瞿杭波 李慶慶 蔣增輝

[摘要] 目的 探討姜黃素對(duì)骨關(guān)節(jié)炎（OA）軟骨細(xì)胞增殖及基質(zhì)金屬蛋白酶-13（MMP-13）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）分泌的影響。 方法 選取2018年1～6月在我院骨科接受關(guān)節(jié)置換的10例骨關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)軟骨，設(shè)為炎癥軟骨細(xì)胞組（OA組），按是否加入姜黃素分為單純培養(yǎng)基組（OAa組）與加入姜黃素組（OAb組）;另選取因外傷致截肢的4例患者膝關(guān)節(jié)軟骨為對(duì)照，設(shè)為正常軟骨細(xì)胞組（N組），按是否加入姜黃素分為單純培養(yǎng)基組（Na組）與加入姜黃素組（Nb組）。進(jìn)行軟骨細(xì)胞培養(yǎng)，配制姜黃素溶液，加入姜黃素溶液（80 μmol/L）刺激軟骨細(xì)胞，采用MTT法檢測軟骨細(xì)胞增殖，測定上清液MMP-13、IL-6水平。 結(jié)果 OAb組吸光度值明顯低于OAa組（P<0.05），Nb組吸光度值較Na組下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。OAb組上清液MMP-13、IL-6水平均低于OAa組（P<0.05），OA組MMP-13、IL-6水平均高于N組（P<0.05）。 結(jié)論 姜黃素對(duì)OA軟骨細(xì)胞增殖及釋放MMP-13、IL-6均有明顯抑制作用，可保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，減輕炎癥反應(yīng)。

[關(guān)鍵詞] 姜黃素;骨關(guān)節(jié)炎;軟骨細(xì)胞增殖;基質(zhì)金屬蛋白酶-13;白細(xì)胞介素-6

[中圖分類號(hào)] R684.3 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A ? ? ? ? ?[文章編號(hào)] 1673-9701（2020）26-0038-03

[Abstract] Objective To investigate the effect of curcumin on the proliferation of osteoarthritis chondrocytes and the secretion of matrix metalloproteinase-13（MMP-13） and interleukin-6（IL-6）. Methods The articular cartilage of 10 patients with osteoarthritis who underwent joint replacement in the orthopedics department of our hospital from January to June 2018 was selected as the inflammatory chondrocyte group（OA group）. And the OA group was divided into the simple medium group（OAa group） and curcumin-added group（OAb group）. The knee cartilage of 4 patients who were amputated due to trauma was selected as the normal chondrocyte group（group N）. The group N was divided into normal chondrocyte group（Na group） and curcumin-added group（Nb group）. The chondrocytes were cultured， and the curcumin solution was prepared. The curcumin solution（80 μmol/L） was added to stimulate the chondrocytes. The proliferation of the chondrocytes was measured by the MTT method， and the levels of the supernatant MMP-13 and IL-6 were determined. Results The absorbance value of the OAb group was significantly lower than that of the OAa group（P<0.05）. And the absorbance value of the Nb group was lower than that of the Na group， but the difference was not statistically significant（P>0.05）. The levels of MMP-13 and IL-6 in the supernatant of the OAb group were lower than those in the OAa group（P<0.05）， and the levels of MMP-13 and IL-6 in the OA group were higher than those in the group N（P<0.05）. Conclusion Curcumin can significantly inhibit the proliferation of OA chondrocytes and release of MMP-13 and IL-6， protect articular chondrocytes and reduce inflammation.

[Key words] Curcumin; Osteoarthritis; Chondrocyte proliferation; Matrix metalloproteinase-13; Interleukin-6

骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）是一種臨床常見的慢性骨關(guān)節(jié)疾病，患者常有關(guān)節(jié)疼痛、活動(dòng)受限等癥狀，以退行性關(guān)節(jié)軟骨病變及骨質(zhì)增生為主要病理表現(xiàn)，多見于中老年人[1]。目前臨床治療OA的方法較多，但大多僅能緩解癥狀，無法解決根本問題，也不能扭轉(zhuǎn)疾病惡化趨勢，最終需行關(guān)節(jié)置換[2]。近年來，隨著中醫(yī)藥研究的進(jìn)一步深入，中醫(yī)藥防治OA的價(jià)值受到廣泛關(guān)注，現(xiàn)已成為研究熱點(diǎn)。姜黃是一味用于骨傷疾病治療的常見中藥，可活血行氣、通經(jīng)止痛，其有效成分姜黃素能抑制骨關(guān)節(jié)炎癥，減輕炎癥反應(yīng)，保護(hù)骨關(guān)節(jié)，具有與非甾體類抗炎藥物（Non-steroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs）類似的抗炎和抗腫瘤活性[3-5]，但其用于OA的效果及作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步明確。本研究以O(shè)A患者關(guān)節(jié)軟骨和正常關(guān)節(jié)軟骨為研究對(duì)象，觀察姜黃素對(duì)OA軟骨細(xì)胞增殖及分泌MMP-13、IL-6的影響，旨在為姜黃素治療該病提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料

選取2018年1～6月在我院骨科接受關(guān)節(jié)置換治療的10例骨關(guān)節(jié)炎患者為研究對(duì)象，均符合OA相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，其中男6例，女4例，年齡52～69歲，平均（62.37±2.56）歲。另選取因外傷致截肢的4例患者作為對(duì)照，其中男2例，女2例，年齡50～68歲，平均（61.24±2.49）歲。所有患者均排除嚴(yán)重心血管疾病、內(nèi)分泌疾病、肝腎疾病、結(jié)締組織疾病或腫瘤疾病患者，于術(shù)中取關(guān)節(jié)軟骨。將炎癥軟骨細(xì)胞（OA組）和正常軟骨細(xì)胞（N組）隨機(jī)分為兩組。兩組患者的性別、年齡等一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 試劑

姜黃素（Sigma公司，貨號(hào)78246-100MG）、MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性測試試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司）、胰蛋白酶-EDTA（GIBCO公司，貨號(hào)25200-056）、胎牛血清（FBS，購自上海雙洳生物科技有限公司，貨號(hào)12657-029）、DMEM/F12（HyClone公司，貨號(hào)SH30023.01B）、酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）MMP-13、IL-6試劑盒（Ray Biotech公司）等。

1.3 方法

1.3.1 軟骨細(xì)胞培養(yǎng) ?于無菌條件下取關(guān)節(jié)軟骨，以磷酸緩沖鹽溶液漂洗，剪切成碎塊（1 mm3），加入含DMEM全培養(yǎng)基的0.2%Ⅱ型膠原酶，消化約16 h，以200目濾網(wǎng)收集軟骨細(xì)胞，經(jīng)洗滌、離心處理后棄上清液，重復(fù)操作3次。細(xì)胞和全培養(yǎng)基裝入細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置入培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2飽和濕度）培養(yǎng)，3 d換液1次。待細(xì)胞貼壁生長、基質(zhì)分泌連接成單層時(shí)給予1∶2傳代培養(yǎng)，選取2～3代軟骨細(xì)胞。將炎癥軟骨細(xì)胞設(shè)為炎癥軟骨細(xì)胞組（OA組），按是否加入姜黃素分為單純培養(yǎng)基組（OAa組）與加入姜黃素組（OAb組）;將正常膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞設(shè)為正常軟骨細(xì)胞組（N組），按是否加入姜黃素分為單純培養(yǎng)基組（Na組）與加入姜黃素組（Nb組）。

1.3.2 姜黃素溶液配制及刺激軟骨細(xì)胞 ?以DMSO配制500 mol/L貯存溶液，在121℃條件下高壓滅菌20 min，分裝并于-20℃下保存，本實(shí)驗(yàn)中所用溶液以含10%FBS DMEM配置1000 μmol/L。將培養(yǎng)軟骨細(xì)胞（1×107/L，100 μL）接種于96孔板中，接種24 h，細(xì)胞貼壁后吸去培養(yǎng)液。加入終質(zhì)量濃度為80 μmol/L的姜黃素溶液，每孔100 μL，各組均6復(fù)孔，以未加入姜黃素的培養(yǎng)基作為對(duì)照，持續(xù)培養(yǎng)24 h后待檢。

1.3.3 MTT實(shí)驗(yàn) ?細(xì)胞培養(yǎng)后按MTT細(xì)胞增殖與細(xì)胞毒性檢測試劑盒操作說明進(jìn)行檢測，方法如下：在軟骨細(xì)胞培養(yǎng)孔中加入MTT10 μL，37℃條件下孵育4 h后加入Formazan溶解液100 μL，室溫下震蕩10 min，測定吸光度值、波長（測定為570 nm），以4孔吸光度值±標(biāo)準(zhǔn)差表示結(jié)果，抑制率=（1-A/B）×100%，A：給藥孔平均吸光度值，B：對(duì)照孔平均吸光度值。

1.3.4 ELISA實(shí)驗(yàn) ?對(duì)上述上清液嚴(yán)格按試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）說明書進(jìn)行檢測，測定上清液中MMP-13、IL-6水平，于相同條件下重復(fù)進(jìn)行3次檢測，于450 nm波長下以酶標(biāo)儀測定吸光度值，計(jì)算結(jié)果并做對(duì)比分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料（吸光度值、MMP-13、IL-6水平等）用（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，多組間、組間比較分別行ANOVA、LSD檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組軟骨細(xì)胞增殖抑制情況比較

OAb組吸光度值明顯低于OAa組（P<0.05），Nb組吸光度值較Na組下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.316，P=0.082>0.05）。80 μmol/L的姜黃素對(duì)OA軟骨細(xì)胞和正常軟骨細(xì)胞均有一定程度的抑制作用。見表1。

2.2 各組上清液MMP-13、IL-6水平比較

OAb組上清液MMP-13、IL-6水平均低于OAa組（P<0.05）;OA組MMP-13、IL-6水平均高于N組（P<0.05）。見表2。

3 討論

目前，骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，關(guān)節(jié)軟骨是該病發(fā)病早期最主要的侵犯部位，其自我修復(fù)能力有限，受破壞后很難徹底恢復(fù)。軟骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)唯一能分泌軟骨基質(zhì)的細(xì)胞，關(guān)節(jié)內(nèi)環(huán)境變化后軟骨細(xì)胞會(huì)識(shí)別并應(yīng)答，進(jìn)而分解、合成細(xì)胞外基質(zhì)，以維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[7-8]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究顯示[9-10]，在骨關(guān)節(jié)生長及損傷修復(fù)過程中Wnt/β-catenin通路發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其激活和抑制對(duì)軟骨細(xì)胞等多種細(xì)胞的分化、增殖有重要影響，且與軟骨活力密切相關(guān)。

中醫(yī)古籍中并無“骨關(guān)節(jié)炎”這一病名，該病與“鶴膝風(fēng)”“膝痛”“骨極”“筋傷”等病名類似，但病因、病情及癥狀并不一致。中醫(yī)學(xué)將骨關(guān)節(jié)炎納入“痹證”范疇，也有部分學(xué)者認(rèn)為與“痿證”相關(guān)[11]。中醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為負(fù)重、外傷、風(fēng)寒濕等六淫病邪是引發(fā)骨關(guān)節(jié)炎的外因，中老年人體弱多病、氣血已衰、正氣薄弱，因而會(huì)加大骨關(guān)節(jié)炎的患病風(fēng)險(xiǎn)[12-13]。目前，研究證實(shí)傳統(tǒng)中醫(yī)藥在關(guān)節(jié)軟骨缺損及損傷修復(fù)中有重要應(yīng)用價(jià)值，且中藥復(fù)方治療骨關(guān)節(jié)炎確有理想療效[14]，近年來的基礎(chǔ)研究亦指出部分可用于痹證治療的中藥能促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖分化。

姜黃是一種芭蕉目姜科植物，其味辛、溫，無毒，具有破瘀行氣、通經(jīng)止痛之效，主治心腹痞滿脹痛、婦女血瘀經(jīng)閉、風(fēng)濕痹痛等，尤適用于除痹痛[15]。姜黃素是姜黃的主要化學(xué)提取物，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)姜黃素有抗氧化、抗炎、抑菌、抗凝、降壓和抗癌等多種作用，能強(qiáng)力抑制炎癥反應(yīng)與代謝遞質(zhì)活性，抗炎作用顯著，并有保護(hù)OA關(guān)節(jié)軟骨等作用[16]。有研究顯示，40 μmol/L及以上濃度的姜黃素溶液具有明顯抑制OA軟骨細(xì)胞增殖的效應(yīng)，80 μmol/L及以上濃度的姜黃素溶液對(duì)骨關(guān)節(jié)炎和正常軟骨細(xì)胞均有抑制其增殖的作用[17]。本研究顯示加入80 μmol/L濃度的姜黃素溶液后對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞增殖有抑制作用。姜黃素能通過抑制NF-kB及相關(guān)調(diào)節(jié)基因表達(dá)抑制部分細(xì)胞的生存與增殖基因，發(fā)揮抑制多種細(xì)胞增殖的作用，并可通過阻滯細(xì)胞周期抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡[18]?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是一種促使軟骨細(xì)胞外基質(zhì)降解的主要酶系，能發(fā)揮降解蛋白聚糖及膠原、抑制細(xì)胞外基質(zhì)修復(fù)等作用，與OA關(guān)節(jié)軟骨退變密切相關(guān)[19]。MMP-13是一種目前最有效的Ⅱ型膠原纖維降解酶，能降解軟骨基質(zhì)中的Ⅱ型膠原，在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展過程中扮演重要角色。IL-6是一種可趨化大量炎性細(xì)胞進(jìn)入關(guān)節(jié)滑液的重要細(xì)胞因子，在很大程度上會(huì)增強(qiáng)炎癥反應(yīng)，刺激并擴(kuò)大白細(xì)胞介素-1（IL-1）等細(xì)胞因子的炎癥作用，抑制蛋白多糖合成，導(dǎo)致軟骨退化加劇，是影響OA發(fā)病、進(jìn)展的重要因素[20]。本研究結(jié)果顯示，OA軟骨細(xì)胞上清液MMP-13、IL-6水平較正常軟骨明顯增高，提示其可能參與了OA的炎癥損傷及軟骨退變，加入姜黃素溶液后上述指標(biāo)均明顯下降，表明姜黃素有顯著的抗炎和抗降解作用，對(duì)軟骨細(xì)胞可發(fā)揮保護(hù)作用，與既往研究結(jié)論一致[9]。

綜上所述，姜黃素可抑制骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞增殖，并有抗炎、抗降解等多種作用，可保護(hù)軟骨細(xì)胞，其機(jī)制可能與姜黃素能參與激活Wnt/β-catenin中Wnt、β-catenin關(guān)鍵蛋白有關(guān)，上述作用機(jī)制以及何種濃度姜黃素促增效果相對(duì)最佳仍有待進(jìn)一步深入研究。

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（收稿日期：2019-10-10）