丁大連 張建輝 楊琨 蔣海燕 亓衛(wèi)東 時(shí)海波 劉芳 李鵬 Richard Salvi

某些哺乳類動(dòng)物，如：人類或常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物豚鼠，耳蝸感覺上皮和周邊神經(jīng)系統(tǒng)在出生前已經(jīng)基本發(fā)育完善，因而從一出生就具備了基本正常的聽覺反應(yīng)[1，2]，但是大鼠或小鼠的耳蝸在出生時(shí)尚未發(fā)育完全，一般要在出生后15天才開始出現(xiàn)部分聽覺反應(yīng)，在出生后18天以上才開始具備接近正常的聽覺反應(yīng)能力[3，4]；因此，處于嬰幼兒階段的大鼠或小鼠或許更適合于研究聽覺的發(fā)生和耳蝸的后期發(fā)育過程。

耳蝸與中樞的神經(jīng)聯(lián)系包含著傳入和傳出兩個(gè)系統(tǒng)，其中傳入神經(jīng)系統(tǒng)是將耳蝸內(nèi)感覺上皮產(chǎn)生的聽覺沖動(dòng)信號(hào)經(jīng)中樞聽覺傳入通路傳送到各級(jí)聽覺中樞直至大腦聽覺皮層被機(jī)體感知，傳出神經(jīng)系統(tǒng)則是位于腦干上橄欖核的由高位聽覺中樞下行纖維調(diào)控的參與維持聽覺敏感度和參與調(diào)控和保護(hù)聽覺器官的耳蝸傳出神經(jīng)元。從耳蝸傳出神經(jīng)元發(fā)出的大部分神經(jīng)纖維下行分布到耳蝸的感覺上皮，少部分傳出神經(jīng)纖維分布到耳蝸核。耳蝸傳出神經(jīng)主要包括調(diào)控外毛細(xì)胞的內(nèi)側(cè)橄欖耳蝸(medial olovocochlear, MOC)和調(diào)控內(nèi)毛細(xì)胞底部傳入神經(jīng)纖維的外側(cè)橄欖耳蝸(lateral olovocochlear system, LOC)兩支不同的傳出神經(jīng)系統(tǒng)[5～7]。傳出神經(jīng)系統(tǒng)通過神經(jīng)遞質(zhì)的釋放使神經(jīng)沖動(dòng)信號(hào)在神經(jīng)元與效應(yīng)器之間或神經(jīng)元與神經(jīng)元之間傳遞，傳出神經(jīng)的受體包含多種神經(jīng)活性物質(zhì)，例如：乙酰膽堿、降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)、r-氨基丁酸(GABA)，多巴胺、腦啡肽及強(qiáng)啡肽等，目前接受膽堿能受體的乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase，AchE)和參與傷害性信息傳遞的CGRP被認(rèn)為是耳蝸內(nèi)傳出神經(jīng)遞質(zhì)的主要受體,因此，AchE和CGRP的組織化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)物被較多地作為耳蝸傳出神經(jīng)末梢的特異性標(biāo)記[8～13]。為了了解耳蝸傳出神經(jīng)在耳蝸后期發(fā)育過程中抵達(dá)耳蝸的確切時(shí)間和AchE及CGRP這兩種耳蝸傳出神經(jīng)末梢標(biāo)記蛋白在耳蝸螺旋器中表達(dá)的異同，本研究觀察了出生后3～15天及出生后4個(gè)月的大鼠耳蝸中AchE和CGRP的時(shí)空分布，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 受試動(dòng)物為出生后0、3、5、7、10、12、15和120天的Sprague Dawley大鼠(Charles River Laboratories, Wilmington, MA)各5只，所有動(dòng)物的使用和飼養(yǎng)程序均按照美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院發(fā)布指南并得到布法羅大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2全耳蝸基底膜取材 所有受試大鼠的顳骨在指定的出生后不同時(shí)間被取出并立刻浸入10%福爾馬林PBS溶液固定3小時(shí)，然后在解剖顯微鏡下常規(guī)分離取出全耳蝸基底膜[10～14]。

1.3免疫組織化學(xué)染色方法 在熒光顯微鏡下觀察耳蝸神經(jīng)纖維及末梢的免疫組織化學(xué)染色方法與先前所采用的方法[12,14]基本相同。應(yīng)用Mouse anti-Tublin抗體標(biāo)記出生后不同時(shí)間大鼠耳蝸的聽神經(jīng)纖維及其神經(jīng)末梢，應(yīng)用Rabbit anti-CGRP抗體標(biāo)記出生后不同時(shí)間大鼠耳蝸傳出神經(jīng)末梢的CGRP，應(yīng)用Mouse anti-AchE抗體標(biāo)記出生后不同時(shí)間大鼠耳蝸傳出神經(jīng)末梢的AchE，同時(shí)應(yīng)用ToPro-3復(fù)染出生后不同時(shí)間大鼠耳蝸基底膜細(xì)胞的細(xì)胞核。用于免疫熒光標(biāo)記的耳蝸基底膜在固定后被取出，經(jīng)PBS漂洗后浸入用含有1% Triton X-100和5%羊血清或驢血清的PBS溶液稀釋100倍的一抗溶液(Mouse anti-Tublin抗體，或Rabbit anti-CGRP抗體，或Mouse anti-AchE抗體),在4 ℃冰箱中孵育24小時(shí)；然后用PBS溶液充分漂洗樣品后，將樣品浸入用含有1% Triton X-100和5%羊血清或驢血清的PBS溶液稀釋200倍的與一抗和血清相對(duì)應(yīng)的不同熒光標(biāo)記的二抗溶液孵育2小時(shí)，再用ToPro-3染色液標(biāo)記細(xì)胞核30分鐘，最后將基底膜平整鋪放在載玻片上的甘油滴中，蓋上蓋玻片，在共聚焦熒光顯微鏡下，應(yīng)用不同的激發(fā)光分別探測(cè)綠色熒光標(biāo)記的免疫組化產(chǎn)物(λabc/λem=488/520 nm)和紅色熒光標(biāo)記的免疫組化產(chǎn)物(λabc/λem=550/570 nm)以及藍(lán)色熒光標(biāo)記的細(xì)胞核(λabc/λem=642/661 nm)。應(yīng)用Confocal LSM Image Examiner和Adobe Photoshop 5.5軟件對(duì)共聚焦圖像資料進(jìn)行不同圖像層次和不同熒光信號(hào)的采集、合并及處理。

1.4酶組織化學(xué)染色方法 應(yīng)用銅-鉛-硫膽堿染色標(biāo)記技術(shù)顯示AchE的酶組織化學(xué)標(biāo)記方法與先前所采用的方法[10,11,13]相同。有關(guān)AchE的酶組織化學(xué)染色技術(shù)和耳蝸鋪片方法簡(jiǎn)單介紹如下：首先在室溫下將分離取下的耳蝸基底膜浸入到0.1 mol/L醋酸鹽緩沖液(pH6.0)浸泡30分鐘，然后移入到新鮮配制的AchE孵育液[包含5 mg溶于6.5 ml 0.1 mol/L醋酸鹽緩沖液(pH6.0)的碘化乙酰硫膽堿，0.5 ml 0.1 mol/L枸櫞酸鈉溶液、1 ml 30 mmol/L硫酸銅溶液、1 ml雙蒸餾水，1 ml 5 mmol/L鐵氰化鉀溶液]溫育30分鐘，用0.1 mol/L醋酸鹽緩沖液(pH6.0)漂洗基底膜樣品三次后移入1%硫化銨溶液顯色1分鐘；然后用0.1 mol/L硝酸鈉溶液漂洗五次，再將樣品浸入0.1%硝酸銀溶液1分鐘；經(jīng)0.1 mol/L硝酸鈉溶液漂洗1分鐘后再用0.1 mol/L醋酸鹽緩沖液(pH6.0)漂洗1分鐘；最后常規(guī)將耳蝸基底膜鋪放在載玻片上的甘油滴中，蓋上蓋玻片，在普通光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

2 結(jié)果

2.1耳蝸傳入和傳出神經(jīng)纖維在耳蝸基底膜上的時(shí)空分布 應(yīng)用Tublin免疫組織化學(xué)方法顯示的是耳蝸基底膜上所有的傳入和傳出神經(jīng)絲及其末梢的分布，雖然Tublin標(biāo)記并不能區(qū)分這些神經(jīng)纖維到底是傳入神經(jīng)還是傳出神經(jīng)，但是卻可以根據(jù)穿越耳蝸Corti隧道(Corti’s tunnel)的具有耳蝸傳出神經(jīng)隧道螺旋束(tunnel spiral bundle)解剖學(xué)特點(diǎn)的神經(jīng)纖維，來判斷來自內(nèi)側(cè)橄欖耳蝸傳出神經(jīng)系統(tǒng)的隧道放射束開始穿越Corti隧道的確切時(shí)間。結(jié)果顯示，耳蝸傳出神經(jīng)的隧道放射束是在大鼠出生后第七天才穿越耳蝸Corti隧道并與外毛細(xì)胞建立起突觸聯(lián)系(圖1)。

2.2耳蝸基底膜上CGRP的時(shí)空分布 根據(jù)CGRP免疫組織化學(xué)反應(yīng)標(biāo)記結(jié)果，發(fā)現(xiàn)直到出生后第三天，耳蝸基底膜上無CGRP表達(dá)(圖2a、2b)；然而，在大鼠出生后第五天開始CGRP出現(xiàn)在內(nèi)毛細(xì)胞周圍和底部(圖2c)，并且這種特異性表達(dá)在耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞周圍的CGRP將保持終生(圖2d～h)。但是值得特別注意的是，在耳蝸傳出神經(jīng)內(nèi)側(cè)螺旋束的神經(jīng)纖維并未見CGRP表達(dá)，在耳蝸傳出神經(jīng)上隧道放射束的神經(jīng)纖維和末梢也未見CGRP表達(dá)(圖2c～h)。

2.3耳蝸基底膜上AchE的時(shí)空分布 根據(jù)AchE熒光免疫組織化學(xué)反應(yīng)標(biāo)記結(jié)果，直到大鼠出生后第五天AchE尚未進(jìn)入Corti器(圖3a～c);然而，在大鼠出生后第七天AchE卻已經(jīng)同時(shí)出現(xiàn)在耳蝸傳出神經(jīng)內(nèi)側(cè)螺旋束和隧道螺旋束的神經(jīng)纖維和末梢(圖3d～h)；應(yīng)用銅-鉛-硫膽堿染色標(biāo)記AchE的酶組織化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)物在普通光學(xué)顯微鏡下顯示相同結(jié)果(圖4a～h)。

2.4耳蝸基底膜切片上的CGRP和AchE雙重標(biāo)記 為了更好證明CGRP和AchE在耳蝸Corti器的表達(dá)部位和出現(xiàn)時(shí)間都不相同，除了上述耳蝸基底膜單個(gè)蛋白標(biāo)記的表面制備鋪片結(jié)果之外，還應(yīng)用CGRP和AchE雙重免疫組織化學(xué)方法同時(shí)顯示大鼠耳蝸基底膜上耳蝸傳出神經(jīng)的CGRP和AchE，并從耳蝸基底膜切片的角度再次證實(shí)CGRP和AchE在大鼠耳蝸基底膜上的表達(dá)位置和表達(dá)時(shí)間完全不同(圖5)。值得注意的是，如果在內(nèi)毛細(xì)胞底部的CGRP和AchE定位完全相同，表達(dá)綠色熒光信號(hào)的CGRP和表達(dá)紅色熒光信號(hào)的AchE在重疊部位顯示成黃色熒光信號(hào)；但是如果兩種蛋白的表達(dá)位置不相同，則綠色熒光信號(hào)和紅色熒光信號(hào)不會(huì)重疊成黃色。從圖5d～h都可以看出，綠色熒光信號(hào)與紅色熒光信號(hào)并未重疊，提示CGRP和AchE在內(nèi)毛細(xì)胞底部?jī)?nèi)側(cè)螺旋束的表達(dá)可能并不是在完全相同的部位。

3 討論

3.1耳蝸傳出神經(jīng)抵達(dá)Corti器的時(shí)間晚于傳入神經(jīng)系統(tǒng) 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用Tublin抗體標(biāo)記神經(jīng)絲的免疫組化產(chǎn)物的觀察結(jié)果，可以確定耳蝸I型和II型傳入神經(jīng)纖維及末梢在大鼠出生的時(shí)候已經(jīng)與耳蝸內(nèi)外毛細(xì)胞建立起突觸聯(lián)系，這與以往的觀察結(jié)果[14]相一致。但是由腦干上橄欖核耳蝸傳出神經(jīng)元發(fā)出的耳蝸傳出神經(jīng)隧道螺旋束的神經(jīng)纖維在大鼠出生后第七天才抵達(dá)Corti器。說明耳蝸傳出神經(jīng)纖維末梢與耳蝸毛細(xì)胞之間的突觸聯(lián)系遠(yuǎn)遠(yuǎn)滯后于耳蝸的傳入神經(jīng)系統(tǒng)。

3.2CGRP在耳蝸基底膜上的時(shí)空分布 據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，大鼠耳蝸內(nèi)的CGRP在出生后第四天首先出現(xiàn)在大鼠耳蝸底回傳出神經(jīng)內(nèi)側(cè)螺旋束的神經(jīng)末梢[15,16]，這與本實(shí)驗(yàn)在大鼠出生后第三天未發(fā)現(xiàn)CGRP但是卻在出生后第五天發(fā)現(xiàn)內(nèi)螺旋束神經(jīng)末梢中強(qiáng)烈表達(dá)CGRP的現(xiàn)象相吻合。雖然有文獻(xiàn)報(bào)道CGRP隨后也會(huì)出現(xiàn)在外毛細(xì)胞底部的傳出神經(jīng)末梢[8,9,17]，但是本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)相對(duì)于內(nèi)側(cè)螺旋束神經(jīng)末梢中強(qiáng)烈表達(dá)的CGRP免疫組化產(chǎn)物，出現(xiàn)在外毛細(xì)胞底部的微弱熒光信號(hào)與樣品的背景色相同，因此，認(rèn)為大鼠耳蝸Corti器中的CGRP主要定位在內(nèi)毛細(xì)胞底部?jī)?nèi)側(cè)螺旋束的神經(jīng)末梢，但是既不表達(dá)在傳出神經(jīng)內(nèi)側(cè)螺旋束的神經(jīng)纖維，也不出現(xiàn)在支配外毛細(xì)胞的隧道螺旋束的神經(jīng)纖維及末梢。

CGRP作為神經(jīng)肽的降鈣素肽家族成員之一遍布全身各個(gè)系統(tǒng)，參與調(diào)控機(jī)體各種復(fù)雜的生理功能。CGRP雖然在耳蝸內(nèi)側(cè)螺旋束的傳出神經(jīng)末梢有強(qiáng)烈的表達(dá)，但充其量只能說明出現(xiàn)在耳蝸傳出神經(jīng)內(nèi)側(cè)螺旋束神經(jīng)末梢的CGRP或許只是在這里參與疼痛感受或者參與鈣穩(wěn)態(tài)維持，卻并不一定意味著CGRP可以作為耳蝸傳出神經(jīng)系統(tǒng)特有的獨(dú)特蛋白，因?yàn)镃GRP的表達(dá)畢竟遍及全身各個(gè)器官，而且并沒有特異性表達(dá)在整個(gè)耳蝸傳出神經(jīng)系統(tǒng)。

3.3AchE在耳蝸基底膜上的時(shí)空分布 作為傳出神經(jīng)系統(tǒng)的特異性標(biāo)志酶之一，AchE的功能是將乙酰膽堿分解為膽堿和乙酸以阻止膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)對(duì)突觸后膜的過度興奮作用。Zheng等曾將AchE用于證明耳蝸傳出神經(jīng)切除手術(shù)的成功與否，當(dāng)耳蝸傳出神經(jīng)隨著前庭下神經(jīng)被成功切除而消失之后，耳蝸內(nèi)的AchE不復(fù)存在[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果再次證實(shí)大鼠耳蝸內(nèi)的AchE遍布調(diào)控內(nèi)毛細(xì)胞底部傳入神經(jīng)纖維的外側(cè)橄欖耳蝸傳出神經(jīng)纖維及其末梢和調(diào)控外毛細(xì)胞的內(nèi)側(cè)橄欖耳蝸傳出神經(jīng)纖維及其末梢，這顯然與僅僅表達(dá)在內(nèi)側(cè)螺旋束神經(jīng)末梢的CGRP完全不同。從這個(gè)現(xiàn)象可以看出，雖然AchE和CGRP都被認(rèn)為是耳蝸傳出神經(jīng)的標(biāo)志性蛋白質(zhì)，但是前者表達(dá)在所有傳出神經(jīng)的細(xì)胞體和神經(jīng)纖維及其末梢，而后者僅僅出現(xiàn)在耳蝸傳出神經(jīng)內(nèi)側(cè)螺旋束的神經(jīng)末梢。如此看來，標(biāo)記AchE顯然更有利于顯示全耳蝸的傳出神經(jīng)系統(tǒng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，無論應(yīng)用銅-鉛-硫膽堿的酶組織化學(xué)染色技術(shù)還是應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法標(biāo)記AchE，都使我們有可能準(zhǔn)確判斷耳蝸傳出神經(jīng)纖維在出生后何時(shí)入住到大鼠耳蝸Corti器。本研究發(fā)現(xiàn)AchE標(biāo)記的耳蝸傳出神經(jīng)纖維在大鼠出生后第五天尚未抵達(dá)Corti器，直到出生后第七天才在基底膜上同時(shí)形成內(nèi)毛細(xì)胞下方的內(nèi)側(cè)螺旋束和穿越Corti隧道與外毛細(xì)胞建立突觸聯(lián)系的隧道螺旋束，可見出生后第六天很可能是耳蝸傳出神經(jīng)開始進(jìn)入大鼠耳蝸基底膜的關(guān)鍵時(shí)刻。至于耳蝸傳出神經(jīng)纖維中AchE的表達(dá)會(huì)不會(huì)有可能稍許滯后于神經(jīng)絲結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)，根據(jù)本研究顯示穿越Corti隧道的呈典型放射狀排布的隧道螺旋束傳出神經(jīng)纖維解剖學(xué)特征(圖1d～h，圖3d～h，圖4d～h)，可以確定大鼠耳蝸傳出神經(jīng)在出生后第五天之前確實(shí)沒有抵達(dá)Corti隧道，而AchE的表達(dá)位置與耳蝸傳出神經(jīng)纖維及其末梢的位置完全相同。

3.4傳出神經(jīng)纖維趨向性生長(zhǎng)的引導(dǎo)信號(hào) 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CGRP在大鼠出生后第五天已經(jīng)出現(xiàn)在內(nèi)毛細(xì)胞的下方，而AchE標(biāo)記的耳蝸傳出神經(jīng)纖維在大鼠出生后第七天才在基底膜上形成內(nèi)側(cè)螺旋束和隧道螺旋束并與內(nèi)毛細(xì)胞底部的I型傳入神經(jīng)纖維和外毛細(xì)胞的細(xì)胞體建立起突觸聯(lián)系，說明CGRP蛋白在耳蝸傳出神經(jīng)纖維進(jìn)入耳蝸Corti器的前兩天就已經(jīng)提前出現(xiàn)在內(nèi)毛細(xì)胞的下方。既然用AchE標(biāo)記的具備膽堿能受體的耳蝸傳出神經(jīng)纖維在大鼠出生后第七天之前尚未抵達(dá)耳蝸基底膜，說明預(yù)先出現(xiàn)在內(nèi)毛細(xì)胞下方的CGRP并不是伴隨著耳蝸傳出神經(jīng)末梢在Corti器的就位才開始出現(xiàn)，由此引出一系列需要思考的問題，那就是CGRP到底是不是來源于耳蝸傳出神經(jīng)系統(tǒng)？預(yù)先出現(xiàn)在內(nèi)毛細(xì)胞下方的CGRP會(huì)不會(huì)只是一種由內(nèi)毛細(xì)胞或與內(nèi)毛細(xì)胞相聯(lián)系的I型傳入神經(jīng)末梢釋放的誘導(dǎo)內(nèi)側(cè)螺旋束耳蝸傳出神經(jīng)纖維的引導(dǎo)信號(hào)？這是值得深入思考和探索的下一步研究課題。在神經(jīng)纖維生長(zhǎng)的過程中，位于軸突生長(zhǎng)尖端的生長(zhǎng)錐具有“嗅探”引導(dǎo)信號(hào)的能力，從而使神經(jīng)纖維的生長(zhǎng)方向遵循著精確路徑找到靶目標(biāo)并與之建立起精準(zhǔn)的突觸聯(lián)系。例如，內(nèi)耳感覺毛細(xì)胞在胚胎期與傳入神經(jīng)建立聯(lián)系的分化發(fā)育過程，既要依賴于毛細(xì)胞分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的吸引，同時(shí)，也要依賴于神經(jīng)節(jié)對(duì)假?gòu)?fù)層上皮的引導(dǎo)信號(hào)[18]，而耳蝸傳出神經(jīng)在尋找靶目標(biāo)的過程可能同樣離不開分化中Corti器細(xì)胞釋放出的諸如鈣離子或乙酰膽堿類物質(zhì)的引導(dǎo)信號(hào)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，出生后當(dāng)天的大鼠耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞就已經(jīng)表現(xiàn)出膽堿能傳出輸入的生理學(xué)反應(yīng)[19]。鑒于從腦干上橄欖核耳蝸傳出神經(jīng)元發(fā)出的傳出神經(jīng)纖維此時(shí)尚未進(jìn)入到耳蝸Corti器，那么這些最早出現(xiàn)在內(nèi)毛細(xì)胞的乙酰膽堿很可能并不是由耳蝸傳出神經(jīng)釋放，而是由處于早期分化發(fā)育過程中的內(nèi)毛細(xì)胞釋放并成為一種引導(dǎo)耳蝸膽堿能傳出神經(jīng)纖維生長(zhǎng)方向的引導(dǎo)信號(hào)。除了內(nèi)毛細(xì)胞之外，分化發(fā)育中的耳蝸支持細(xì)胞也可能參與了對(duì)神經(jīng)突觸發(fā)生的引導(dǎo)和調(diào)控作用，例如：在耳蝸的早期分化過程中，位于內(nèi)側(cè)螺旋溝的Kolliker 細(xì)胞及內(nèi)毛細(xì)胞周圍的支持細(xì)胞在釋放ATP的過程中通過激活內(nèi)毛細(xì)胞內(nèi)的嘌呤能受體而導(dǎo)致了鈣離子的釋放[20]。鑒于CGRP的功能與鈣的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)有關(guān)，其表達(dá)可能會(huì)趨向于鈣波釋放活躍的靶細(xì)胞；而AchE的功能與乙酰膽堿的降解有關(guān)，其表達(dá)也有可能會(huì)趨向于乙酰膽堿釋放活躍的靶目標(biāo)。如此看來，內(nèi)毛細(xì)胞或位于內(nèi)側(cè)螺旋溝的Kolliker細(xì)胞在早期分化發(fā)育階段釋放出的鈣離子和乙酰膽堿類生物化學(xué)信號(hào)是否有可能成為誘導(dǎo)耳蝸傳出神經(jīng)纖維趨向性生長(zhǎng)的引導(dǎo)信號(hào)，還有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究予以澄清。