胎的發(fā)育終點進(jìn)行研究，統(tǒng)計胚胎發(fā)育全過程的死亡數(shù)和畸形數(shù)，拍照記錄發(fā)育狀態(tài)，錄像并以人工計數(shù)心率；然而，這種基于斑馬魚胚胎錄制視頻文件、以人工計數(shù)心率的方式具有工作量大、存在誤差等劣勢。此外，當(dāng)前斑馬魚胚胎心跳觀測普遍采用24孔板染毒，置于顯微鏡觀測并計數(shù)胚胎心跳。在這種觀測環(huán)境下，魚卵胚胎和試驗培養(yǎng)液直接暴露于室內(nèi)空氣中，難以保證較好的觀測條件，同時也會影響試驗的準(zhǔn)確性[3]。計算機視覺是使用計算機及相關(guān)設(shè)備對生物視覺的一種模擬技術(shù)，能夠代替人眼對目標(biāo)進(jìn)行識別、跟蹤和測量，并可以進(jìn)一步對圖形進(jìn)行處理和分析，在水環(huán)境監(jiān)測和生態(tài)學(xué)研究中逐漸開始得到廣泛應(yīng)用[4-6]。針對水質(zhì)毒性試驗和評價的需求，本研究基于計算機視覺技術(shù)，建立了精確檢測斑馬魚心率的自動觀測系統(tǒng)，并進(jìn)行了初步驗證，旨在提高斑馬魚毒性檢測方法的效率和精度，為水質(zhì)毒性檢測方法提供一種新思路。

1 材料與方法

試驗所用的斑馬魚購自同濟(jì)大學(xué)長江水環(huán)境教育部重點實驗室，個體長度為4～5 cm，飼養(yǎng)于充分曝氣的自來水中，水溫保持在(26±1)℃，pH值控制在7～8，光照/黑暗周期控制為14 h∶10 h。每日喂食2次(冷凍紅線蟲，購于上海曲陽花鳥市場)，并輔助混合干飼料喂食以增加產(chǎn)卵量。斑馬魚飼養(yǎng)3個月以上并達(dá)到性成熟后進(jìn)行試驗，飼養(yǎng)期間活動正常、無死亡。一般，斑馬魚卵胚胎在受精24 h后(24 hpf)心臟發(fā)育成形，即可在顯微鏡下觀測到心跳[7]。

試驗前夜，在暗室內(nèi)將產(chǎn)卵器放入魚缸，親魚按1∶2雌雄比放入產(chǎn)卵器內(nèi)，中間用隔板隔開，下方放置魚卵收集器，次日清晨抽出隔板，光照30 min以刺激斑馬魚產(chǎn)卵。取出魚卵收集器，用闊口膠頭滴管(管口直徑大于卵徑)將卵吸出，然后用標(biāo)準(zhǔn)稀釋水清洗魚卵數(shù)次，以除去糞便等雜質(zhì)，挑選出正常的受精卵培養(yǎng)備用。

標(biāo)準(zhǔn)稀釋水配置參照《水質(zhì) 急性毒性的測定 斑馬魚卵法》(HJ 1069—2019)的方法進(jìn)行。

2 心率觀測系統(tǒng)構(gòu)建

2.1 心率觀測系統(tǒng)設(shè)計

心率觀測系統(tǒng)由實驗室卵胚胎培養(yǎng)裝置、組裝的高速攝像顯微鏡和視頻圖像心率識別程序組成。實驗室卵胚胎培養(yǎng)裝置結(jié)構(gòu)如圖1所示。組裝的高速攝像和顯微鏡系統(tǒng)采用高清(1 920×1 080/50P)攝像機，在APS-C商用畫幅下能得到0.1 μm2/ Pixel(像素)的分辨率；顯微鏡采用光學(xué)倒置顯微鏡(Olympus CKX41)(圖2)。

圖1 實驗室卵胚胎培養(yǎng)裝置結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Structure Diagram of Laboratory Culture Device for Zebrafish Embyro

圖2 計算機視覺系統(tǒng)裝置Fig.2 Picture of Computer Visual System

為了得到較準(zhǔn)確的斑馬魚卵胚胎心跳觀測結(jié)果，需控制觀測裝置的環(huán)境溫度、光照等因素以保證魚卵胚胎的正常發(fā)育，并防止外界污染物進(jìn)入培養(yǎng)液，從而保證單一變量試驗，同時需保證胚胎固定穩(wěn)固，以利于觀測。因此，本研究自行設(shè)計了魚卵胚胎培養(yǎng)裝置，由相互連通的容納單元、恒溫水流動單元組成，可固定于組裝的高速攝像顯微鏡載物臺。

容納單元腔室為圓柱形，由上蓋板、下底板、側(cè)板構(gòu)成腔室，腔室與側(cè)板之間、腔室與腔室之間均留有空隙。腔室的數(shù)量設(shè)置為4個，內(nèi)徑為2 cm，深度為2 cm，每個腔室均設(shè)置上部的高位換水孔和下部的低位換水孔，相錯設(shè)置，同時與側(cè)板連通。

上蓋板、下底板及腔室內(nèi)均填充透光纖維團(tuán)，為腔室提供一定的光源，保障觀測時的光線條件。使用中上蓋板蓋合，使得魚卵胚胎心跳觀測裝置封閉，防止外界污染。充氧的恒溫水通過高位換水孔向低位換水孔持續(xù)流動，為腔室內(nèi)斑馬魚卵胚胎生存提供了充足的氧氣和恒溫水浴條件；換水孔徑較小(3 mm)使得腔室內(nèi)水體流動較緩，加上腔室內(nèi)填充的纖維團(tuán)緩沖了水體流動對腔室造成的沖擊，腔室底部的纖維絮層固定魚卵胚胎，總體上防止了觀測中魚卵胚胎抖動影響觀測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.2 胚胎染毒方法

在對Schulte等[8]的研究方法進(jìn)行改進(jìn)的基礎(chǔ)上，采用自主設(shè)計加工的卵胚胎培養(yǎng)裝置(圖1)進(jìn)行染毒試驗。挑選出4枚24 hpf正常受精卵置于培養(yǎng)裝置胚胎放置腔內(nèi)，組裝好培養(yǎng)裝置，利用染毒試液構(gòu)建恒溫水浴環(huán)境對胚胎進(jìn)行染毒。

在室溫與目標(biāo)溫度相近的情況下，將染毒試液由泵水管與恒溫進(jìn)水口相連，控制壓力保持胚胎腔室液位穩(wěn)定，不溢出。試驗時，先將位于透光上蓋板內(nèi)壁上的標(biāo)記黏結(jié)固定合適大小、形狀的纖維團(tuán)(透光化纖)，再將進(jìn)樣泵一端連接恒溫水源，進(jìn)樣泵另一端連接進(jìn)水孔；在進(jìn)樣泵作用下，恒溫水通過進(jìn)水孔進(jìn)水，進(jìn)入容納單元，充滿側(cè)板與腔室之間及腔室相互之間的空隙以及各個腔室，然后通過出水孔流出?？刂扑畨海３智皇宜环€(wěn)定后，通過吸管將卵胚胎放入腔室底部，再鋪上脫脂棉薄層，使魚卵胚胎固定在纖維絮層上，并蓋上已黏結(jié)纖維團(tuán)的上蓋板，封閉腔室，隨著上蓋板蓋合，纖維團(tuán)即可插入纖維絮層并填充腔室，之后將該裝置放置于倒置顯微鏡上，通過透光的下底板觀測魚卵胚胎心跳的情況，進(jìn)行觀察及視頻錄制。

室溫與目標(biāo)溫度相差較大會影響胚胎生理指標(biāo)，此時，只需將進(jìn)樣泵水管連接水體恒溫裝置后再與恒溫進(jìn)水口相連即可。

2.3 視頻圖像心率識別方法

視頻文件由心率識別程序處理后得到胚胎心率指標(biāo)。心率識別程序采用Matlab數(shù)學(xué)軟件編寫，通過對基于灰度變化的斑馬魚心室圖像面積的Matlab程序編碼。編寫的8組M碼文件可以組合應(yīng)用于Matlab軟件，對視頻圖像文件不同部分進(jìn)行黑色和白色處理，最終得到心室面積的實時變化值。心室面積變化值反映了心臟的收縮和擴(kuò)張，心室面積值-時間曲線的2次波峰之間的時間間隔內(nèi)即發(fā)生了1次完整的心跳。因此，通過對心室面積值-時間曲線的分析即可得到心率，從而實現(xiàn)心室圖像心率識別。

3 方法驗證實例

為觀測正常的斑馬魚胚胎心跳，以日常放置半天的自來水為試驗試劑，通過上述心率檢測系統(tǒng)進(jìn)行正常環(huán)境下斑馬魚胚胎的觀測、視頻錄制和心率識別，以驗證本研究構(gòu)建的觀測系統(tǒng)的準(zhǔn)確性。本例所用視頻文件總時長為6 min，心率識別程序每隔0.02 s對視頻圖像進(jìn)行1次處理，共得到18 000個面積數(shù)據(jù)值。

利用Excel 2013從所得的面積數(shù)據(jù)值中隨機選取5組連續(xù)5 s內(nèi)的數(shù)據(jù)值，根據(jù)各面積-時間曲線圖總體趨勢，5組曲線走勢類似，且均可清晰地分辨出波峰數(shù)量，數(shù)據(jù)波峰數(shù)量均為9，隨機抽取的1組心室面積值-時間折線圖如圖3所示。為判斷心率與波峰的對應(yīng)關(guān)系，對心率識別程序所用視頻文件進(jìn)行人工計數(shù)，同樣采用隨機選取4組1 min時長進(jìn)行計數(shù)，所得結(jié)果分別為112、105、108、114次/min，平均心率為110次/min。1 min斑馬魚胚胎平均心跳數(shù)為108次，與人工計數(shù)所得幾乎一致，波峰與心率基本吻合，說明通過構(gòu)建的計算機識別程序可準(zhǔn)確計數(shù)斑馬魚胚胎的心率變化。Park等[9]在利用斑馬魚心臟毒性模型預(yù)測藥物引起心率過緩情況時，使用立體顯微鏡對斑馬魚卵胚胎心率進(jìn)行30 s人工計數(shù)，發(fā)現(xiàn)未染毒對照組斑馬魚卵胚胎平均心率為105次/min；Chakraborty等[10]在研究咖啡因、諾氟沙星和尼美舒利對斑馬魚胚胎心率影響時，發(fā)現(xiàn)空白對照組的斑馬魚卵胚胎平均心率為110次/min。斑馬魚心率觀測系統(tǒng)所得平均心率值與上述已有研究結(jié)果十分接近，且其結(jié)果與人工計數(shù)結(jié)果相差無幾，同時，在觀測操作和心率計數(shù)方面具有更加便捷、快速和精確的優(yōu)勢。

圖3 隨機抽取的心室面積-時間曲線圖Fig.3 Random Selection of Ventricular Area-Time Curve

采用混合地表徑流樣品為試驗試劑進(jìn)行培養(yǎng)，分別用顯微鏡人工觀測和本系統(tǒng)觀測斑馬魚胚胎心率。顯微鏡觀測斑馬魚胚胎發(fā)育48 h的心率為(153±13)次/min，本系統(tǒng)觀測的平均值為151次/min，與人工技術(shù)結(jié)果一致，進(jìn)一步說明了系統(tǒng)觀測的準(zhǔn)確性。

4 方法應(yīng)用討論

在以斑馬魚為受試生物的環(huán)境毒理學(xué)研究中，斑馬魚胚胎心率在不同濃度染毒試劑中的變化情況已有廣泛的研究。葉露[7]采用倒置顯微鏡對斑馬魚胚胎進(jìn)行15 s人工計數(shù)，得到了不同濃度全氟辛酸(PFOA)和全氟化合物(PFCs)所對應(yīng)的斑馬魚胚胎平均心率值；楊洋等[11]發(fā)現(xiàn)了雙酚AF暴露對胚胎期的毒性效應(yīng)，構(gòu)建了不同濃度的雙酚AF所對應(yīng)的斑馬魚胚胎平均心率；Wu等[12]在研究上海市高架道路降雨徑流水質(zhì)毒性時，采用斑馬魚作為受試生物，得到了不同批次降雨徑流所對應(yīng)的斑馬魚平均心率。同時，這些研究的斑馬魚胚胎心率變化構(gòu)建出染毒試劑濃度和斑馬魚胚胎心率關(guān)系曲線，含有對應(yīng)污染物的水質(zhì)，即可通過斑馬魚胚胎心率變化進(jìn)行定量化表征，從而實現(xiàn)水質(zhì)情況的快速、實時監(jiān)測。在心率計數(shù)時，人工計數(shù)的方式造成的誤差是不可避免的，且誤差大小具有不確定性，雖然同樣可以取多組人工計數(shù)求出平均心率，但由于人工計數(shù)耗時較多，數(shù)據(jù)組不可能取無限多次以減小誤差。本研究所提供的斑馬魚心率觀測系統(tǒng)，基于計算機視覺技術(shù)，可隨機選出足夠多組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，從而實現(xiàn)心率結(jié)果誤差最小化。本研究提供的方法可在后續(xù)的研究中構(gòu)建更多的水體污染物濃度與心率關(guān)系曲線，實現(xiàn)對水質(zhì)的快速檢測。同時，斑馬魚心率觀測系統(tǒng)能夠更好地模擬自然環(huán)境，可以對卵胚胎發(fā)育全過程進(jìn)行實時觀測和圖像提取分析，在研究胚胎發(fā)育形態(tài)方面也具有較大優(yōu)勢。在對污染物濃度變化大的降雨徑流水質(zhì)和毒性比較時，Chen等[13]發(fā)現(xiàn)，基于傳統(tǒng)方法的水質(zhì)評價并不能完全反應(yīng)降雨徑流的生態(tài)毒性水平，應(yīng)考慮同時進(jìn)行徑流的毒性和水質(zhì)檢測。本方法可在觀測斑馬魚胚胎毒理學(xué)指標(biāo)的同時，構(gòu)建在線監(jiān)測系統(tǒng)進(jìn)行水體水質(zhì)監(jiān)測，可實現(xiàn)水質(zhì)指標(biāo)和生態(tài)毒性指標(biāo)的協(xié)同在線檢測。

5 結(jié)語

本研究提供了一種斑馬魚心率觀測系統(tǒng)的建立方法，改進(jìn)了胚胎觀測的條件，能夠更好地模擬斑馬魚胚胎發(fā)育的自然環(huán)境，從而使觀測結(jié)果更加準(zhǔn)確；通過編寫的視頻圖像心率識別程序，與傳統(tǒng)人工計數(shù)方式相比，基于計算機視覺的胚胎心率計數(shù)更加高效、快速和準(zhǔn)確；斑馬魚心率觀測系統(tǒng)在檢測系統(tǒng)中的應(yīng)用驗證了系統(tǒng)的可行性和準(zhǔn)確性。在具體的水質(zhì)檢測應(yīng)用中，可以采用斑馬魚卵胚胎在水樣中染毒，構(gòu)建出心率與水質(zhì)變化的規(guī)律，從而通過心率變化實現(xiàn)對水質(zhì)和毒性的實時協(xié)同監(jiān)測。