劉克強(qiáng)，姜晶晶，馬靜波，譚健，丁萌萌，張衛(wèi)強(qiáng)，裴迎新，趙京

解放軍總醫(yī)院 a.第七醫(yī)學(xué)中心胸外科，北京 100700；b.京西醫(yī)療區(qū)廂紅旗門診部，北京 100091

肺癌是常見腫瘤之一，是癌癥相關(guān)死亡的主要原因，發(fā)病率和死亡率均居首位[1]。研究表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）能夠轉(zhuǎn)移到腫瘤組織[2]，并通過外泌體的形式影響腫瘤組織的發(fā)生發(fā)展[3-5]。外泌體是30～150 nm大小，由膜包被的囊泡，可以運(yùn)輸?shù)鞍踪|(zhì)、脂質(zhì)和核酸等物質(zhì)到受體細(xì)胞。最近，BMSCs外泌體已被證明可將功能性RNA轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，特別是，外泌體可以攜帶參與癌細(xì)胞增殖、分化和凋亡的microRNA（miRNA）[6-7]，且外泌體中的特異性miRNA水平升高與癌癥進(jìn)展有關(guān)[8-10]，如BMSCs來源的外泌體miR-126-3p通過調(diào)控ADAM9的表達(dá)抑制胰腺癌的進(jìn)展[11]。miR-190a-5p在各類型癌癥中的作用鮮見探究，通過靶基因預(yù)測(cè)軟件發(fā)現(xiàn)Krüppel樣因子15（Krüppel-like factor15，KLF15）可 能 是 miR-190a-5p的靶基因。已知KLF15是KLFs家族中的一種轉(zhuǎn)錄因子，在多種類型的癌癥，如肺癌[12-13]、胃癌[14]等中發(fā)揮功能，抑制KLF15表達(dá)會(huì)促進(jìn)腫瘤發(fā)生[15-16]。因此，本研究探究了miR-190a-5p在肺癌細(xì)胞、BMSCs及其外泌體中的含量差異，以及BMSCs外泌體miR-190a-5p對(duì)肺癌細(xì)胞KLF15的表達(dá)調(diào)控，繼而探討對(duì)肺癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

肺癌細(xì)胞系 A549、LK79、H1975和 HCC827，人正常上皮細(xì)胞BEAS-2B購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫；人BMSCs購自廣州吉妮歐生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基、TRIzol試劑、Super-ScriptⅡ逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒及SYBR Green Master Mix購自Thermo Fisher Scientific公司；CD63、CD9、HSP70、KLF15及 GAPDH 抗體購自Abcam公司；All-in-one miRNA qRT-PCR檢測(cè)試劑盒購自GeneCopoeia公司；LipofectAMINE 2000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司；雙螢光素酶報(bào)告試劑盒購自Promega公司；PVDF膜購自Millipore公司；Transwell小室購自BD公司；化學(xué)顯色劑購自Bio-Rad公司；透射電子顯微鏡為日立公司產(chǎn)品。

1.2 外泌體的分離與鑒定

待BMSCs生長(zhǎng)融合至80%后，用PBS漂洗，再放至含有無外泌體胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d。采用超速離心法提取外泌體[11]，首先收集細(xì)胞培養(yǎng)液，500 r/min離心12 min去除細(xì)胞，然后5000 r/min離心30 min去除細(xì)胞碎片。將上清液通過220 nm濾膜過濾，過濾后的濾液低溫超速離心2 h，取沉淀并溶解在PBS中以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。用透射電鏡觀察外泌體形態(tài)。取1 mL外泌體重懸液，用Nanosight NS300分析儀檢測(cè)外泌體粒徑分布，并采用蛋白印跡法檢測(cè)外泌體特異性標(biāo)志蛋白CD63、CD9及HSP70[17]以鑒定外泌體。

1.3 外泌體處理細(xì)胞

處理前24 h將肺癌細(xì)胞植入6孔板，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)融合至70%時(shí)，將200 μL外泌體直接添加到6孔板中，與細(xì)胞共孵育48 h，對(duì)照組加入PBS，最后收集細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[18]。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染前24 h將肺癌細(xì)胞接種于6孔板（2×105/孔），當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)60%～80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，按照說明書使用LipofectAMINE2000轉(zhuǎn)染10 nmol/L miR-190a-5p mimics［5'-UGAUAUGUUU GAUAUAUUAGGU-3'（sense鏈）］、miR-190a-5p inhibitor［5'-ACCUAAUAUAUCAAACAUAUCA-3'（sense鏈）］。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）

TRIzol法提取總RNA，然后采用Super-ScriptⅡ逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒對(duì)RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，采用SYBR GreenMasterMix進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)KLF15的相對(duì)含量，以GAPDH為內(nèi)參。利用Allin-one miRNA qRT-PCR檢測(cè)試劑盒檢測(cè)miR-190a-5p 的表達(dá)，以 U6 為內(nèi)參。通過 2-ΔΔCt方法將基因表達(dá)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。各基因qRT-PCR引物序列見表1。

1.6 雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)

將肺癌細(xì)胞接種于24孔板，24 h后與KLF15野生型或突變型的螢光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒、miR-190a-5p模擬物或?qū)φ展厕D(zhuǎn)染，24 h后收集細(xì)胞，用雙螢光素酶報(bào)告試劑盒分析各組細(xì)胞的發(fā)光值，每組3個(gè)重復(fù)。

表1 qRT-PCR引物及序列

圖1 BMSCs外泌體鑒定

1.7 蛋白印跡法分析

經(jīng)含蛋白酶抑制劑的裂解液裂解后，11 000 r/min離心20 min，取上清加入變性緩沖液混勻，沸水浴5 min。變性蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE分離后電轉(zhuǎn)到PVDF膜上，用PBST配制5%的脫脂牛奶封閉，隨后加入一抗（1∶10 000）于4℃孵育過夜，TBST清洗后，用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶5000）孵育1 h。在膜上加入化學(xué)顯色劑，反應(yīng)5 min，放置在凝膠顯影儀中曝光成像。

1.8 細(xì)胞遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)

Transwell法檢測(cè)細(xì)胞遷移。將Transwell小室放入24孔板中，上室加入2×105細(xì)胞，下室加入細(xì)胞遷移趨化物500 μL培養(yǎng)基，每組3個(gè)重復(fù)，在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)48 h后取出小室，DPAI染色，顯微鏡觀察，拍照，計(jì)數(shù)。

Transwell侵襲試驗(yàn)是將稀釋后的Matrigel基質(zhì)凝膠加到上室，其余步驟與Transwell遷移實(shí)驗(yàn)相同。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用GraphPad Prism 7進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以x±s表示，經(jīng)S-W檢驗(yàn)均符合正態(tài)分布。2獨(dú)立組均值間差異采用t檢驗(yàn)，3組以上的組間比較采用方差分析法（One Way ANOVA），2因素?cái)?shù)據(jù)進(jìn)行2因素檢驗(yàn)分析，組內(nèi)兩兩多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05（雙側(cè)）。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs外泌體鑒定

如圖1，BMSCs外泌體多呈圓形，納米顆粒示蹤分析（nanoparticle tracking analysis，NTA）表明顆粒直徑多介于100～200 nm。以提取外泌體過程中得到的細(xì)胞碎片為對(duì)照，蛋白印跡法檢測(cè)外泌體表面標(biāo)志物CD63、CD9和HSP70，結(jié)果顯示分離得到的外泌體組中3種標(biāo)志蛋白均表達(dá)。

2.2 miR-190a-5p在BMSCs外泌體中高表達(dá)

圖2A結(jié)果顯示，4種肺癌細(xì)胞A549、LK79、H1975、HCC827中miR-190a-5p相對(duì)表達(dá)量均低于正常肺細(xì)胞BEAS-2B，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而BMSCs中miR-190a-5p相對(duì)表達(dá)量高于肺癌細(xì)胞系和BEAS-2B，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。為了進(jìn)一步檢測(cè)miR-190a-5p是否存在于外泌體中，選取4肺癌細(xì)胞中miR-190a-5p表達(dá)相對(duì)最高的A549外泌體，對(duì)比正常肺細(xì)胞BEAS-2B外泌體和BMSCs外泌體，發(fā)現(xiàn)BMSCs外泌體中miR-190a-5p含量也明顯高于BEAS-2B和肺癌細(xì)胞A549，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2B）。該結(jié)果提示，miR-190a-5p在肺癌細(xì)胞中下調(diào)表達(dá)，而在BMSCs外泌體中高表達(dá)。

2.3 miR-190a-5p靶向調(diào)控KLF15表達(dá)

為了探究miR-190a-5p在肺癌中的作用機(jī)制，我們通過Targetsan預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)KLF15可能是miR-190a-5p的作用靶基因。隨后通過螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在肺癌細(xì)胞LK79和H1975中過表達(dá)miR-190a-5p均抑制了野生型KLF15 3'UTR螢光素酶活性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是對(duì)突變型KLF15 3'UTR卻沒有影響。進(jìn)一步檢測(cè)miR-190a-5p對(duì)KLF15表達(dá)的影響發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-190a-5p降低了肺癌細(xì)胞中KLF15的mRNA和蛋白表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。該結(jié)果提示，miR-190a-5p可能通過靶向調(diào)控KLF15的表達(dá)，從而影響肺癌進(jìn)展。結(jié)果見圖3。

圖2 miR-190a-5p在細(xì)胞及其外泌體中的表達(dá)

2.4 KLF15促進(jìn)肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲

為了探究KLF15在肺癌細(xì)胞中的功能，將shKLF15分別轉(zhuǎn)染肺癌細(xì)胞LK79和H1975，肺癌細(xì)胞中KLF15的蛋白表達(dá)被抑制。Transwell結(jié)果顯示，敲低KLF15抑制了肺癌細(xì)胞LK79和H1975的遷移和侵襲，也說明KLF15能夠促進(jìn)肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲（圖4）。

2.5 BMSCs外泌體miR-190a-5p抑制肺癌細(xì)胞遷移和侵襲

圖5結(jié)果顯示，BMSCs外泌體和miR-190a-5p mimics均使肺癌細(xì)胞中miR-190a-5p含量升高，抑制了KLF15的mRNA和蛋白表達(dá)，肺癌細(xì)胞遷移和侵襲細(xì)胞胞數(shù)量減少；而miR-190a-5p inhibitor能夠減弱BMSCs外泌體miR-190a-5p對(duì)KLF15表達(dá)和對(duì)肺癌細(xì)胞遷移侵襲的的抑制作用。該結(jié)果提示BMSCs外泌體miR-190a-5p能夠通過提高肺癌細(xì)胞中的miR-190a-5p含量，抑制KLF15表達(dá)，從而抑制肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。

3 討論

作為發(fā)生率和死亡率均是世界第一的肺癌，其整體5年生存率低于18%，因此，探究肺癌新的診斷治療策略仍至關(guān)重要。研究表明，BMSCs能夠轉(zhuǎn)移到腫瘤組織[2]，并通過外泌體的形式影響腫瘤組織的發(fā)生發(fā)展[3-5]。miRNAs因其能夠作為癌癥生物標(biāo)志物，以及與腫瘤發(fā)生、細(xì)胞增殖、分化和凋亡等多種生理和病理發(fā)展密切相關(guān)而備受關(guān)注[7,19-22]。本研究明確了BMSCs來源的外泌體miR-190a-5p對(duì)肺癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。

圖3 miR-190a-5p靶向調(diào)控KLF15表達(dá)。

圖4 KLF15促進(jìn)肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲

通過starBase在線分析，我們發(fā)現(xiàn)miR-190a-5p在肺癌組織中低表達(dá)，與本研究結(jié)果一致，miR-190a-5p在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)含量低于正常肺細(xì)胞，而在BMSCs中miR-190a-5p表達(dá)含量顯著高于正常肺細(xì)胞，且不同細(xì)胞外泌體中miR-190a-5p的含量檢測(cè)結(jié)果與細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果一致。本研究推測(cè)BMSCs可以通過外泌體的形式運(yùn)輸miR-190a-5p參與肺癌細(xì)胞功能。

但miR-190a-5p影響肺癌細(xì)胞生物學(xué)功能的機(jī)制仍不清楚，因此我們通過Targetscan靶基因預(yù)測(cè)軟件以及螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)證明KLF15是miR-190a-5p的靶基因，miR-190a-5p能夠靶向抑制KLF15的表達(dá)。一些研究表明，KLFs家族成員參與細(xì)胞的多種生物學(xué)功能[23-24]，如細(xì)胞增殖、分化和凋亡。KLF15參與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展，但在不同腫瘤甚至同種腫瘤中的研究結(jié)果也存在差異，如Sun等[14]發(fā)現(xiàn)KLF15通過上調(diào)CDKN1A/p21和CDKN1C/p57的表達(dá)來抑制胃癌細(xì)胞的增殖；Wang等[12]的研究結(jié)果顯示KLF15能夠抑制肺腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)；但也有研究顯示KLF15能夠促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞增殖和遷移[13]。本研究結(jié)果表明KLF15能夠促進(jìn)肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲，且KLF15的表達(dá)受miR-190a-5p靶向調(diào)控。

圖5 BMSCs外泌體miR-190a-5p抑制KLF15的表達(dá)并促進(jìn)肺癌細(xì)胞遷移和侵襲

本研究發(fā)現(xiàn)miR-190a-5p在BMSCs外泌體中的含量很高，為了探究BMSCs外泌體miR-190a-5p是否會(huì)影響肺癌細(xì)胞中的miR-190a-5p含量，并參與肺癌細(xì)胞的生物學(xué)功能，因此本研究將BMSCs外泌體與肺癌細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)BMSCs外泌體組與miR-190a-5p mimic組一樣會(huì)使肺癌細(xì)胞中miR-190a-5p含量增加，抑制KLF15表達(dá)，抑制肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲，且miR-190a-5p inhibitor能夠減弱BMSCs外泌體miR-190a-5p對(duì)KLF15表達(dá)和對(duì)肺癌細(xì)胞遷移侵襲的抑制作用。因此，雖然miR-190a-5p在肺癌細(xì)胞中含量較低，但BMSCs外泌體miR-190a-5p可以提高肺癌細(xì)胞中的miR-190a-5p含量，從而抑制KLF15表達(dá)，抑制肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。

綜上所述，BMSCs外泌體miR-190a-5p能夠增加肺癌細(xì)胞中的miR-190a-5p含量，靶向抑制KLF15的表達(dá)，抑制肺癌細(xì)胞遷移和侵襲，為肺癌的診斷和治療提供了新的思路。